Summary
Nous présentons ici un protocole pour la préparation de deux formes différentes de substrats de culture utilisant la collagène de type I. Selon comment le collagène est géré, les molécules de collagène maintiennent forme à deux dimensions, non fibreux ou remonter en trois dimensions, forme de fibrilles. Sur la prolifération des cellules de type I collagène est considérablement affectée par la formation de fibrilles.
Abstract
J’ai du collagène type, utile comme un substrat pour la culture cellulaire, existe sous deux formes : la forme à deux dimensions, non fibreux et en trois dimensions, forme de fibrilles. Les deux formes peuvent être préparés avec le même collagène de type I. En général, la forme non fibreux favorise la prolifération et l’adhérence cellulaire. La forme de fibrilles (gels) fournit des conditions physiologiques plus dans de nombreux types de cellules ; gel de culture est donc utile pour l’examen des comportements physiologiques des cellules, telles que l’efficacité du médicament.
Les chercheurs peuvent sélectionner le formulaire approprié en fonction de l’objectif de son utilisation. Par exemple, dans le cas des kératinocytes, culture sur gel a servi comme un modèle de cicatrisation. FEPE1L-8, une lignée de cellules kératinocytes cultivés sur la forme non fibreux de type j’ai collagène, favoriser l’adhérence de la cellule. Notamment, la prolifération des kératinocytes est plus lente sur la forme de fibrilles que la forme non fibreux. Protocoles pour la préparation du collagène de type I pour culture cellulaire sont simples et ont de vastes applications selon les besoins expérimentaux.
Introduction
Les tissus conjonctif interstitiels comprend trois dimensions réseau de protéines de composition hétérogène, principalement composés de type I de fibrilles de collagène1. Fibrilles de collagène jouent un rôle clé comme un échafaudage pour cellules1,2,3 et d’interagissent avec les autres protéines de la matrice extracellulaire (ECM)3. In vitro, différentes formes de type j’ai collagène peut servir de substrats pour la culture cellulaire selon la manipulation méthode1,2,3,4. Dans des conditions acides, de type I collagène maintient la forme non fibreux5. Revêtement de la surface des récipients de culture avec la forme non fibreux favorise cell adhesion et la prolifération de6,7. Au pH physiologique et de la température, les molécules de collagène de type I remonter en fibrilles qui forment des gels possédant une structure tridimensionnelle1,2,3,4, 5,6,7,8. Il y a plusieurs importantes différences entre les fibrilles et formes non fibreux de type j’ai collagène, y compris la matrice rigidité et l’efficacité de la reconstruction des composantes d’ECM par les cellules au cours de la culture1. Matrice raideur est un des facteurs réglementaires plus étudiées de cell culture1, 9. Cependant, les interactions complexes entre les substrats et les cellules restent à préciser. Pour examiner les interactions complexes entre les cellules et les facteurs environnementaux, un système simple est utile. Comparaison du comportement cellulaire sur les deux formes différentes de collagène peut aider à simplifier l’effet des facteurs environnementaux. Selon le but de leur utilisation, les différentes formes de type j’ai collagène peut être sélectivement utilisé. Normalement, les kératinocytes sont en contact avec la membrane basale, mais pas avec du collagène type I. Cependant, au cours de la cicatrisation, les kératinocytes se déplacent vers le tissu conjonctif dermique, prolifèrent et guérir la plaie10.
Récemment, nous avons démontré que la concentration de calcium extracellulaire est importante pour la prolifération des kératinocytes de cellules en utilisant le système de culture sur la forme de fibrilles de collagène imitant le tissu conjonctif cutané11de type I. Lorsque la lignée de cellules kératinocytes FEPE1L-8 a été cultivée sur la forme de fibrilles de collagène de type I, la forme des cellules est ronde et leurs proliférations ont été arrêtées à une concentration de calcium extracellulaire de 30 μM11. Lorsque la concentration de calcium a été augmentée à 1,8 mM, croissance cellulaire a été récupéré11. Les cellules a grandi sous les deux concentrations de calcium (30 μM et 1,8 mM) lorsqu’il est cultivé sur le formulaire non fibreux11, alors qu’elles étaient plus sensibles à la concentration de calcium exogènes lorsqu’il est cultivé sur la forme de fibrilles. FEPE1L-8 a été généré par le biais de transfection avec les papillomavirus type 16 transformation gènes E6 et E7 de carcinome cervical humain, non-tumorigènes, inhiber la prolifération illimitée avec différenciation limitée potentielle comme les kératinocytes normaux 12,,13. FEPE1L-8 cellules peuvent être maintenues à l’aide de certains types de support des kératinocytes, y compris K110 Type II avec additif supplément K-1 (K110)6. Ici, les auteurs décrivent le protocole de culture d’une lignée cellulaire des kératinocytes humains sur la non fibreux et formes de fibrilles de collagène de type I.
Protocol
1. préparation du milieu de culture de kératinocytes
Remarque : Effectuez toutes les procédures dans des conditions aseptiques.
- Ajouter 5 mL de pénicilline-streptomycine et 10 mL d’additif supplément K-1 à 500 mL de milieu K110 Type-II (K110) à l’aide d’une pipette.
2. préparation de la forme de fibrilles de collagène de type I
Remarque : Effectuez les procédures avant l’étape 2.6 dans des conditions aseptiques.
- Garder 10 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS (–)), eau déminéralisée, collagène, une plaque de 96 puits culture et un tube 2 mL sur la glace.
Remarque : Ne pas utiliser la même plaque pour préparer les fibrilles et formes non fibreux. - Ajouter 1,12 mL d’eau désionisée à un tube à vide 2 mL à l’aide d’une pipette. Ajouter 200 µL de PBS de x 10 (-) à l’eau déionisée dans le tube 2 mL à l’aide d’une pipette. Agiter doucement le tube plusieurs fois.
- Ajouter 0,66 mL de collagène dans le tube 2 mL à l’aide d’une pipette. Doucement et rapidement secouez le tube plusieurs fois.
NOTE : Éviter la formation de bulles dans la solution autant que possible. Préparer la solution de collagène immédiatement avant leur utilisation. - Verser 100 µL de la solution de collagène de l’étape 2.3 dans chaque puits de la plaque de 96 puits de culture. Secouez légèrement la plaque de culture dans un gauche à droite motion.
Remarque : Elle recouvre la totalité de la surface des puits avec la solution de collagène. Si la solution ne couvre pas la totalité de la surface, étendre la solution à l’aide d’un embout de la pipette. Eviter la formation de bulles dans la solution autant que possible. - Placer la plaque de culture dans un incubateur à CO2 et incuber à 37 ° C pendant 1 h. vérifier la gélification du collagène et de déplacer la plaque de culture vers un banc propre.
NOTE : Confirmer la gélification par l’inclinaison de la plaque de culture. - Verser doucement 150 µL de K110 sur les gels à l’aide d’une pipette le long de la paroi du puits, lieu de la culture dans un incubateur à CO2 sur plaque et incuber à 37 ° C pendant 1 h. déplacer la plaque de culture à un banc propre. Avant la culture cellulaire, doucement jeter le K110 à l’aide d’une pipette.
Remarque : Afin de protéger les gels, la pointe de la pipette doit toucher la paroi du puits.
3. préparation de la forme non fibreux de collagène de type I
Remarque : Effectuez toutes les procédures dans des conditions aseptiques.
- Ajouter 4 µL de collagène à 1,2 mL de 1 mM d’acide chlorhydrique (HCl) dans un tube de 1,5 mL et mélanger délicatement à l’aide d’une pipette.
NOTE : Préparez immédiatement avant l’utilisation de collagène. Gardez le collagène et HCl réfrigérés jusqu’au moment de l’emploi. - Dans chaque puits d’une plaque de 96 puits de culture à l’aide d’une pipette, verser 100 µL de collagène. Secouez légèrement la plaque de culture à gauche vers la droite motion et incuber à température ambiante pendant 1 h.
Remarque : Assurez-vous que la totalité de la surface des puits est recouvert de solution. - Après l’incubation, jeter la solution de collagène et laver les puits avec du PBS (-) deux fois à l’aide d’une pipette.
- Verser 150 µL de 1 % bovine serum albumine/PBS (-) (1 % de BSA) dans un puits de la plaque de 96 puits culture et incuber à température ambiante pendant 1 h. avant la culture cellulaire, jeter le 1 % de BSA.
Remarque : Assurez-vous que la totalité de la surface des puits est recouvert de solution.
4. culture de cellules FEPE1L-8
Remarque : Effectuez toutes les procédures dans des conditions aseptiques.
- Maintenir les FEPE1L-8 cellules K110 dans un 100 mm plat dans un incubateur à CO2 de la culture et incubés à 37 ° C et 5 % CO2, de semi-confluency.
- Préparer le K110, la trypsine et inhibiteur de la trypsine dans un bain-marie à 37 ° C.
- Soigneusement retirer le support de la boîte de Petri, ajouter 3 mL de trypsine de 0,05 % à l’aide d’une pipette, placer le plat dans un incubateur à CO2 et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Après incubation, vérifier le détachement des cellules de la surface de la boîte de pétri à l’aide de la microscopie à contraste de phase à un grossissement de 10 x.
Remarque : La morphologie des cellules individuelles devient ronde. Si les cellules se propagent, incuber pendant une période supplémentaire de 5 min. - Ajouter 3 mL d’inhibiteur de la trypsine et de recueillir les cellules individuelles dans un tube à centrifuger 15 mL à l’aide d’une pipette. Centrifuger les cellules dans un tube à centrifuger 15 mL à 200 x g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 10 mL de K110 à l’aide d’une pipette. Compter les cellules à l’aide de la microscopie à contraste de phase à un grossissement de 10 x et préparer la concentration cellulaire à 5,0 x 104 cellules/mL de dilution appropriée avec K110.
- Les semences délicatement 0,1 mL de K110 avec cellules dans chaque puits de la plaque de culture à l’aide d’une pipette le long de la paroi du puits. Placer la plaque de culture dans un incubateur à CO2 et incuber à 37 ° C pendant le temps indiqué (2 h, 1 jour, 3 jours).
Remarque : Afin de protéger les gels, la pointe de la pipette doit toucher la paroi du puits.
5. estimation du nombre de cellules viables
- Incuber K110 dans un bain-marie à 37 ° C. Mix 130 µL de tétrazolium sel, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tétrazolium, sel monosodique (WST-8) et 1,3 mL de K110 dans un tube de 2 mL à l’aide d’une pipette.
- Déplacer la plaque de culture vers un banc propre et écarter doucement le K110 à l’aide d’une pipette. Laver délicatement les cellules non adhérentes avec K110 en utilisant une pipette
- Ajouter 110 µL de K110 mélangé à WST-8 dans chaque bien en utilisant une pipette, déposer la plaque de culture dans un incubateur à CO2 et incuber à 37 ° C pendant 2 h.
- Déplacer la plaque de culture vers un banc propre, collecter 100 µL de milieu conditionné de chaque puits et déplacez-le dans un puits d’une autre plaque de 96 puits de culture. Mesurer l’absorbance à une longueur d’onde de 450 nm (do450) en utilisant un lecteur de microplaques et une estimation du nombre de cellules viables.
Representative Results
Une représentation schématique du traitement des surfaces des récipients de culture à l’aide de type I collagène est représenté dans la Figure 1. Morphologies cellulaires observées sur les formes non fibreux et fibrilles sont présentés dans les panneaux de côtés gauche et droit de la Figure 2, respectivement. FEPE1L-8 cellules ont été cultivées pendant 2 h (panneaux supérieurs) et 3 jours (panneaux inférieurs). Dans les 2 h initiale de mise en culture, les cellules ont adhéré et réparties sur les deux formes de collagène (Figure 2, panneaux supérieurs). Trois jours après l’ensemencement, cellules sur le formulaire non fibreux a continué à se propager et cellule nombre a augmenté (Figure 2, panneau gauche inférieur). En revanche, les cellules sur la forme de fibrilles montrent limitée diffusion (Figure 2, panneau de droite plus bas). FEPE1L-8 cellules ont continué à proliférer sur le formulaire non fibreux de type j’ai collagène (Figure 3, la ligne noire continue, privée de cercles noirs) et sur le plat non traité des surfaces (Figure 3, ligne grise, des cercles gris fermés en pointillé). En revanche, les cellules ne pas prolifèrent sur la forme de fibrilles (Figure 3, pointillé, cercles vides). Figure 2 et Figure 3 ont été modifiées de Fujisaki et al.11.
Figure 1 : Des représentations schématiques des surfaces de culture plat traités avec type collagène. Dans des conditions acides, collagène de type I molécules sont adsorbés à la surface d’un plat sous forme non fibreux (panneau de gauche). Dans des conditions neutres à 37 ° C, collagène de type I molécules sont réassemblés en fibrilles et adsorbés sur la surface des plats sous la forme de gel (panneau de droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Morphologie des cellules FEPE1L-8. FEPE1L-8 cellules K110 ont été cultivés en utilisant le formulaire non fibreux (10 µg/mL ; panneaux de gauche) ou forme de fibrilles (1 mg/mL ; panneaux droite) de type I collagène pendant 2 h (panneaux supérieurs) ou 3 jours (panneaux inférieurs). Les barres blanches indiquent 100 µm. Figure 2 a été modifiée de Fujisaki et coll. en Figure 1E-H11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Prolifération de cellules FEPE1L-8. Le nombre de cellules viables ont été estimé sur la forme non fibreux (ligne noire épaisse, noirs cercles pleins) ou sur la fibrille forme (ligne pointillée, cercle ouvert) de type I collagène ou des surfaces non traitées plat (ligne pointillée grise, gris cercles pleins) pour 2 h, 1 jour et 3 jours. Expériences ont été effectuées dans la géométrie et les valeurs sont indiquées comme moyens + SD Ce chiffre a été modifié de Fujisaki et coll. en Figure 1J11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Certains composants de l’ECM, y compris collagène de type I, forme tridimensionnelle structures in vivo1. Culture sur ces trois dimensions, gel de substrat fournit des conditions physiologiques plus vitro que sur une surface à deux dimensions, en plastique,1,2,3,4. Nombreux protocoles concernant la méthode de culture de gel ont été signalés, comme l’utilisation de collagène1,2,3,4,6,7, de type I 11, collagène de type IV14,15et16de la Matrigel. J’ai taper le collagène est un matériau bien défini et largement utilisé en raison de son abondance et de la facilité de manipulation. Les caractéristiques de type purifié je collagène dépendent de l’animal espèces, l’âge et purification méthodes5,17. J’ai tapez collagène peut être purifiée à l’aide d’acide acétique ou protéases, telles que la pepsine, papaïne et proctase5,17. Collagène soluble dans l’acide soutient amino-télopeptides et collagène soluble-protéase sont clivés amino-télopeptides5,17. La longueur réservée des amino-télopeptides dépend du type de protéases, et la présence des télopeptides affecte la morphologie des fibrilles et gel force5,17. La viscosité des fibrilles de collagène acido-soluble est supérieure à celle des collagènes imprégnées de protéase17. Dans cette étude, nous avons utilisé acido-soluble bovine collagène de type I. Pepsine solubilisée collagène peut également être utilisé dans le présent protocole de culture de gel ; Cependant, la force de gel est plus faible17. Ces différences de matériaux peuvent entraîner des différences de comportement cellulaire, mais ils ne sont actuellement pas bien compris.
Le protocole de culture gel décrit dans cette étude est très simple. Beaucoup de modifications de cette méthode ont été signalés. Une seule modification possible pour la culture de kératinocytes consiste à mimer la membrane basale. Gels de collagène de type IV peuvent être préférable de garder une structure de la membrane basale comme substrat in vitro15,18. Cependant, une longue période d’incubation est nécessaire pour la préparation de type IV collagène gels14,15,18. Au lieu de cela, mélange de collagène de type IV avec j’ai tapez gels collagène peut produire des substrats de culture roman (de type I / type IV collagène hybride gels)19. Ces gels hybrides sont faciles à manipuler, nécessitent un peu de temps pour la gélification et le rendement plus conditions de membrane basale des kératinocytes. Suite de type I / type IV collagène hybride gels, kératinocytes survivent, forment des colonies et induisent la différenciation terminale19. Cette méthode hybride a de multiples applications.
À l’aide de la culture sur-gel de type I collagène affecte les cellules cancéreuses. Sur la forme de fibrilles de collagène de type I, l’activation d’Akt et la croissance des cellules Caco-2 (une lignée de cellules cancéreuses du colon) sont supprimés7. En outre, la croissance des cellules de mélanome humain (M24met) sur la forme de fibrilles est arrêtée au point de contrôle G1/S20. En outre, des niveaux nettement accrues d’espèces oxygénées réactives sont observées chez murine 3 t 3-L1 adipocytes cultivées sur la forme de fibrilles. En outre, migration et prolifération des cellules sont stimulées dans des directions opposées par le non fibreux et formes de fibrilles de collagène21de type I.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à m. K. Sekiguchi (Institut de recherche de la protéine, Université d’Osaka), Dr. M. Yamada (Institut de recherche de la protéine, Université d’Osaka), Dr T. Ikejima (Chine-Japon recherche Institut de médecine et Sciences pharmaceutiques, Wuya College of Innovation, Université pharmaceutique de Shenyang) et T. Hayashi (China-Japan Research Institute of Medical et Sciences pharmaceutiques, Wuya College of Innovation, Université pharmaceutique de Shenyang) des commentaires utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
| Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
| disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
| human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
| K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
| K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
| Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
| Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
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