Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 用于利用 I 型胶原蛋白制备两种不同形式的培养基板。根据胶原蛋白的处理方式, 胶原蛋白分子要么保持二维, 非纤维状的形式, 要么重新组装成三维的, 纤维形式。I 型胶原蛋白上的细胞增殖受到纤维形成的极大影响。
Abstract
I 型胶原蛋白, 用作细胞培养的基质, 存在于两种形式: 二维, 非纤维形式和三维, 纤维形式。这两种形式都可以用相同类型的 I 胶原蛋白制备。一般来说, 非纤维化的形式促进细胞的粘附和增殖。纤维形式 (凝胶) 提供了更多的生理条件在许多类型的细胞;因此, 凝胶培养是有用的检查生理行为的细胞, 如药物的疗效。
研究人员可以根据其使用目的选择合适的形式。例如, 在角质形成细胞的情况下, 凝胶培养已被用作伤口愈合模型。FEPE1L-8, 一种在 I 型胶原蛋白非纤维化形式上培养的角质形成细胞系, 促进细胞粘附。值得注意的是, 角质形成的角质形成细胞在纤维形态上的增殖比非纤维状的增殖慢。用于细胞培养的 I 型胶原蛋白制备方案简单, 根据实验需要具有广泛的应用价值。
Introduction
间质结缔组织由异质成分组成的三维蛋白质网状结构组成, 主要由 I 型胶原纤维1组成.胶原蛋白纤维作为细胞1、2、3 的支架, 并与其他细胞外基质 (ecm) 蛋白3相互作用.在体外, 根据处理方法1、2、3、4, 不同形式的 i 型胶原蛋白可作为细胞培养的底物。在酸性条件下, I 型胶原蛋白保持非纤维化形式5。用非纤维状的培养皿涂覆促进细胞粘附和增殖6,7。在生理 ph 值和温度下, i 型胶原蛋白分子重新组装成纤维, 形成具有三维结构的凝胶1,2,3,4, 5,6,7,8。I 型胶原蛋白的纤维和非纤维形式之间有几个重要的区别, 包括基质刚度和培养过程中细胞重建 ecm 成分的效率。基质刚度是细胞培养1, 9研究最多的调节因素之一。然而, 基板和细胞之间的复杂相互作用仍有待澄清。为了检查细胞和环境因素之间的复杂相互作用, 一个简单的系统是有用的。比较两种不同形式的胶原蛋白的细胞行为可能有助于简化环境因素的影响。根据其使用的目的, 不同形式的 I 型胶原蛋白可以选择性地使用。通常情况下, 角质形成细胞与基底膜接触, 但不与 I 型胶原蛋白接触。然而, 在伤口愈合过程中, 角质形成细胞移动到真皮结缔组织, 增殖, 并愈合伤口 10。
最近, 我们证明, 细胞外钙的浓度是重要的增殖角质形成细胞系细胞使用培养系统上的纤维形式的 i 型胶原蛋白模仿真皮结缔组织11。在 I 型胶原蛋白的纤维形态上培养角质形成细胞系 FEPE1L-8 时, 细胞的形状是圆形的, 在细胞外钙浓度为 30μm11时, 细胞增殖停止。当钙浓度增加到 1.8 mM 时, 细胞生长恢复 11.在非纤维型11上培养时, 细胞在钙浓度(30μm 和 1.8 mm) 下生长, 而在纤维形态上培养时, 细胞对外源钙浓度更为敏感。FEPE1L - 8 是通过与 16 型状瘤病毒转染产生的 , 将人类宫颈癌的 E6 和 E7 转化为非致瘤 , 抑制无限增殖 , 分化潜力有限 , 就像正常角质形成细胞一样12,13。FEEPE1L-8 细胞可以通过使用某些类型的角质形成细胞特异性培养基来维持, 包括 K110 ii 型和添加剂补充 K-1 (K110)6。在这里, 我们描述了人类角质形成细胞系在 I 型胶原蛋白的非纤维和纤维形式上的培养协议。
Protocol
1. 角质形成细胞培养基的制备
注: 在无菌条件下执行所有过程。
- 使用移液器加入5毫升青霉素链霉素和10毫升的添加剂补充 k-1 至500毫升 K110 型 ii 培养基 (K110)。
2. I 型胶原蛋白纤维形式的制备
注: 在无菌条件下执行直到步骤2.6 的过程。
- 保持10倍磷酸盐缓冲盐水 (PBS (-)), 去离子水, 胶原蛋白, 96 孔培养板, 和一个空的2毫升管在冰上。
注: 不要使用相同的板材来制备纤维和非纤维形式。 - 使用移液器将1.12 毫升的去离子水加入空的2毫升管中。使用移液器将200μl 的 10倍 PBS (-) 添加到2毫升管中的去离子水中。轻轻晃动了几下管子。
- 使用移液器将0.66 毫升的胶原蛋白添加到2毫升管中。轻轻地快速晃动了几下管子。
注: 尽可能避免溶液中的气泡形成。在使用前立即准备胶原蛋白溶液。 - 将步骤2.3 中的胶原蛋白溶液的100μl 注入96孔培养板的每一口井。轻轻地将培养板从左到右移动。
注: 用胶原蛋白溶液覆盖井的整个表面。如果溶液不能覆盖整个表面, 请使用移液器尖端展开溶液。尽可能避免溶液中的气泡形成。 - 将培养板放入 CO2 孵化器中, 在37°c 孵育 1小时, 检查胶原蛋白的凝胶化程度, 将培养板移动到干净的长凳上。
注: 通过倾斜培养板确认凝胶化。 - 用移液器在井壁上的凝胶上轻轻倒 150μl K110 k110, 将培养板放入 co2 孵化器中,在37°c 孵育 1小时, 将培养板移动到干净的长凳上。在细胞培养之前, 使用移液器轻轻丢弃 K110。
注: 为了保护凝胶, 移液器的尖端应触摸井壁。
3. I 型胶原蛋白非纤维化形式的制备
注: 在无菌条件下执行所有过程。
- 在 1.5 mL 管中加入4μl 胶原蛋白, 加入 1.2 Ml 盐酸 (HCl), 然后使用移液器轻轻混合。
注: 使用前立即准备胶原蛋白。保持胶原蛋白和 HCl 冷却, 直到使用的时间。 - 使用移液器将100μl 的胶原蛋白倒进96孔培养板的每一口井中。轻轻摇摇培养板在左至右的运动和孵育在室温下1小时。
注: 确保井的整个表面覆盖有溶液。 - 孵育后, 丢弃胶原蛋白溶液, 用 PBS (-) 用移液器清洗两次井。
- 将1% 牛血清蛋白的 150μl (-) (1% BSA) 倒在96井培养基的井上, 在室温下孵育 1小时. 在细胞培养之前, 丢弃 1% BSA。
注: 确保井的整个表面覆盖有溶液。
4. FEPE1L-8 细胞的培养
注: 在无菌条件下执行所有过程。
- 将 FEPE1L-8 细胞保存在 K110 的100毫米培养盘中, 放入 CO2 孵化器中, 在37°c 和 5% CO 2 中孵育, 保持半融合.
- 在37°c 的水浴中制备 K110、胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂。
- 小心地从培养皿中取出培养基, 使用移液器加入0.05% 胰蛋白酶3毫升, 将培养皿放入 co2 孵化器中, 在 37°c 孵育5分钟。孵育后, 在10倍放大倍率下, 用相对照显微镜检查培养盘表面的细胞脱离情况。
注: 分离细胞的形态变为圆形。如果细胞扩散, 再孵育5分钟。 - 加入3毫升的胰蛋白酶抑制剂, 用移液器将分离细胞收集在15毫升离心管中。以 200 x g 的速度将细胞离心5分钟。
- 丢弃上清液, 使用移液器在 K110 的10毫升中重新悬浮颗粒。用10倍放大的相对比显微镜对细胞进行计数, 用 K110 适当稀释, 在 5.0 x10 4 细胞中制备细胞浓度。
- 用沿着井壁的移液器在培养板的每个井中轻轻播种0.1 毫升的 K110。将培养板放入 CO2 孵化器中, 在指定时间 (2小时、1天、3天) 在37°c 孵育。
注: 为了保护凝胶, 移液器的尖端应触摸井壁。
5. 活细胞数量的估计
- 在37°c 的水浴中培养 K110。混合130μl 四唑盐, 2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝基苯)-(2, 4-二苯甲苯基)-5-(2, 4 -二苯甲酰)-2 h 四唑、单钠盐 (wst-8) 和 1.3 ml 的 k110 在2-ml 管使用的液管。
- 将培养板移动到干净的长凳上, 然后使用移液器轻轻丢弃 K110。用移液器用 K110 轻轻冲洗非粘附细胞
- 使用移液器在每口井中加入 110μl K110 与 WST-8 混合, 将培养板放入 co2孵化器中, 在37°c 孵育2小时。
- 将培养板移动到干净的长凳上, 从每口井收集100Μl 的条件介质, 并将其移动到另一个96孔培养板的井中。使用微板读取器测量波长为 450 nm (OD450) 的吸收率, 并估计活细胞的数量。
Representative Results
图 1显示了使用 i 型胶原蛋白处理培养盘表面的示意图。在非纤维和纤维形态上观察到的细胞形态分别出现在图 2的左侧和右侧面板中。FEPE1L-8 细胞培养 2小时 (上部板) 和 3天 (下板)。在最初的2小时培养中, 细胞粘附并扩散在两种形式的胶原蛋白上 (图 2, 上板)。播种三天后, 非纤维状细胞继续扩散, 细胞数量增加 (图 2, 左下角面板)。相反, 纤维形态上的细胞表现出有限的扩散 (图 2, 右下角面板)。FEPE1L-8 细胞继续在 I 型胶原蛋白的非纤维形式 (图 3, 实心黑线, 封闭的黑眼圈) 和未经处理的盘面 (图 3, 点状灰色线, 封闭的灰色圆圈) 上增殖。相反, 细胞在纤维形态上没有增殖 (图 3, 虚线, 开放的圆圈)。图 2和图 3已从藤崎等人11 修改。
图 1: 用 i 型胶原蛋白处理的培养皿表面的示意图.在酸性条件下, I 型胶原蛋白分子以非纤维状形式 (左面板) 吸附在盘子表面。在37°c 的中性条件下, I 型胶原蛋白分子被重新组合成纤维, 并以凝胶形式 (右面板) 吸附在盘子表面。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: FEPE1L-8 细胞的形态.K110 中的 fepe1l-8 细胞采用 i 型胶原蛋白的非纤维形式 (10μgml; 左板) 或纤维形式 (1 mgml; 右面板) 培养 2小时 (上板) 或 3天 (下板)。白条表示 100μm.图 2已从 Fujisaki 等人修改, 如图1e–h11所示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: FEPE1L-8 细胞增殖.在 I 型胶原蛋白的非纤维形式 (黑色实线、黑色填充圆) 或纤维形式 (虚线、开放圆圈) 或未经处理的盘子表面 (灰色虚线、灰色填充圆圈) 上估计活细胞的数量为2小时、1天和3天。实验以三元为本, 数值显示为 + SD 的方法。图1j11 对这一数字进行了修改。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
一些 ECM 成分, 包括 I 型胶原蛋白, 在体内形成三维结构1。在这样的三维培养上, 凝胶基板在玻璃体中提供了比二维塑料表面1、2、3、4更多的生理条件。已经报道了许多关于凝胶培养方法的协议, 例如使用 i 型胶原蛋白1,2,3,4, 6,7, 11、iv 型胶原蛋白14、15和 matrigel16。I 型胶原蛋白是一种定义明确且广泛使用的材料, 因为它的丰富和易于处理。纯化的 i 型胶原蛋白的特征取决于动物的种类、年龄和纯化方法5,17。I 型胶原蛋白可使用醋酸和蛋白酶 (如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和原酶5,17) 纯化。酸溶性胶原蛋白维持氨基肽, 蛋白酶溶性胶原蛋白为清除氨基肽5,17。氨基肽的保留长度取决于蛋白酶的类型, 而端对肽的存在会影响纤维形态和凝胶强度5,17。酸溶性胶原纤维的粘度大于蛋白酶治疗胶原蛋白17的粘度。在这项研究中, 我们使用酸溶性牛 i 型胶原蛋白。辣椒溶解性胶原蛋白也可用于这种凝胶培养协议;然而, 凝胶强度较弱的17。这些材料上的差异会导致细胞行为差异, 但目前还没有很好地理解。
本研究中描述的凝胶培养协议非常简单。据报道, 对这种方法作了许多修改。角质形成细胞培养的一个可能的改变是模仿基底膜。Iv 型胶原凝胶可更好地保持基底膜样底物结构在体外 15,18。然而, 需要一个较长的潜伏期,以制备 iv 型胶原凝胶14,15,18。相反, 将 IV 型胶原蛋白与 I 型胶原蛋白凝胶混合可产生新的培养基板 (I/型 iv 型胶原蛋白混合凝胶)19。这些混合凝胶易于处理, 需要很短的时间进行凝胶化, 并产生更多的基底膜样条件的角质形成细胞。在 I/型 iv 型胶原蛋白杂化凝胶上, 角质形成细胞存活, 形成菌落, 并诱导终末分化19。这种混合方法具有多种应用。
使用 I 型胶原蛋白的凝胶培养会影响癌细胞。在 I 型胶原蛋白的纤维形态上, Caco-2 细胞 (结肠癌细胞系) 的 Akt 活化和生长被抑制 7.此外, 在 gvins 检查站 20号, 在纤维形态上的人类黑色素瘤细胞 (m24met) 的生长被逮捕。此外, 在以纤维形式培养的小鼠3T3-l1 前脂肪细胞中, 活性氧的含量显著增加。此外, I 型胶原蛋白21的非纤维和纤维形式在相反方向刺激细胞增殖和迁移。
Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢 K. Sekiguchi 博士 (大阪大学蛋白质研究所)、山田博士 (大阪大学蛋白质研究所)、T. 池岛博士 (中日医学与药学研究所)、吴亚学院。沈阳药大学创新大学) 和 T. Hayashi (沈阳药学院吴亚创新学院中日医学与药业研究所) 提供了有益的评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
| Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
| disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
| human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
| K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
| K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
| Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
| Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
References
- Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
- Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
- Kleinman, H. K., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. Haralsonand, M. A., Hassell, J. R. , IRL Press. Oxford. 289-301 (1995).
- Yamato, M., Hayashi, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. , 123-140 (1998).
- Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
- Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
- Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
- Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
- Shih, Y. -R., Tseng, K. F., Lai, H. -Y., Lin, C. -H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
- Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).
- Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
- Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
- Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
- Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
- Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
- Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922 (2014).
- Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
- Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
- Japan Institute of leather Research and Osaka University. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. Hattori, S., et al. , 2489375 (11F019-EP) (2015).
- Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
- Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).
