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Biology

पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की Photoब्लीचिंग के बाद प्रतिदीप्ति वसूली आक्रामक तरह प्रेरित संरचनाओं में p62 टैग की गईं

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59288
Automatic Translation
1, 2, 2
1Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

Summary

हम लाइव कोशिकाओं के साथ photoब्लीचिंग प्रयोगों के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के लिए एक व्यापक और व्यावहारिक प्रोटोकॉल का वर्णन. हालांकि प्रोटोकॉल में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की गतिशीलता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था-p62 आक्रामक की तरह प्रेरित संरचनाओं में टैग की गईं, यह माइक्रोस्कोपी प्रणालियों और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है ।

Abstract

प्रकाशविरंजन (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन गतिशीलता मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक ठेठ FRAP प्रयोग में, स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति कम तीव्रता लेजर प्रकाश के साथ दोहराया इमेजिंग द्वारा मनाया जाता है । बाद में, फ्लोरोसेंट अणुओं तेजी से और अचल उच्च तीव्रता लेजर प्रकाश के लिए संक्षिप्त जोखिम के माध्यम से बिगड़ रहे हैं । प्रोटीन गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रतिदीप्ति की वसूली की निगरानी के द्वारा प्राप्त की है । हम FRAP उपयोग के लिए आक्रामक में p62 की गतिशीलता का निर्धारण-प्रेरित संरचनाओं (एलिस) की तरह म्यूरिन मैक्रोफेज में लिपोपॉलिसैकेराइड (LPS) के साथ उत्तेजना के बाद । क्योंकि कई मौजूदा FRAP प्रोटोकॉल या तो अधूरा है या जटिल है, हमारा लक्ष्य के लिए एक व्यापक, व्यावहारिक प्रदान किया गया था, और सीधा कदम दर कदम के लिए live कोशिकाओं के साथ FRAP प्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल । यहां, हम पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन-p62 (yfp-p62), एलपीएस के लिए कोशिकाओं को उजागर द्वारा ALIS के प्रेरण, और prebleach और postbleach frap छवियों और डेटा विश्लेषण इकट्ठा करने के लिए एक कदम दर कदम विधि के साथ कच्चे 264.7 मैक्रोफेज अभिकर्मक का वर्णन । अंत में, हम महत्वपूर्ण कारकों पर विचार के लिए जब एक FRAP प्रयोग आयोजित करने पर चर्चा ।

Introduction

प्रकाशविरंजन (frap) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि जीवित कोशिकाओं1,2में प्रोटीन गतिशीलता यों तो करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । frap की लोकप्रियता क्योंकि उच्च संकल्प, गति, और संवेदनशीलता के साथ संनाभि सूक्ष्मदर्शी स्कैनिंग लेजर की व्यापक वाणिज्यिक उपलब्धता की वृद्धि हुई है, और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक "इंद्रधनुष", इस तरह के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP)3. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन ब्याज के एक प्रोटीन के लिए संगलित कर रहे है के लिए ब्याज के प्रोटीन के subcellular स्थानीयकरण के लिए अनुमति देते हैं । एक ठेठ FRAP प्रयोग में, एक सेल के भीतर ब्याज (ROI) के अधिग्रहण क्षेत्र में स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति कम तीव्रता लेजर प्रकाश के साथ कि रॉय की दोहराया इमेजिंग के माध्यम से मनाया जाता है । बाद में, फ्लोरोसेंट अणुओं तेजी से और अचल अधिग्रहण रॉय के एक पूर्वनिर्धारित सबसेट में बिगड़ा, इसके बाद ब्लीच रॉय के रूप में संदर्भित, उच्च तीव्रता लेजर प्रकाश के लिए संक्षिप्त जोखिम द्वारा । के रूप में नए अविरंजित प्रोटीन समय के साथ प्रक्षालित प्रोटीन की भरपाई, गति और ब्लीच रॉय में प्रतिदीप्ति वसूली की तीव्रता प्रोटीन गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करता है (चित्रा 1)4।

बैबैरिन बाध्यकारी प्रोटीन p62 की गतिशीलता का निर्धारण करने में हमारी रुचि (भी sequestosome के रूप में जाना जाता है-1) में आक्रामक की तरह प्रेरित संरचनाओं (एलिस) के साथ उत्तेजना के बाद मुरीन रॉ 264.7 मैक्रोफेज में लाइपोपोलिएसकेराइड (LPS) हमें FRAP की समीक्षा करने के लिए नेतृत्व किया साहित्य. दुर्भाग्य से, मौजूदा frap प्रोटोकॉल के कई अपूर्ण या inordinately5,6,7,8,9जटिल हैं । कुछ लेजर सेटिंग्स, बीम पथ विंयास, और छवि अधिग्रहण पैरामीटर5,6,7,8,9के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान नहीं करते । अंय डेटा विश्लेषण, जैसे ब्लीच रॉय बहाव6,9 या कैसे महत्वपूर्ण वसूली मापदंडों की गणना करने के लिए, मोबाइल अंश (एमएफ), स्थिर अंश सहित की समस्या को संबोधित करने के लिए के बारे में प्रमुख विवरण लोप (If), और पुनर्प्राप्ति का आधा समय (t1/2)5,7. इसके विपरीत, दूसरों के जटिल गणितीय फार्मूले पर बहुत अधिक जोर रखा एमएफ, मैंएफ, और टी1/25,6,8,9की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया । इस प्रकार, हमारे उद्देश्य के लिए एक व्यापक, व्यावहारिक प्रदान करना है, और सीधा कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल के लिए जीना कोशिकाओं के साथ FRAP प्रयोगों के लिए ।

Protocol

1. कच्चा 264.7 मैक्रोफेज ट्रांसफेक्शन

  1. संस्कृति १००,००० कच्चे 264.7 कोशिकाओं (सामग्री की तालिका) में पूर्ण संस्कृति मध्यम (Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (dmem)) (सामग्री की तालिका) युक्त ४.५ g/L ग्लूकोज पूरक के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (सामग्री की तालिका ) और penicillin/streptomycin (सामग्री की तालिका) पर अनुपचारित ३५-mm ग्लास-नीचे व्यंजन (सामग्री की मेज) और एक ३७ डिग्री सेल्सियस में व्यंजन जगह/ अगले दिन, कोशिकाओं transfect 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर पॉलीयलिनीमाइन (PEI) (सामग्री की मेज) का उपयोग कर ।
  2. मिक्स १.५ μg YFP-p62 के 8 μL के साथ सीरम मुक्त DMEM के १६६ μL में (भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन के बिना आधार मध्यम/
  3. एक थाली में मिश्रण जोड़ने के लिए पहले 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए अभिकर्मक जटिल मिश्रण ।
  4. मौजूदा माध्यम में कोशिकाओं के साथ परिसरों जोड़ें और थाली धीरे से रॉक ।
  5. थाली को एक ३७ डिग्री सेल्सियस/5% सह2 इनक् यूबेटर में रात भर लगाएं ।
  6. अगले सुबह, थाली से मध्यम महाप्राण, तो पूरा माध्यम के साथ एक बार कुल्ला । थाली में पूर्ण माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और अगले दिन तक कोशिकाओं को ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं ।

2. लिपोपोलिसैकेराइड (एलपीएस) के साथ एलिस का प्रेरण

  1. अगले दिन, प्लेटों से माध्यम को महाप्राण, फिर 10 एनजी/एमएल एलपीएस (सामग्री की मेज) युक्त पूर्ण माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । प्लेटों को एक ३७ डिग्री सेल्सियस/5% सह2 इनयूबेटर में 5 एच के लिए सेने की अनुमति दें ।
  2. एलपीएस उपचार के बाद, मध्यम महाप्राण, तो ठंड के 1 मिलीलीटर जोड़ने, बाँझ Tyrode बफर १४५ मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी ग्लूकोज, १.५ मिमी CaCl2, १.० मिमी MgCl2, और 10 मिमी hepes (पीएच ७.४) थाली कुल्ला करने के लिए ।
  3. बफर महाप्राण, तो ठंडा, है Tyrode बफर 10 μg/मिलीलीटर nocodazole (सामग्री की मेज) के साथ पूरक के 1 मिलीलीटर जोड़ें । प्लेटों की अनुमति दें FRAP इमेजिंग और विश्लेषण करने से पहले 15-20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    नोट: है Tyrode बफर युक्त के उपयोग के रूप में बफरिंग यौगिक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया जाएगा । नोकोडाज़ोल को माइक्रोट्यूबुलेस द्वारा आलिस आंदोलन को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । संस्कृति माध्यम एक बफरिंग यौगिक सीओ2 बफर करने के लिए की आवश्यकता के रूप में बाइअरबोनेट शामिल हैं । अंयथा, बिसरबोनेट मध्यम परिवर्तन में निहित2सह के अभाव में पीएच ।

3. Confocal माइक्रोस्कोप के सेट अप और ब्याज के क्षेत्र का चयन

  1. लेजर चयन और बीम पथ विंयास
    1. उद्देश्य या ज़ेन सॉफ्टवेयर (सामग्री की मेज) या किसी भी उपयुक्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर से सुसज्जित किसी भी उपयुक्त संनाभि माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका) का प्रयोग करें ।
    2. के रूप में YFP ५१२ एनएम और पीक उत्सर्जन में ५२७ एनएम पर पीक उत्तेजना है, Argon/2 लेजर की ५१४ एनएम लाइन का चयन करें । मोल बटन पर क्लिक करें, फिर लेजर बटन पर क्लिक करें । लेज़र नियंत्रण विंडो में, Argon/2 ४५८, ४७७, ४८८, ५१४ nm क्लिक करें, फिर स्टैंडबाय बटन क्लिक करें । लेजर को गर्म करने के लिए ~ 3 मिनट इंतज़ार कर के बाद, बटन पर क्लिक करें (चित्रा 2ए) ।
    3. ५१४ एनएम Argon/2 लेजर लाइन के लेजर पावर सेट करने के लिए १००% (८.६ A) । मोल बटन पर क्लिक करें, फिर लेजर बटन पर क्लिक करें । लेजर नियंत्रण विंडो में, आउटपुट [%] फ़ील्ड में १०० दर्ज करें, फिर enter बटन दबाएँ (चित्र 2A).
    4. 5% करने के लिए ५१४ एनएम Argon/2 लेजर लाइन के संचरण सेट करें । मोल बटन पर क्लिक करें, फिर चैनलों बटन । स्कैन नियंत्रण विंडो में, चैनल बटन क्लिक करें, उसके बाद ५१४ nm लेजर लाइन को सक्रिय करने के लिए पंक्ति सक्रिय स्तंभ में पाठ ५१४ nm के बाईं ओर चौकोर सफ़ेद बॉक्स क्लिक करें । ५१४ एनएम लेजर लाइन के लिए पारेषण [%] फ़ील्ड में 5 दर्ज करें (चित्र 2D) ।
    5. hft 458/514/561 स्थिति इस तरह कि इन बैंड उत्तेजन के लिए नमूना करने के लिए टकराएगी रहे है करने के लिए प्राथमिक dichroic बीम अलगानेवाला (haupt फारब teiler (hft)) सेट करें । अधिग्रहण बटन क्लिक करें, तो Config बटन । कॉन्फ़िगरेशन नियंत्रण विंडो में, चैनल मोड बटन, फिर सिंगल ट्रैक बटन क्लिक करें । hft बटन क्लिक करें, फिर ड्रॉप-डाउन मेनू से hft 458/514/561 चुनें (चित्र 2B) ।
    6. दर्पण की स्थिति है, जो दूसरे माध्यमिक द्विचरिक बीम अलगानेवाला करने के लिए प्रकाश की १००% ध्यान हटाने (नेबेन फरब teiler 2 (NFT2)) जाएगा करने के लिए पहले माध्यमिक dichroic बीम अलगानेवाला सेट (नेबेन farb टीलर 1 (NFT1)) । अधिग्रहण बटन क्लिक करें, तो Config बटन । कॉन्फ़िगरेशन नियंत्रण विंडो में, चैनल मोड बटन, फिर सिंगल ट्रैक बटन क्लिक करें । NFT1 बटन पर क्लिक करें, फिर ड्रॉप-डाउन मेनू से मिरर चुनें (चित्र 2B).
    7. द्वितीय माध्यमिक द्वि-चक्रीय बीम अलगानेवाला सेट (NFT2) Nft ५१५ स्थिति के लिए सुनिश्चित करने के लिए कि तरंग दैर्ध्य < 515 एनएम परिलक्षित किया जाएगा और तरंग दैर्ध्य > 515 एनएम संचारित किया जाएगा । अधिग्रहण बटन क्लिक करें, तो Config बटन । कॉन्फ़िगरेशन नियंत्रण विंडो में, चैनल मोड बटन, फिर सिंगल ट्रैक बटन क्लिक करें । NFT2 बटन क्लिक करें, फिर ड्रॉप-डाउन मेनू (चित्र 2B) से nft ५१५ चुनें ।
    8. लॉन्ग पास (LP) उत्सर्जन फ़िल्टर (EF) को ५३० LPपर सेट करें, ताकि तरंग दैर्ध्य > 530 एनएम photomultiplier ट्यूब (PMT, डिटेक्टर) को संचारित किया जाएगा । अधिग्रहण बटन क्लिक करें, तो Config बटन । कॉन्फ़िगरेशन नियंत्रण विंडो में, चैनल मोड बटन, फिर सिंगल ट्रैक बटन क्लिक करें । उत्सर्जन फ़िल्टर बटन पर क्लिक करें, फिर ड्रॉप-डाउन मेनू से LP ५३० चुनें (चित्र 2B) ।
    9. चैनल 3का चयन करें । अधिग्रहण बटन क्लिक करें, तो Config बटन । कॉन्फ़िगरेशन नियंत्रण विंडो में, चैनल मोड बटन, फिर सिंगल ट्रैक बटन क्लिक करें । ब्भ्3ी बटन के बाईं ओर स्क्वायर व्हाइट बॉक्स पर क्लिक करें ।
  2. छवि अधिग्रहण सेट अप
    1. योजना का चयन करें-Apochromat 63x/1.40 तेल उद्देश्य (सामग्री की तालिका) । माइक्रोस्कोप नेत्रिका के माध्यम से नमूना देखें और देखने के क्षेत्र के केंद्र में ALIS जगह । मोल बटन पर क्लिक करें, फिर माइक्रो बटन. माइक्रोस्कोप नियंत्रण विंडो में, उद्देश्यपर क्लिक करें, तो योजना का चयन करें-apochromat 63x/1.40 तेल उद्देश्य ड्रॉप-डाउन मेनू से ।
    2. ५१२ x ५१२ पिक्सेल, 8के लिए स्कैन गति, और डेटा गहराई 12 बिटकरने के लिए फ़्रेम का आकार सेट करें । मोल बटन पर क्लिक करें, फिर स्कैन बटन. स्कैन नियंत्रण विंडो में, मोड बटन और फ़्रेम बटन क्लिक करें, फिर ५१२ बटन पर क्लिक करें । दर्ज करें 8 स्कैन गति क्षेत्र में, Enterदबाएँ, फिर 12 बिट बटन पर क्लिक करें (चित्र 2C).
    3. स्कैन औसत सेट करने के लिए 1 और ऑप्टिकल ज़ूम करने के लिए 3। मोल बटन पर क्लिक करें, फिर स्कैन बटन पर क्लिक करें । स्कैन नियंत्रण विंडो में, स्कैन औसत संख्या फ़ील्ड के नीचे तीर बटन क्लिक करें, फिर ड्रॉप-डाउन मेनू से 1 का चयन करे । ऑप्टिकल ज़ूम फ़ील्ड में 3 दर्ज करें, फिर enter दबाएँ (चित्र 2C).
    4. १.९५ Airy इकाइयों और ५८२ को डिटेक्टर लाभ (बस संतृप्ति के नीचे) के लिए पिनहोल सेट करें । मोल बटन पर क्लिक करें, फिर स्कैन बटन. स्कैन नियंत्रण विंडो में, चैनल्स बटन क्लिक करें, १९६ पिनहोल फ़ील्ड में enter, फिर enter दबाएँ । डिटेक्टर गेन फ़ील्ड में ५८२ दर्ज करें, फिर enter दबाएँ (चित्र 2D).
    5. सुनिश्चित करें कि ५१४ एनएम Argon/2 लेजर लाइन के लिए सेट है १००% बिजली (८.६ ए) । अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें, तो लेजर बटन । लेज़र नियंत्रण मेनू में, आउटपुट [%] फ़ील्ड में मान १०० होना चाहिए (चित्र 2A) ।
    6. सुनिश्चित करें कि ५१४ एनएम Argon/2 लेजर लाइन 5% संचरण के लिए सेट है । मोल बटन पर क्लिक करें, फिर स्कैन बटन. स्कैन नियंत्रण विंडो में, ५१४ nm लेज़र लाइन के लिए ट्रांसमिशन [%] फ़ील्ड में मान 5 होना चाहिए (चित्र 2D) ।
    7. एक वर्ग के आकार का रॉय (अधिग्रहण रॉय) है कि आयाम १५० x १५० पिक्सल (१९४.६ μm2) है बनाएं । प्राप्त बटन पर क्लिक करें, फिर रॉय संपादित करें बटन. ROI संपादित करें मेनू में, आयत चिह्न पर क्लिक करें और फिर छवि विंडो में उस वर्ग को बनाने के लिए क्लिक करें और खींचें जिसमें आयाम १५० x १५० पिक्सेल (१९४.६ μm2) है (चित्र 1a) ।
      नोट: अधिग्रहण रॉय शामिल है (क) ब्याज की एक एलिस, (ख) प्रतिदीप्ति का एक क्षेत्र है कि एक एलिस (नियंत्रण रॉय) नहीं है और 20 x 20 पिक्सल (३.३ μm2) है, और (ग) थोड़ा नहीं प्रतिदीप्ति के लिए एक क्षेत्र (पृष्ठभूमि रॉय) है कि कम से 20 x 20 पिक्सेल (३.३ μm 2) (चित्र 1क) । यह अधिग्रहण रॉय में एक नियंत्रण रॉय को शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि photoब्लीचिंग कि दोहराया इमेजिंग के साथ हो सकता है नियंत्रित किया जा सकता है । अधिग्रहण रॉय यहां परिभाषित किया गया है कि केवल क्षेत्र है कि स्कैन किया जाएगा होगा । एक अधिग्रहण ROI के भीतर दोहराया लेजर स्कैनिंग केवल रॉय के बजाय photoब्लीचिंग सीमित होगा, उदाहरण के लिए, photoब्लीचिंग पूरे सेल या कई कोशिकाओं, और पिक्सल की संख्या PMT (डिटेक्टर) पर एकत्र की संख्या से अधिक हो जाएगा पिक्सल एक पूरे सेल या एकाधिक कोशिकाओं को स्कैन करने के बाद PMT (डिटेक्टर) पर एकत्र.
    8. सेट अप समय श्रृंखला ऐसी है कि अधिग्रहण रॉय ३५ बार स्कैन किया जाता है, एक बार हर 30 एस पर क्लिक करें प्राप्त बटन, तो समय श्रृंखला बटन । समय श्रृंखला नियंत्रण विंडो में, मैन्युअल प्रारंभ श्रृंखला बटन और मैन्युअल स्टॉप श्रृंखला बटन क्लिक करें । ३५ मैनुअल स्टॉप श्रृंखला क्षेत्र में दर्ज करें, enter कुंजी दबाएँ, उसके बाद ३०.० सेकंड चक्र विलंब बटन पर क्लिक करें (चित्रा 2ई).
    9. ब्लीच नियंत्रण सेट इस तरह कि photoब्लीचिंग के बाद स्कैन संख्या 5, अधिग्रहण रॉय की 5 prebleach छवियों को इकट्ठा करने के लिए हो जाएगा । मोल बटन पर क्लिक करें, तो संपादित ब्लीच बटन. ब्लीच नियंत्रण विंडो में, नंबर स्कैन के बाद ब्लीचके बगल में सफेद वर्ग क्लिक करें. 5 को स्कैन संख्या फ़ील्ड में दर्ज करें, फिर enter कुंजी दबाएँ (चित्र 2F).
      नोट: Prebleach और postbleach छवियों को एक ही ऑप्टिकल गहराई पर अधिग्रहण किया जाना चाहिए ।
    10. एक परिपत्र के आकार का ब्लीच रॉय के भीतर बना है कि एक 10 पिक्सेल व्यास (क्षेत्र = ०.८ μm2) है । क्लिक प्राप्त करें । एडिट ब्लीच | क्षेत्रों को परिभाषितकरें । ब्लीच क्षेत्र विंडो में, वृत्त चिह्न क्लिक करें । क्लिक करें और खींचें छवि विंडो में एक चक्र है कि एक 10 पिक्सेल व्यास (क्षेत्र = ०.८ μm2) (चित्रा 2एफ) है बनाने के लिए ।
    11. पुनरूक्तियां सेट करने के लिए ३००। मोल बटन पर क्लिक करें, तो संपादित ब्लीच बटन. ब्लीच नियंत्रण विंडो में, ३०० iterations फ़ील्ड में दर्ज करें, फिर enter कुंजी दबाएँ (चित्रा 2F).
    12. Argon/2 ५१४-nm लेजर लाइन को १००% पावर (८.६ A) और १००% ट्रांसमिशन को ब्लीच के दौरान सेट करें । मोल बटन पर क्लिक करें, तो संपादित ब्लीच बटन. ब्लीच नियंत्रण विंडो में, सफेद वर्ग बॉक्स ५१४ nmके बाईं ओर क्लिक करें । ५१४ nm लेज़र लाइन के लिए ट्रांसमिशन [%] फ़ील्ड में १०० दर्ज करें, फिर enter बटन दबाएँ (चित्र 2F).
      नोट: पुनरावर्तों की संख्या को empirically निर्धारित करने की आवश्यकता है । यह फ्लोट्रोफोर, संरचना का आकार है कि bleached हो जाएगा, और लेजर के आधार पर भिंन होगा ।
  3. आंकडा संग्रह
    1. FRAP प्रयोग शुरू करते हैं । पहले 5 prebleach छवियों और पहले postbleach छवि ले लीजिए, तो निंनलिखित समीकरण के अनुसार ब्लीच गहराई की गणना ।
      Equation 1
      ब्लीच गहराई 90 < है, तो प्रयोग बंद करो और डेटा त्यागने, ब्लीच गहराई पर्याप्त नहीं था के रूप में. जब ब्लीच गहराई ≥ ९० है, एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम और एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम (सामग्री की तालिका) के साथ विश्लेषण के लिए डेटा इकट्ठा.
      नोट: जब ALIS के बहाव ≥ 3 μm है, प्रयोग बंद करो और डेटा त्यागने, छवि बहाव की इस राशि के रूप में छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (सामग्री की मेज) के साथ विश्लेषण के द्वारा के लिए सही नहीं किया जा सकता है । जब ALIS के बहाव 3 μm < है, एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम और एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम (सामग्री की मेज) के साथ डेटा विश्लेषण के लिए डेटा इकट्ठा ।
    2. 10 से 10 ALIS से FRAP डेटा ले लीजिए से कम 3 μm के बहाव के साथ कोशिकाओं ALIS । अगला, AIM. lsm फ़ाइलें डेटा विश्लेषण के लिए एक पर्सनल कंप्यूटर के लिए स्थानांतरण ।
  4. एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम में डेटा विश्लेषण
    1. सीध या मिलान द्वारा छवि बहाव के लिए सही (यानी, पंजीकरण) अधिग्रहण रॉय की समय श्रृंखला छवियों के ढेर । ऐसा करने के लिए, प्रत्येक AIM. lsm एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम (सामग्री की मेज) के साथ फ़ाइल खोलें, तो Plugins का चयन करें । पंजीकरण । StackReg । अनुवाद। अगला, Plugins का चयन करें । पंजीकरण । StackReg । कठोर शरीर10.
    2. सेट-अप रॉय प्रबंधक ब्लीच रॉय में संकेत तीव्रता को मापने के लिए । विश्लेषण चुनें । उपकरण । रॉय प्रबंधक। अंडाकार उपकरण का चयन करें, तो 10 पिक्सल के एक व्यास के साथ ब्लीच रॉय में एक चक्र आकर्षित, तो जोड़ें बटन पर क्लिक करें.
    3. नियंत्रण रॉय में सिग्नल तीव्रता को मापने के लिए रॉय प्रबंधक सेट अप । ROI प्रबंधक में, आयत टूल का चयन करें, फिर नियंत्रण ROI क्षेत्र में 20 x 20 पिक्सेल का एक वर्ग आरेखित करें, फिर जोड़ें बटन पर क्लिक करे.
    4. पृष्ठभूमि रॉय में सिग्नल तीव्रता को मापने के लिए रॉय प्रबंधक सेट अप । ROI प्रबंधक में, आयत टूल का चयन करें, पृष्ठभूमि ROI क्षेत्र में 20 x 20 पिक्सेल का एक वर्ग आरेखित करें, फिर जोड़ें बटन पर क्लिक करे.
    5. रोइस का नाम बदलें । रॉइस को जोड़ने के बाद रॉय प्रबंधकमें विश्लेषण किया जा करने के लिए, उनका नाम बदलें ब्लीच रॉय, नियंत्रण रॉय, और पृष्ठभूमि रॉय तदनुसार ।
    6. रोइस में संकेत तीव्रता मापने । चुनें ब्लीच रॉय, रॉय नियंत्रण, और पृष्ठभूमि रॉय, तो अधिक का चयन करें । बहु उपाय। सुनिश्चित करें कि सभी ३५ स्लाइस और स्लाइस प्रति एक पंक्ति को मापने का चयन कर रहे हैं । माप सेट करें विंडो में, सुनिश्चित करें कि केवल धूसर मान का माध्य चयनित है ।
      नोट: ये कच्चे FRAP डेटा (चित्रा 1बी) हैं ।
    7. परिणामों को स्प्रेडशीट प्रोग्राम (सामग्रियों की तालिका) में चिपकाएं । ब्लीच रॉय, नियंत्रण रॉय, और पृष्ठभूमि रॉय संकेत तीव्रता परिणाम तो उंहें ब्लीच रॉय, नियंत्रण रॉय, और पृष्ठभूमि रॉय, क्रमशः एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम (सामग्री की तालिका) में लेबल कॉलम के लिए पेस्ट की प्रतिलिपि बनाएं ।
  5. स्प्रेडशीट प्रोग्राम में डेटा विश्लेषण
    1. पृष्ठभूमि-ब्लीच रॉय और नियंत्रण रॉय में संकेत तीव्रता सही (चित्रा 1ए, सी). किसी स्प्रेडशीट प्रोग्राम (सामग्रियों की तालिका) में फ़ंक्शन संमिलित करें टूल का उपयोग करके लेबल किए गए स्तंभ में मानों से बैकग्राउंड Roi को घटाना, ब्लीच roiको लेबल करना । नियंत्रण रॉयलेबल वाले स्तंभ में मानों से पृष्ठभूमि roi लेबल किए गए स्तंभ में मानों को घटाना. लेबल इन नए कॉलम ब्लीच रॉय सही और सही नियंत्रण रॉय।
    2. नियंत्रण रॉय में पृष्ठभूमि-सही संकेत करने के लिए ब्लीच रॉय में संकेत सामान्य (चित्रा 1ए, डी). एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम (सामग्री की तालिका) में संमिलित करें फ़ंक्शन का उपयोग करें लेबल किए गए स्तंभ में मानों द्वारा सही किए गए ब्लीच roi को विभाजित करने के लिए लेबल किए गए नियंत्रण ROI सहीकिया गया । लेबल इस नए स्तंभ Normalized सही ब्लीच रॉय।
    3. सामान्यीकृत सही ब्लीच रॉय स्तंभ में 5 prebleach मान ब्लीच रॉय (चित्र 1A, E) के औसत के लिए संकेत को सामान्य । ब्लीच रॉय में 5 prebleach मूल्यों के औसत की गणना । अगला, मान विभाजित ब्लीच ROI में 5 prebleach मान के औसत द्वारा सुधारित ब्लीच Roi सामांयीकृत लेबल स्तंभ में । लेबल इस नए स्तंभ सामांयीकृत सही Prebleach औसत ब्लीच रॉय।
  6. वक्र-सज्जित आंकड़ों से वसूली का मोबाइल अंश और आधा समय
    1. वक्र-एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर सामांयीकृत और सही ब्लीच रॉय डेटा फिट । इमेजिंग प्रसंस्करण कार्यक्रम में (सामग्री की तालिका), का चयन करें विश्लेषण । उपकरण । वक्र फिटिंग। प्रतिलिपि postbleach सामांयीकृत और सही ब्लीच रॉय मूल्यों और इसी समय मूल्यों, तो उंहें वक्र फिटर विंडो में पेस्ट करें । वक्र फिटर ड्रॉप-डाउन मेनू से घातांक पुनर्प्राप्ति का चयन करें, तब फ़िटका चयन करें ।
    2. पुनर्प्राप्ति फ़ंक्शन के पैरामीटर्स से Mf परिकलित करें, जो इसके लिए मान प्रदान करता है: ' a, ' एक धीरे से पुनर्प्राप्त होने वाला भिंन; ' ख, ' वसूली दर; और ' सी, ' एक तेजी से diffusing अंश । समीकरण Mf = a + c में ' a ' और ' c ' के लिए मानों में plugging द्वारा mf की गणना करें । मैं समीकरण मैं च = 1- एमएफका उपयोग कर की गणना । टी1/2के लिए तो हल समीकरण Equation 2 में ' बी ' के लिए मूल्य प्रतिस्थापन द्वारा t1/2 की गणना । 11

Representative Results

यहां दिखाया एक ठेठ प्रयोग में हम FRAP इस्तेमाल के लिए कच्चे 264.7 3-5 एच12के लिए lps के साथ इलाज की कोशिकाओं में ALIS में p62 की गतिशीलता की डिग्री की जांच के परिणाम हैं । चित्रा 3 एक कच्चे एक ब्लीच, नियंत्रण से प्राप्त डेटा से पता चलता है, और पृष्ठभूमि रॉय छवियों के ढेर के बाद छोटी मात्रा के लिए सही गठबंधन किया गया था (< ~ 3 μm) के छवि बहाव के ALIS । इस एलिस में prebleach और postbleach में YFP-p62 प्रतिदीप्ति चित्रा 3ई और अनुपूरक वीडियो 1में दिखाया गया है । चित्रा 3 बी पृष्ठभूमि सुधार के बाद इन आंकड़ों से पता चलता है । चित्रा 3 C नियंत्रण रॉय में प्रतिदीप्ति के लिए सुधार के बाद इन आंकड़ों से पता चलता है । चित्रा 3 डी इन डेटा ब्लीच रॉय में 5 prebleach मूल्यों का मतलब प्रतिदीप्ति को सामांयीकृत दिखाता है । ब्लीचिंग की डिग्री इस प्रयोग में पर्याप्त थी (ब्लीच गहराई = ९१.९४). इस ALIS के भीतर YFP-p62 प्रतिदीप्ति धीरे से बरामद, टी1/2 = १२८.२७ एस के रूप में (२.१४ मिनट) । YFP-p62 इस प्रयोग में एक बहुत मोबाइल प्रोटीन नहीं था, के रूप में एमएफ = २१.९७ और मैंएफ = ७८.०३ ।

Figure 1
चित्रा 1 : एक कच्चा 264.7 सेल और छवि विश्लेषण के लिए कदम के बाद FRAP छवियों के एक आरेख के लिए ALIS की छवि बहाव के लिए सही गठबंधन किया गया है । (क) अधिग्रहण रॉय के भीतर कई ALIS और ब्लीच, नियंत्रण, और पृष्ठभूमि rois चित्रण एक कच्चा 264.7 सेल का आरेख । (ख) पैनल ए में ब्लीच, नियंत्रण और पृष्ठभूमि रोइस में प्राप्त कच्चे frap डेटा का एक आदर्शवादी चित्रण (ग) कच्चे frap डेटा का एक idealized ग्राफ है कि पृष्ठभूमि में सुधार किया गया है । (घ) पृष्ठभूमि के एक idealized ग्राफ-सही frap डेटा है कि नियंत्रण रॉय में प्रतिदीप्ति के लिए सामांयीकृत किया गया है । (ङ) सामान्यीकृत और पृष्ठभूमि के एक idealized ग्राफ-सही frap डेटा है कि ब्लीच रॉय में prebleach प्रतिदीप्ति को सामांयीकृत किया गया है । संक्षिप: Con = नियंत्रण; BG = पृष्ठभूमि । यह आंकड़ा रापर और ऐलेनबर्ग4से संशोधित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: लेजर चयन, बीम पथ विंयास, और FRAP प्रयोगों के लिए छवि अधिग्रहण मापदंडों के लिए AIM सॉफ्टवेयर (सामग्री की मेज) में उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस की छवियां । (क) लेजर नियंत्रण स्क्रीन argon/2 लेजर लाइनों, आउटपुट, और ट्यूब वर्तमान इस्तेमाल दिखा । (ख) बीम अलगानेवाला और उत्सर्जन फिल्टर सेटिंग्स का इस्तेमाल दिखा विंयास नियंत्रण स्क्रीन । (ग) स्कैन नियंत्रण स्क्रीन छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग दिखा । (घ) आर्जिन/2 ५१४ एनएम लेजर लाइन के लिए पिनहोल, डिटेक्टर गेन, एम्पलीफायर ऑफसेट, एम्पलीफायर गेन, और ट्रांसमिशन सेटिंग्स को दर्शाने वाला स्कैन नियंत्रण स्क्रीन । (ङ) समय श्रृंखला नियंत्रण स्क्रीन का उपयोग कर समय सीरीज सेटिंग्स दिखा । (च) ब्लीच नियंत्रण स्क्रीन इस्तेमाल किया prebleach और postbleach मापदंडों दिखा । संक्षिप्तियां: HFT = Haupt फरब Teiler (प्राथमिक द्वि-चरिक बीम अलगानेवाला); NT1 = नेबेन फरब Teiler 1 (प्रथम द्वितीयक द्वि-चक्रीय बीम अलगानेवाला); NT2 = नेबेन फरब Teiler 2 (द्वितीय माध्यमिक द्विचरिक बीम अलगानेवाला); EF = उत्सर्जन फिल्टर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : एक प्रतिनिधि FRAP प्रयोग के लिए YFP-कच्चे 264.7 कोशिकाओं में ALIS में p62 गतिशीलता का अध्ययन । (क) एक ब्लीच, नियंत्रण, और पृष्ठभूमि रॉय के लिए कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा । (ख) ब्लीच और नियंत्रण रॉय के बाद पैनल ए में दिए गए आंकडे़ को पृष्ठभूमि रॉय में प्रतिदीप्ति के लिए ठीक कर दिया गया था । (ग) पृष्ठभूमि-संशोधित नियंत्रण रॉय में प्रतिदीप्ति के लिए ब्लीच रॉय में प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामान्य करने के बाद पैनलों ए और बी में दिए गए आंकडे़ । (घ) प्रसामान्यीकृत और पृष्ठभूमि में प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामान्य करने के बाद पैनल ए-सी में दिए गए आंकडे़-ब्लीच रॉय में प्रथम 5 ब्लीच मूल्यों के औसत को विरंजित कर दिया गया है । Mf = २१.९७, If = ७८.०३, t1/2 = १२८.२७ s (२.१४ min), और ब्लीच गहराई = ९१.९४ । (ङ) प्रीब्लीच (१.५ मिनट) और postbleach (0, 6, और 16 मिनट) में एक ALIS की एक छवि । स्केल बार = 5 μm और सभी पैनलों के लिए मांय है । संक्षिप: Con = नियंत्रण; BG = पृष्ठभूमि; Corr. = सुधारा; आदर्श. = सामांयीकृत; औसत = average. यह आंकड़ा Cabe एट अल.12से संशोधित किया गया थाकृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Video 1
अनुपूरक वीडियो 1: photoब्लीचिंग के पहले और बाद में एक कच्चे 264.7 मैक्रोफेज में एक ठेठ ALIS । YFP-p62 प्रतिदीप्ति photobleach के बाद ठीक करने के लिए धीमी है; इसलिए, p62 एक बहुत मोबाइल प्रोटीन नहीं है । इस प्रयोग के लिए, Mf = २५.६२, If = ७४.३८, t1/2 = ४४२.७९ s (७.३८ min), और ब्लीच गहराई = ९०.१९ । स्केल बार = 5 μm । इस वीडियो Cabe एट अल.12से संशोधित किया गया थाकृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Discussion

हम लाइव कोशिकाओं के साथ FRAP प्रयोगों के लिए एक व्यापक, व्यावहारिक, और सरल कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस के साथ साथ, प्रोटोकॉल के लिए yfp की गतिशीलता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था p62 कच्चे 264.7 macrophages में ALIS में, लेकिन यह लेजर स्कैनिंग संनाभि माइक्रोस्कोप सिस्टम के कई और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि अब उपलब्ध है लागू किया जा सकता है । किसी भी माइक्रोस्कोपी प्रणाली के लिए, पायलट प्रयोगों अधिग्रहण, ब्लीच, और नियंत्रण रॉय आकार, photoब्लीचिंग के लिए लेजर तीव्रता, और prebleach और postbleach छवि अधिग्रहण सहित इष्टतम FRAP मापदंडों का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । यह इष्टतम FRAP मापदंडों प्रत्येक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन और सेल लाइन के लिए अलग करने की उंमीद करने के लिए उचित है ।

महत्वपूर्ण कारकों पर विचार करने के लिए जब एक FRAP प्रयोग आयोजित करने में शामिल है (क) उपयुक्त ब्लीच गहराई को प्राप्त करने, (ख) एक संक्षिप्त विरंजन कदम के उपयोग, (ग) पर्याप्त समय postbleach पूर्ण वसूली समारोह का निरीक्षण करने की अनुमति, (घ) photoब्लीचिंग दक्षता, (ई) दोहराया frap के साथ कोशिका आविषता, और (च) दोहराया इमेजिंग के कारण प्रतिदीप्ति हानि के लिए एक नियंत्रण का समावेश । हम अनुशंसा करते है कि ब्लीच गहराई, जो धारा 3.3.1 में प्रदान समीकरण के अनुसार गणना की जा सकती है, ≥ ९०13। जब ब्लीच गहराई 90 < है, postbleach प्रतिदीप्ति वसूली की डिग्री को कम करके आंका जाएगा, और मैंएफ, एमएफके मूल्यों, और टी1/2 गलत हो जाएगा । हालांकि अवधि और ब्लीच की तीव्रता-लेजर दालों inducing FRAP प्रयोगों के बीच भिंन हो सकते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि photoब्लीचिंग कदम संक्षिप्त और काफी तेजी से प्रतिदीप्ति वसूली समारोह की तुलना में है । यदि ऐसा नहीं है, तो प्रतिदीप्ति वसूली की एक महत्वपूर्ण राशि विरंजन कदम के दौरान हो सकता है । एक लंबे ब्लीच समय के साथ, विरंजन कदम के दौरान प्रतिदीप्ति वसूली मापा नहीं होगा, और यह मैंएफ, एमएफ, औरटी1/2के गलत माप करने के लिए नेतृत्व करेंगे । इसके अलावा, मैंएफके लिए सही मूल्यों को प्राप्त करने के लिए,एमएफ, और टी1/2, अधिग्रहण रॉय postbleach मनाया जाना चाहिए जब तक ब्लीच रॉय में प्रतिदीप्ति स्तर एक पठार तक पहुंच गया है । उदाहरण के लिए, हमारे FRAP प्रयोगों में, वहां मैंएफ, एमएफके बीच कोई अंतर नहीं था, और टी1/2 मूल्यों जब हम yfp-३२.२ ंयूनतम POSTBLEACH के लिए ब्लीच रॉय में p62 प्रतिदीप्ति मनाया बनाम जब हम YFP मनाया-ब्लीच रॉय में p62 के लिए १५.१ min postbleach; इस प्रकार, हम निष्कर्ष निकाला है कि वसूली समारोह में १५.१ मिनट पर एक पठार पहुंचे12postbleach । photoब्लीचिंग दक्षता के संबंध में, ऑप्टिकल ज़ूम फैक्टर14के वर्ग के साथ photoब्लीचिंग बढ़ जाती है । इस प्रकार, उच्च ऑप्टिकल ज़ूम लेंस का उपयोग तेजी से photoब्लीचिंग के लिए अनुकूल है, लेकिन अधिग्रहण के दौरान अवांछनीय photoब्लीचिंग में परिणाम कर सकते हैं; बाद इमेजिंग एक नियंत्रण रॉय द्वारा के लिए जिंमेदार हो सकता है । दोहराया photoब्लीचिंग के रूप में यह साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओज) की पीढ़ी के लिए नेतृत्व कर सकते है से बचना होगा । हालांकि, एक उच्च तीव्रता लेजर के लिए जोखिम के कारण ROS पीढ़ी की डिग्री रासायनिक फ्लोरोफोरस (जैसे, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी) के लिए की तुलना में आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए कम है15, और उत्पन्न ros अधिक प्रतिक्रिया करने की संभावना है भीतर आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ सेल में अंय अणुओं4। साइटोटोक्सिक ROS पैदा करने की वृद्धि की संभावना के अलावा, दोहराया photoब्लीचिंग के रूप में इसे नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है बचा जा करने के लिए है । अंत में, हालांकि कम लेजर संचरण के लिए सभी गैर ब्लीच छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, कुछ photoब्लीचिंग निरपवाद रूप से घटित होगा, जो नियंत्रित किया जाना चाहिए. इस के लिए संभव नियंत्रण अधिग्रहण रॉय के भीतर एक नियंत्रण रॉय में निगरानी प्रतिदीप्ति शामिल हैं, एक पड़ोसी अविरंजित सेल में नियंत्रण छवियों को प्राप्त करने, और में इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए समान सेटिंग्स के साथ नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन photoब्लीचिंग प्रयोगों लेकिन photoब्लीचिंग घटना के बिना.

Disclosures

लेखकों के हित का कोई विरोध प्रकट नहीं है.

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि पर अपनी बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए लोयोला विश्वविद्यालय शिकागो में डॉ सेठ रोबिया का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम के लिए NIH अनुदान 1R01NS073967-01A1 जोआना सी. Bakowska द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone SH30022.01 High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C 35 mm
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L4391
Nocodazole Sigma M1404
Penicillin-streptomycin solution Corning 30-002-Cl 100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objective Carl Zeiss MicroImaging, Inc 4407629904000000
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-1 linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophages ATCC TIB-71
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss MicroImaging, Inc LSM 510

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References

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पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की Photoब्लीचिंग के बाद प्रतिदीप्ति वसूली आक्रामक तरह प्रेरित संरचनाओं में p62 टैग की गईं
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Rademacher, D. J., Cabe, M., Bakowska, J. C. Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures. J. Vis. Exp. (145), e59288, doi:10.3791/59288 (2019).

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