Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fluorescens opsving efter Photobleaching af gul fluorescerende proteiner markeret p62 i Aggresome-lignende induceret strukturer

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59288
Automatic Translation
1, 2, 2
1Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

Summary

Vi beskriver en omfattende og praktisk protokol til fluorescens opsving efter photobleaching eksperimenter med levende celler. Selv om protokollen blev brugt til at måle mobilitet af gul fluorescerende proteiner-tagged p62 i aggresome-lignende menneskeskabte strukturer, kan det anvendes til en lang række mikroskopi systemer og fluorescerende proteiner.

Abstract

Fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknik, der kan bruges til at kvantificere protein mobilitet i levende celler. I en typisk FRAP eksperiment, er steady-state fluorescens observeret ved gentagen imaging med lav intensitet laserlys. Efterfølgende, er de fluorescerende molekyler hurtigt og uigenkaldeligt svækket via kort udsættelse for høj intensitet laserlys. Oplysninger om protein mobilitet er opnået ved at overvåge tilbagebetalingen af fluorescens. Vi brugte FRAP for at bestemme p62 i aggresome-lignende menneskeskabte strukturer (ALIS) i murine makrofager mobilitet efter stimulation med LPS (LPS). Fordi mange eksisterende FRAP protokoller er enten ufuldstændige eller komplekse, var vores mål at give en omfattende, praktisk og enkel trinvis protokol for FRAP eksperimenter med levende celler. Her beskriver vi RAW264.7 makrofag Transfektion med gul fluorescerende proteiner-p62 (YFP-p62), induktion af ALIS ved at udsætte celler til LP'ER og en trinvis metode til indsamling af prebleach og postbleach FRAP billeder og data analyse. Endelig vil diskutere vi vigtige faktorer at overveje, når de gennemfører en FRAP eksperiment.

Introduction

Fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknik, der kan bruges til at kvantificere protein dynamics i levende celler,1,2. FRAP popularitet er vokset på grund af den kommercielle udbredelse af laser scanning Konfokal mikroskoper med høj opløsning, hastighed og følsomhed, og en "regnbue" af genetisk kodet fluorescerende proteiner, såsom grøn fluorescerende protein (normal god landbrugspraksis) og gul fluorescerende proteiner (YFP)3. Genetisk kodet fluorescerende proteiner er sammenvoksede til en protein af interesse at tillade subcellulært lokaliseringen af protein af interesse. I en typisk FRAP eksperiment, er steady-state fluorescens i en erhvervelse region af interesse (ROI) i en celle observeret via gentagne billeddannelse af denne ROI med lav intensitet laserlys. Efterfølgende, er de fluorescerende molekyler hurtigt og uigenkaldeligt svækket i en foruddefineret undersæt af erhvervelse ROI, benævnt blegemiddel ROI, ved kortvarig påvirkning for høj intensitet laserlys. Som ny ubleget proteiner genopbygge bleget proteiner over tid, indeholder hastighed og intensitet af fluorescens opsving i blegemiddel ROI oplysninger om protein mobilitet (figur 1)4.

Vores interesse i fastsættelsen af ubiquitin bindende protein p62 (også kendt som sequestosome-1) i aggresome-lignende menneskeskabte strukturer (ALIS) i murine RAW264.7 makrofager mobilitet efter stimulation med LPS (LPS) førte os til at revidere FRAP litteratur. Desværre er mange af de eksisterende FRAP protokoller er ufuldstændig eller overdrevent komplekse5,6,7,8,9. Nogle giver ikke detaljerede oplysninger om laser indstillinger, beam sti konfiguration og image erhvervelse parametre5,6,7,8,9. Andre udeladt vigtige detaljer om dataanalyse, såsom hvordan man kan løse problemet med blegemiddel ROI drift6,9 eller hvordan man beregner vigtigt opsving parametre, herunder mobile brøkdel (Mf), immobile fraktion (Jegf), og halv-time inddrivelse (t½)5,7. Omvendt, andre lagt for meget vægt på komplekse matematiske formler bruges til at beregne Mf, jegfog t1/25,6,8,9. Vores formål er således at levere en omfattende, praktisk og enkel trinvis protokol for FRAP eksperimenter med levende celler.

Protocol

1. RAW264.7 makrofag Transfektion

  1. Kultur 100.000 RAW264.7 celler (Table of Materials) komplet dyrkningsmedium (Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM)) (Table of Materials) indeholdende 4,5 g/L glukose suppleret med 10% føtal bovint serum (Tabel af materialer ) og penicillin/streptomycin (Table of Materials) på ubehandlet 35-mm glas-bund retter (Table of Materials) og placere retterne i en 37 °C/5% CO2 inkubator. Den følgende dag, transfect celler ved hjælp af 1 mg/mL polyethylenimine (PEI) (Tabel af materialer).
  2. Mix 1,5 μg af YFP-p62 med 8 μL af PEI i 166 μL serum-gratis DMEM (base medium uden føtal bovint serum og penicillin/streptomycin).
  3. Lad Transfektion komplekse blandingen sidde ved stuetemperatur i 15 min før tilføjer blandingen i hver tallerken.
  4. Tilføj komplekser til eksisterende medium med celler og rock pladen forsigtigt.
  5. Sted pladen i et 37 ° C /5% CO2 inkubator natten over.
  6. Den følgende morgen, Aspirér medium fra pladen, derefter skylles en gang med komplet medium. Der tilsættes 2 mL af komplet medium til pladen og tillade cellerne til at inddrive indtil næste dag.

2. induktion af ALIS med LPS (LPS)

  1. Den næste dag, Aspirér medium fra pladerne, hvorefter der tilsættes 1 mL af komplette mellemstore indeholdende 10 ng/mL LP'ER (Tabel af materialer). Tillad plader at udruge for 5 h i en 37 °C/5% CO2 inkubator.
  2. Efterbehandling LP'ER Aspirér medium, hvorefter der tilsættes 1 mL af kold, steril Tyrode buffer indeholdende 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukose, 1,5 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2og 10 mM HEPES (pH 7,4) at skylle pladen.
  3. Opsug bufferen, hvorefter der tilsættes 1 mL af kold, steril Tyrode buffer suppleret med 10 μg/mL nocodazole (Tabel af materialer). Tillad plader til inkuberes ved 4 ° C i 15-20 min før FRAP billedbehandling og analyse.
    Bemærk: Brug af Tyrode's buffer som indeholder HEPES som bufferkapacitet sammensatte tillader imaging skal udføres ved stuetemperatur. Nocodazole blev brugt til at falde ALIS bevægelse af mikrotubuli. Næringssubstratet indeholder bikarbonat som en bufferkapacitet sammensatte kræver CO2 til buffer. Ellers vil bikarbonat indeholdt i medium ændringer pH i mangel af CO2.

3. opsætning af Konfokal mikroskop og vælge det pågældende område

  1. Laser udvælgelse og Beam sti konfiguration
    1. Bruge nogen egnet Konfokal mikroskop (Table of Materials) udstyret med AIM eller ZEN (Table of Materials) eller enhver egnet imaging software.
    2. Vælg linjen 514 nm af Argon/2 laser, som YFP har peak excitation på 512 nm og peak emission ved 527 nm. Klik på knappen erhverve , derefter på Laser -knappen. Klik i vinduet Laser kontrol Argon/2 458, 477, 488, 514 nm, klik derefter på knappen Standby . Efter at have ventet ~ 3 min. til laser til at varme op, skal du klikke på knappen på (fig. 2A).
    3. Indstille laser effekt af 514 nm Argon/2 laser linje til 100% (8.6 A). Klik på knappen erhverve , derefter på Laser -knappen. I vinduet Laser, Indtast 100 i feltet Output [%] , og tryk på knappen Enter (fig. 2A).
    4. Sæt fremsendelse af 514 nm Argon/2 laser linje til 5%. Klik på knappen erhverve , derefter knappen kanaler . Klik på knappen kanaler i vinduet Skan kontrol , så klik på den firkantede hvide boks til venstre for teksten 514 nm i kolonnen linje aktiv for at aktivere linjen 514 nm laser. Angiv 5 i feltet Transmission [%] for den 514 nm laser linje (figur 2D).
    5. Sæt den primære dichroic stråledeler (Haupt Farb Teiler (HFT)) til HFT 458/514/561 -positionen, således at disse bands er afbøjes til modellen for excitation. Klik på knappen erhverve , derefter knappen Config . Klik på knappen Channel Mode , derefter knappen Enkelt spor i vinduet Konfiguration kontrol . Klik på knappen HFT og derefter vælge HFT 458/514/561 fra drop-down menu (fig. 2B).
    6. Angiv den første sekundære dichroic beam splitter (Neben Farb Teiler 1 (NFT1)) til spejl holdning, som vil aflede 100% af lys, at den anden sekundære dichroic beam splitter (Neben Farb Teiler 2 (NFT2)). Klik på knappen erhverve , derefter knappen Config . Klik på knappen Channel Mode , derefter knappen Enkelt spor i vinduet Konfiguration kontrol . Klik på knappen NFT1 og derefter vælge spejl fra drop-down menu (fig. 2B).
    7. Sæt den anden sekundære dichroic beam splitter (NFT2) NFT 515 position til at sikre, at bølgelængder < 515 nm vil blive afspejlet og bølgelængder > 515 nm vil blive sendt. Klik på knappen erhverve , derefter knappen Config . Klik på knappen Channel Mode , derefter knappen Enkelt spor i vinduet Konfiguration kontrol . Klik på knappen NFT2 og derefter vælge NFT 515 fra drop-down menu (fig. 2B).
    8. Angive lang pass (LP) emission filter (UDDRIVNINGSFRAKTION) til LP 530, så bølgelængder > 530 nm vil blive fremsendt til photomultiplier tube (PMT, detector). Klik på knappen erhverve , derefter knappen Config . Klik på knappen Channel Mode , derefter knappen Enkelt spor i vinduet Konfiguration kontrol . Klik på knappen Emission filter , derefter vælge LP 530 fra drop-down menu (fig. 2B).
    9. Vælg kanal 3. Klik på knappen erhverve , derefter knappen Config . Klik på knappen Channel Mode , derefter knappen Enkelt spor i vinduet Konfiguration kontrol . Klik på den firkantede hvide boks til venstre for knappen Ch3 .
  2. Billede erhvervelse Set-Up
    1. Vælg Plan-Apochromat 63 x / 1,40 olie mål (Tabel af materialer). Se prøven gennem mikroskop okular og placere ALIS i midten af synsfeltet. Klik på knappen erhverve , derefter knappen Micro . I vinduet Mikroskop , klik på mål, så vælg Plan-Apochromat 63 x / 1,40 olie mål fra drop-down menuen.
    2. Indstille billedstørrelsen til 512 x 512 pixel, scanning hastighed til 8og data dybde til 12 bit. Klik på knappen erhverve , derefter scanne knappen. I vinduet Skan kontrol Klik på Mode -knappen og knappen ramme , og klik derefter på knappen 512 . Indtast 8 i feltet Skan hastighed skal du trykke på Enterog derefter klikke på knappen 12 Bit (figur 2C).
    3. Indstil scan gennemsnit til 1 og den optiske zoom til 3. Klik på knappen erhverve , så klik på knappen Skan . Klik på pil ned knappen i feltet scan gennemsnitlig tal i vinduet Skan kontrol , så vælg 1 fra drop-down menuen. Angiv 3 i feltet optisk zoom, og derefter trykke på Enter (figur 2C).
    4. Indstil pinhole til 1,95 luftige enheder og detektor gevinst til 582 (lige under mætning). Klik på knappen erhverve , derefter scanne knappen. Klik på knappen kanaler i vinduet Skan kontrol , Indtast 196 i feltet Pinhole, så tryk på Enter. Angive 582 i feltet detektor få og derefter trykke på Enter (figur 2D).
    5. Sikre at den 514 nm Argon/2 laser linje er indstillet til 100% strøm (8.6 A). Klik på knappen erhverve , derefter knappen Laser . I menuen Laser kontrol bør værdien i feltet Output [%] 100 (fig. 2A).
    6. Sikre at 514 nm Argon/2 laser linje er sat til 5% transmission. Klik på knappen erhverve , derefter scanne knappen. I vinduet Skan kontrol bør værdien i feltet Transmission [%] for 514 nm laser linje 5 (figur 2D).
    7. Oprette en firkantet ROI (erhvervelse ROI), der har dimensioner 150 x 150 pixels (194.6 µm2). Klik på knappen erhverve , derefter knappen Rediger ROI . I menuen Rediger ROI , klik på ikonet rektangel derefter klikke og trække i billedvinduet til at skabe et kvadrat, der har dimensioner 150 x 150 pixels (194.6 µm2) (fig. 1A).
      Bemærk: Erhvervelse ROI omfatter (a) en ALIS interesse, b et område med fluorescens, der er ikke en ALIS (kontrol ROI) og er mindst 20 x 20 pixel (3,3 µm2) og (c) et område med lidt at ingen fluorescens (baggrund ROI), der er mindst 20 x 20 pixel (3,3 µm 2) (fig. 1A). Det er vigtigt at medtage en kontrol ROI i erhvervelse ROI, så den photobleaching, der kan opstå med gentagne imaging kan kontrolleres. Erhvervelse Investeringsafkast, der er defineret her vil være det eneste område, der skal scannes. Gentagne laser scanning inden anskaffelsen ROI kun vil begrænse photobleaching til ROI snarere end, for eksempel, photobleaching hele cellen eller flere celler, og antallet af pixels indsamlet på ydelse (detektor) vil være større end antallet af pixel indsamlet på ydelse (detektor) efter scanning en hele cellen eller flere celler.
    8. Set-up tidsserien sådan at erhvervelse ROI er scannet 35 gange, når hver 30 s. Klik på knappen erhverve , så knappen Tidsserier . Klik på knappen manuel start serien og knappen Manuel stop serie i vinduet Time serie kontrol . Indtast 35 i feltet manuel stop serie, tryk på Enter , så klik på knappen 30,0 sek cyklus forsinkelse (figur 2E).
    9. Indstille blegemiddel kontrol, sådan at photobleaching vil ske efter scanning nummer 5, til at indsamle 5 prebleach billeder af erhvervelse ROI. Klik på knappen erhverve , derefter knappen Rediger blegemiddel . Klik på den hvide firkant ved siden af den blege efter antal scanningeri vinduet Blegemiddel kontrol . Skrive 5 i scanningen talfelt og derefter trykke på tasten Enter (figur 2F).
      Bemærk: Prebleach og postbleach billeder skal være erhvervet på de samme optiske dybde.
    10. Oprette en cirkulære-formet blegemiddel ROI indenfor ALIS, der har en diameter på 10-pixel (område = 0,8 µm2). Klik erhverve | Redigere blegemiddel | Definere områder. Klik på ikonet cirkel i vinduet Blegemiddel områder . Klikke og trække i billedvinduet til at oprette en cirkel, der har en diameter på 10-pixel (område = 0,8 µm2) (figur 2F).
    11. Angive gentagelser til 300. Klik på knappen erhverve , derefter knappen Rediger blegemiddel . I vinduet Blegemiddel kontrol angiver 300 i feltet gentagelser, så tryk på tasten Enter (figur 2F).
    12. Indstille Argon/2 514-nm laser linje til 100% strøm (8.6 A) og 100% transmission under blegemiddel. Klik på knappen erhverve , derefter knappen Rediger blegemiddel . Klik på den hvide firkant til venstre for i vinduet Blegemiddel kontrol 514 nm. Indtast 100 i feltet Transmission [%] for 514 nm laser linje, så tryk på knappen Enter (figur 2F).
      Bemærk: Antallet af gentagelser skal bestemmes empirisk. Det vil variere afhængigt af fluorophore, størrelsen af den struktur, som vil blive bleget og laser.
  3. Dataindsamling
    1. Start FRAP eksperiment. Indsamle de første 5 prebleach billeder og den første postbleach billede og derefter beregne blegemiddel dybde efter følgende ligning.
      Equation 1
      Hvis blegemiddel dybde er < 90, standse eksperimentet og kassere data, som blegemiddel dybde ikke var tilstrækkelig. Når blegemiddel dybde er ≥90, indsamle data til analyse med en billedbehandling program og et regnearksprogram (Tabel af materialer).
      Bemærk: Når drift af ALIS er ≥3 µm, standse eksperimentet og kassere data, som dette beløb af billede drift ikke kan rettes til ved analyse med billedbehandlingsprogram (Tabel af materialer). Hvornår drift af ALIS er < 3 µm, indsamle data til analyse af data med en billedbehandling program og et regnearksprogram (Tabel af materialer).
    2. Indsamle FRAP data fra 10 ALIS fra 10 celler med mindre end 3 µm af drift af ALIS. Dernæst overføre mål .lsm filer til en personlig computer til dataanalyse.
  4. Analyse af data i en billedbehandling Program
    1. Korrekt for billede drift af justering eller matchende (dvs. registrering) stakken af tidsserier billeder af erhvervelse ROI. For at gøre dette, åbne hver mål .lsm fil med et billede behandlingsprogram (Tabel af materialer), og vælg derefter Plugins | Registrering | StackReg | Oversættelse. Dernæst skal du vælge Plugins | Registrering | StackReg | Kroppen stiv10.
    2. Set-up ROI Manager til at måle signal intensiteten i blegemiddel ROI. Vælg analyser | Værktøjer | ROI Manager. Vælg værktøjet Oval og derefter tegne en cirkel i blegemiddel ROI med en diameter på 10 pixel, så klik på knappen Tilføj .
    3. Set-up ROI Manager til at måle signal intensitet i kontrolelementet ROI. I ROI Manager, Vælg værktøjet rektangel og derefter tegne en firkant på 20 x 20 pixel i regionen kontrol ROI, så klik på knappen Tilføj .
    4. Set-up ROI Manager til at måle signal intensitet i baggrunden ROI. I ROI Manager, Vælg rektangelværktøjet , tegne en firkant på 20 x 20 pixel i regionen baggrund ROI, så klik på knappen Tilføj .
    5. Omdøbe ROIs. Efter tilføjer ROIs analyseres i ROI Manager, omdøbe dem blegemiddel ROI, kontrol ROIog Baggrunden ROI i overensstemmelse hermed.
    6. Foranstaltning signal intensitet i ROIs. Vælg blegemiddel ROI, kontrol ROIog Baggrunden ROI, så vælg mere | Multi foranstaltning. Sikre at måle alle 35 skiver og én række pr. skive er markeret. Sikre at kun betyde grå værdi er markeret i vinduet Sæt målinger .
      Bemærk: Disse er de rå FRAP data (figur 1B).
    7. Indsæt resultaterne i et regnearksprogram (Tabel af materialer). Kopi blegemiddel ROI, styre ROI, og baggrunden ROI signal intensitet resultater og derefter indsætte dem til kolonner mærket Blegemiddel ROI, kontrol ROIog Baggrunden ROI, henholdsvis i et regnearksprogram (Tabel af materialer).
  5. Analyse af data i et regnearksprogram
    1. Baggrund-rette signal intensitet i blegemiddel ROI og kontrol ROI (figur 1A, C). Brug værktøjet Indsæt funktion i et regnearksprogram (Tabel af materialer) til at subtrahere værdierne i kolonnen mærket Baggrund ROI fra værdierne i kolonnen mærket Blegemiddel ROI. Subtrahere værdierne i kolonnen mærket Baggrund ROI fra værdierne i kolonnen mærket Kontrol ROI. Mærke disse nye kolonner Korrigeret blegemiddel ROI og Korrigeret kontrol ROI.
    2. Normalisere signal i blegemiddel ROI baggrundskorrigeret signalet i kontrolelementet ROI (figur 1A, D). Brug funktionen Indsæt i et regnearksprogram (Tabel af materialer) for at opdele værdier i kolonnen mærket Korrigeret blegemiddel ROI af værdierne i kolonnen mærket Korrigeret kontrol ROI. Label denne nye kolonne Normaliseret korrigeret blegemiddel ROI.
    3. Normalisere signal i kolonnen Normaliseret korrigeret blegemiddel ROI til gennemsnittet af de 5 prebleach i blegemiddel ROI (figur 1A, E). Beregne gennemsnittet af de 5 prebleach i blegemiddel ROI. Næste, dividere værdier i kolonnen mærket Normaliseret korrigeret blegemiddel ROI af gennemsnittet af de 5 prebleach i blegemiddel ROI. Label denne nye kolonne Normaliseret korrigeret Prebleach gennemsnitlige blegemiddel ROI.
  6. Mobile fraktion og halv tid af Recovery fra kurve-monteret Data
    1. Kurve-fit normaliserede og korrigerede blegemiddel ROI data ved hjælp af et billede behandlingsprogram (Tabel af materialer). Billedbehandling forarbejdning programmet (Table of Materials), Vælg analyser | Værktøjer | Kurven montering. Kopi af postbleach normaliseret og korrigeret blegemiddel ROI og de tilsvarende Tidsværdier, derefter indsætte dem i vinduet Kurve montør . Vælg Eksponentiel inddrivelse drop-down-menuen Kurve montør , så vælger Tilpas.
    2. Beregne Mf fra parametrene for den opsving funktion, som giver værdier for: 'en,' en langsomt inddrive brøkdel; «b,' genfindingsprocenten; og 'c', et hurtigt spreder brøkdel. Beregn Mf ved at tilslutte de værdier for 'a' og 'c' ind i ligningen Mf = en + c. Beregn det jegf ved hjælp af ligningen jegf = 1 - Mf. Beregn t½ ved at erstatte værdien for 'b' ind i ligningen Equation 2 derefter løse for t1/2. 11

Representative Results

Vist her er resultatet af en typisk eksperiment, hvor vi brugte FRAP for at undersøge graden af mobilitet af p62 i ALIS i RAW264.7 celler behandles med LPS for 3-5 h12. Figur 3 A viser de rå data fra et blegemiddel, styre og baggrund ROI, når stakken af billeder var blevet justeret for at korrigere for små mængder (< ~ 3 µm) billede drift af ALIS. YFP-p62 fluorescens i denne ALIS på prebleach og postbleach er vist i figur 3E og supplerende Video 1. Figur 3 B viser disse data efter baggrund-korrektion. Figur 3 C viser disse data efter korrektion for fluorescens i kontrolelementet ROI. Figur 3 D viser disse data normaliseret til den gennemsnitlige fluorescens af 5 prebleach værdierne i blegemiddel ROI. Grad af blegning var tilstrækkeligt i dette eksperiment (blegemiddel dybde = 91.94). YFP-p62 fluorescens inden for denne ALIS inddrives langsomt, som t1/2 = 128.27 s (2.14 min). YFP-p62 var ikke en meget bærbare protein i dette eksperiment, som Mf = 21.97 og jegf = 78.03.

Figure 1
Figur 1 : Et diagram i en RAW264.7 celle og trin til billedanalyse når FRAP billeder har været justeret for at korrigere for billede drift af ALIS. (A) Diagram af en RAW264.7 celle skildrer flere ALIS og blegemiddel, kontrol og baggrunden ROIs inden for erhvervelse ROI. (B) en idealiseret skildring af rå FRAP oplysninger indhentet i blegemiddel, kontrol og baggrunden ROIs i panelet A. (C) en idealiseret graf af rå FRAP data, der har været baggrund-korrigeret. (D) en idealiseret graf af baggrundskorrigerede FRAP data, der er blevet normaliseret til fluorescens i kontrolelementet ROI. (E) en idealiseret graf af normaliserede og baggrundskorrigeret FRAP data, der er blevet normaliseret til den prebleach fluorescens i blegemiddel ROI. Forkortelser: Con = kontrol; BG = baggrund. Dette tal blev ændret fra Rabut og Ellenberg4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Billeder af brugergrænsefladen i AIM-softwaren (Table of Materials) for laser udvælgelse, fjernlys sti konfiguration og image erhvervelse parametre for FRAP eksperimenter. (A) Laser kontrollere skærmen viser Argon/2 laser linjer, output, og tube nuværende bruges. (B) konfiguration kontrollere skærmen viser beam splitter og emission filter indstillinger, der bruges. (C) Scan kontrollere skærmen viser indstillingen anvendes til billede erhvervelse. (D) Scan kontrollere skærmen viser pinhole, detektor gevinst, forstærker offset, forstærker gevinst og transmission indstillinger for Argon/2 514 nm laser linje. (E) tidsserier kontrollere skærmen viser de tid serien indstillinger anvendes. (F) blegemiddel kontrollere skærmen viser prebleach og postbleach parametre, der anvendes. Forkortelser: HFT = Haupt Farb Teiler (primære dichroic beam splitter); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (første sekundære dichroic beam splitter); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (andet sekundære dichroic beam splitter); EF = emission filter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : En repræsentativ FRAP eksperiment at studere YFP-p62 dynamics i ALIS i RAW264.7 celler. (A) rå fluorescens intensitet data for et blegemiddel, kontrol og baggrunden ROI. (B) oplysningerne i panelet A efter blegemiddel og kontrol ROI havde været korrigeret for fluorescens i baggrunden ROI. (C) oplysningerne i paneler A og B efter normalisering fluorescens-intensiteten i blegemiddel ROI konto til fluorescens i kontrolelementet baggrundskorrigeret ROI. (D) oplysningerne i paneler A-C efter normalisering fluorescens-intensiteten i normaliserede og baggrundskorrigeret blegemiddel ROI til gennemsnittet af de første 5 prebleach værdier i blegemiddel ROI. Mf = 21.97, jegf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2.14 min) og blegemiddel dybde = 91.94. (E) en afbildning af en ALIS på prebleach (1,5 min) og postbleach (0, 6 og 16 min). Skalalinjen = 5 µm og gælder for alle paneler. Forkortelser: Con = kontrol; BG = baggrund; Corr. = korrigeret; Normen. = normaliseret; Gns. = gennemsnit. Dette tal blev ændret fra Cabe et al.12venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Video 1
Supplerende Video 1: en typisk ALIS i en RAW264.7 makrofag før og efter photobleaching. YFP-p62 Fluorescens er langsom til at inddrive efter photobleach; dermed er p62 ikke en meget bærbare protein. For dette eksperiment, Mf = 25.62, jegf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7.38 min) og blegemiddel dybde = 90.19. Skalalinjen = 5 µm. Denne video blev ændret fra Cabe et al.12venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Discussion

Vi leverer en omfattende, praktisk og enkel trinvis protokol for FRAP eksperimenter med levende celler. Heri, protokollen blev brugt til at måle YFP-p62 i ALIS mobilitet i RAW264.7 makrofager, men det kan anvendes til mange af laser scanning Konfokal mikroskop systemer og genetisk kodet fluorescerende proteiner, der er nu tilgængelige. For enhver mikroskopi system er pilotforsøg afgørende for fastlæggelse af de optimale FRAP parametre, herunder erhvervelse, blegemiddel og kontrol ROI størrelser, laser intensitet for photobleaching, og prebleach og postbleach image erhvervelse. Det er rimeligt at forvente de optimale FRAP parametre er forskellige for hver genetisk kodet fluorescerende proteiner og celle linje.

Vigtige faktorer at overveje, hvornår gennemfører en FRAP eksperiment omfatter (a) at opnå egnet blegemiddel dybde, (b) brugen af et kort blegning skridt, (c) giver tilstrækkelig tid postbleach at observere fuld recovery funktion, (d) photobleaching effektivitet, (e). cytotoksicitet med gentagne FRAP, og (f) optagelse af et kontrolelement til fluorescens tab på grund af gentagne billeddannelse. Vi anbefaler, at der blegemiddel dybde, som kan beregnes efter ligning i afsnit 3.3.1, ≥9013. Når blegemiddel dybde er < 90, graden af postbleach fluorescens recovery vil være undervurderet, og værdierne af jegf, Mfog t1/2 vil være forkert. Selv om varigheden og intensiteten af blegemiddel-inducerende laserpulser kan variere mellem FRAP eksperimenter, er det vigtigt, at photobleaching skridt er korte og betydeligt hurtigere end fluorescens opsving funktion. Hvis det ikke er, kunne så en betydelig mængde af fluorescens opsving opstå under trinnet blegning. Med en lang blegemiddel tid, fluorescens opsving under blegning trin ikke vil blive målt, og det ville føre til forkerte målinger af jegf, Mf, ogt1/2. Hertil kommer, at få de korrekte værdier for jegf, Mf, ogt1/2, erhvervelse ROI bør overholdes, postbleach indtil niveauet fluorescens i blegemiddel ROI har nået et plateau. For eksempel, i vores FRAP eksperimenter, der var ingen forskel mellem den jegf, Mfog t1/2 værdier når vi observeret YFP-p62 fluorescens i blegemiddel ROI for 32,2 min postbleach versus hvornår vi observeret YFP-p62 i blegemiddel ROI for 15.1 min postbleach; Derfor konkluderede vi, at funktionen opsving nået et plateau på 15,1 min postbleach12. Med hensyn til photobleaching effektivitet øger photobleaching med kvadratet på den optiske zoom faktor14. Således brug af høj optisk zoom-objektiver er gunstige for hurtig photobleaching men kan resultere i uønskede photobleaching under erhvervelse sidstnævnte kan tages højde for ved imaging en kontrol ROI. Gentagne photobleaching er at undgås, da det kan føre til generation af cytotoksiske reaktive ilt arter (ROS). Men graden af ROS generation på grund af eksponering for en høj intensitet laser er lavere for genetisk kodet fluorescerende proteiner end for kemisk fluorophores (fx fluorescerende antistoffer)15, og ROS genereret er mere tilbøjelige til at reagere inden for den genetisk kodet fluorescerende proteiner end med andre molekyler i celle4. Ud over øget sandsynligheden for generering af cytotoksiske ROS, er gentagne photobleaching skal undgås, da det er svært at kontrollere. Endelig, selv om lavt laser transmission bruges til at erhverve alle ikke-bleach billeder, vil nogle photobleaching altid forekomme, som skal kontrolleres. Mulige kontrol for dette omfatter overvågning fluorescens i et kontrolelement ROI inden for erhvervelse ROI, at opnå kontrol billeder i en nærliggende ubleget celle og udfører kontrol eksperimenter med identiske indstillinger for dem, der anvendes i den photobleaching eksperimenter, men uden photobleaching begivenheden.

Disclosures

Forfatterne har nogen interessekonflikt at videregive.

Acknowledgments

Vi takke Dr. Seth Robia på Loyola University Chicago for hans værdifulde kommentarer på dette håndskrift. Dette arbejde blev støttet af NIH grant 1R01NS073967-01A1 til Joanna C. Bakowska.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone SH30022.01 High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L4391
Nocodazole Sigma M1404
Penicillin-streptomycin solution Corning 30-002-Cl 100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective Carl Zeiss MicroImaging, Inc 4407629904000000
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-1 linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophages ATCC TIB-71
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss MicroImaging, Inc LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  2. Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
  3. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 837-838 (2001).
  4. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2004).
  5. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  6. Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
  7. Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
  8. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
  9. Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
  10. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  11. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  12. Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
  13. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
  14. Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. 549-570 (1995).
  15. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).

Tags

Biologi sag 145 fluorescens opsving efter photobleaching FRAP gul fluorescerende proteiner live celle imaging protein mobilitet murine makrofager p62 sequestosome-1 aggresome
Fluorescens opsving efter Photobleaching af gul fluorescerende proteiner markeret p62 i Aggresome-lignende induceret strukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rademacher, D. J., Cabe, M.,… More

Rademacher, D. J., Cabe, M., Bakowska, J. C. Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures. J. Vis. Exp. (145), e59288, doi:10.3791/59288 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter