Summary
यहां, हम संस्कृति के दो विभिंन रूपों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान प्रकार का उपयोग मैं कोलेजन substrates । कैसे कोलेजन को संभाला है पर निर्भर करता है, कोलेजन अणुओं या तो बनाए रखने के दो आयामी, गैर रेशेदार रूप या तीन में पुनः-आयामी, तंतुक फार्म । प्रकार मैं कोलेजन पर कोशिका प्रसार काफी तंतुक गठन से प्रभावित है ।
Abstract
प्रकार मैं कोलेजन, कोशिका संस्कृति के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में उपयोगी, दो रूपों में मौजूद है: दो आयामी, गैर रेशेदार रूप और तीन आयामी, तंतुक फार्म । दोनों रूपों एक ही प्रकार मैं कोलेजन के साथ तैयार किया जा सकता है । सामांय में, गैर रेशेदार रूप सेल आसंजन और प्रसार को बढ़ावा देता है । तंतुक फार्म (जैल) कोशिकाओं के कई प्रकार में और अधिक शारीरिक स्थितियों प्रदान करता है; इसलिए, जेल संस्कृति दवाओं प्रभावकारिता के रूप में कोशिकाओं के शारीरिक व्यवहार की जांच के लिए उपयोगी है ।
शोधकर्ता इसके उपयोग के उद्देश्य के अनुसार उपयुक्त प्रपत्र का चयन कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, keratinocytes के मामले में, पर जेल संस्कृति एक घाव भरने के मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है । FEPE1L-8, एक keratinocyte सेल लाइन प्रकार मैं कोलेजन के गैर रेशेदार रूप पर सभ्य, सेल आसंजन को बढ़ावा देने । विशेष रूप से, keratinocyte प्रसार गैर रेशेदार रूप से तंतुक फार्म पर धीमी है । सेल संस्कृति के लिए प्रकार मैं कोलेजन की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल सरल कर रहे है और व्यापक प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर आवेदन किया है ।
Introduction
अन्तरालीय संयोजी ऊतकों विषमांगी संरचना के एक तीन आयामी प्रोटीन meshwork शामिल, मुख्य रूप से प्रकार मैं कोलेजन तंतुओं1से बना । कोलेजन तंतुओं कोशिकाओं1,2,3 के लिए एक पाड़ के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है और अंय extracellular मैट्रिक्स (ecm)3प्रोटीन के साथ बातचीत । इन विट्रो में, प्रकार के विभिंन रूपों मैं कोलेजन सेल संस्कृति के लिए substrates के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता विधि1,2,3,4हैंडलिंग के आधार पर । के तहत अम्लीय स्थिति, प्रकार मैं कोलेजन गैर रेशेदार फार्म5का कहना है. कोटिंग गैर रेशेदार रूप के साथ संस्कृति व्यंजनों की सतह सेल आसंजन और प्रसार6,7को बढ़ावा देता है । शारीरिक पीएच और तापमान पर, प्रकार मैं कोलेजन अणुओं तंतुओं में फिर से इकट्ठा कि फार्म एक तीन आयामी संरचना1,2,3,4रखने जैल, 5,6,7,8. वहां कई और गैर तंतुक प्रकार के रेशेदार रूपों मैं मैट्रिक्स कठोरता और ecm घटकों के पुनर्निर्माण की क्षमता सहित संस्कृति1के दौरान कोशिकाओं द्वारा कोलेजन, के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं । मैट्रिक्स कठोरता कोशिका संस्कृति1, 9के सबसे अध्ययन विनियामक कारकों में से एक है । हालांकि, substrates और कोशिकाओं के बीच जटिल बातचीत स्पष्ट किया जा करने के लिए रहते हैं । कोशिकाओं और पर्यावरण कारकों के बीच जटिल बातचीत की जांच करने के लिए, एक सरल प्रणाली उपयोगी है । कोलेजन के दो विभिंन रूपों पर सेलुलर व्यवहार की तुलना पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव को सरल बनाने में मदद कर सकते हैं । उनके उपयोग के प्रयोजन पर निर्भर करता है, प्रकार मैं कोलेजन के विभिंन रूपों चुन कर इस्तेमाल किया जा सकता है । आम तौर पर, keratinocytes तहखाने झिल्ली के साथ संपर्क में हैं, लेकिन प्रकार के साथ नहीं मैं कोलेजन । हालांकि, घाव भरने के दौरान, keratinocytes त्वचीय संयोजी ऊतक के लिए ले जाने, proliferate, और घाव10चंगा ।
हाल ही में, हम का प्रदर्शन किया है कि extracellular कैल्शियम की एकाग्रता के लिए महत्वपूर्ण है keratinocyte रेखा कोशिकाओं के प्रकार के फाइनिल फार्म पर संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके मैं त्वचीय संयोजी ऊतक नकल उतार कोलेजन11. जब keratinocyte सेल लाइन FEPE1L-8 प्रकार के फाइनिल रूप मैं कोलेजन, कोशिकाओं के आकार पर सभ्य था दौर था और उनके proliferations 30 μM11के एक extracellular कैल्शियम एकाग्रता में बंद कर दिया गया । जब कैल्शियम एकाग्रता १.८ mM करने के लिए बढ़ाया गया था, सेल वृद्धि11बरामद किया गया । कोशिकाओं दोनों कैल्शियम सांद्रता के तहत वृद्धि हुई (30 μm और १.८ मिमी) जब गैर रेशेदार फार्म11पर सभ्य, जबकि वे अधिक बहिर्जात कैल्शियम एकाग्रता के प्रति संवेदनशील थे जब तंतुक फार्म पर संस्कारी । FEPE1L-8 पेपिलोमा वायरस प्रकार के साथ 16 रूपांतरण जीन E6 और E7 मानव ग्रीवा कार्सिनोमा, गैर ट्यूमर, सामान्य keratinocytes की तरह सीमित विभेदन क्षमता के साथ असीमित प्रसार को बाधित के साथ रूपांतरण के माध्यम से उत्पन्न किया गया था 12,13. FEPE1L-8 कोशिकाओं को कुछ प्रकार के keratinocyte विशिष्ट माध्यम का उपयोग करके बनाए रखा जा सकता है, additive के पूरक के साथ K110 टाइप-II सहित-1 (K110)6. यहां, हम मानव keratinocyte कोशिका रेखा के गैर रेशेदार और तंतुक प्रकार मैं कोलेजन के रूपों पर संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Protocol
1. keratinocyte संस्कृति मध्यम की तैयारी
नोट: अपूतित शर्तों के तहत सभी प्रक्रियाओं को निष्पादित करें ।
- पेनिसिलिन के 5 मिलीलीटर-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10 मिलीलीटर additive के पूरक K-1 से ५०० मिलीलीटर के K110 टाइप-II मध्यम (K110) एक पिपेट का उपयोग कर जोड़ें ।
2. प्रकार मैं कोलेजन के तंतुक फार्म की तैयारी
नोट: जब तक कि अपूतित शर्तों के तहत चरण २.६ तक कार्यविधियां निष्पादित करें ।
- 10x फॉस्फेट-buffered खारा (pbs (-)), विआयनीकृत पानी, कोलेजन, एक ९६-well संस्कृति प्लेट, और बर्फ पर एक खाली 2 मिलीलीटर ट्यूब रखो ।
नोट-एक ही थाली का इस्तेमाल न करें, जिससे फाइफिनिल और बिना रेशे वाले फॉर्म तैयार हो जाएं । - एक खाली 2 मिलीलीटर एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूब के लिए विआयनीकृत पानी की १.१२ मिलीलीटर जोड़ें । एक पिपेट का उपयोग कर 2 मिलीलीटर ट्यूब में विआयनीकृत पानी के लिए 10x pbs (-) के २०० μl जोड़ें । धीरे से कई बार ट्यूब मिलाते हैं ।
- 2 मिलीलीटर ट्यूब एक पिपेट का उपयोग करने के लिए कोलेजन के ०.६६ मिलीलीटर जोड़ें । धीरे से और जल्दी से कई बार ट्यूब हिला ।
नोट: संभव के रूप में ज्यादा के रूप में समाधान में बुलबुला गठन से बचें । कोलेजन समाधान तैयार तुरंत पहले का उपयोग करें । - डालो १०० चरण २.३ से कोलेजन समाधान के ९६-अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के प्रत्येक कुएं में μL । धीरे से एक बाईं ओर सही गति में संस्कृति थाली हिला ।
नोट: कोलेजन समाधान के साथ कुओं की पूरी सतह को कवर । यदि समाधान संपूर्ण सतह को कवर नहीं करता है, तो पिपेट टिप का उपयोग करके समाधान फैलाएं । संभव के रूप में ज्यादा के रूप में समाधान में बुलबुला गठन से बचें । - एक CO2 इंक्यूबेटर में संस्कृति की थाली प्लेस और 1 के लिए ३७ ° c पर सेते । कोलेजन के जिलेटन की जांच करें और एक स्वच्छ पीठ के लिए संस्कृति की थाली चाल ।
नोट: संस्कृति थाली झुकने से जिलेटन की पुष्टि करें । - धीरे से जैल पर १५० μl K110 के कूप की दीवार के साथ एक पिपेट का उपयोग कर डालना, एक CO2 इंक्यूबेटर में संस्कृति थाली प्लेस और 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेटे । संस्कृति की थाली को एक स्वच्छ पीठ में ले जाएं । सेल संस्कृति से पहले, धीरे से एक पिपेट का उपयोग कर K110 त्यागने ।
नोट: जैल को सुरक्षित रखने के लिए, पिपेट की नोक को कुएं की दीवार को छूना चाहिए ।
3. प्रकार की गैर रेशेदार रूप मैं कोलेजन की तैयारी
नोट: अपूतित शर्तों के तहत सभी प्रक्रियाओं को निष्पादित करें ।
- एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में 1 मिमी हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के १.२ मिलीलीटर में कोलेजन के 4 μL जोड़ें और धीरे एक पिपेट का उपयोग कर मिश्रण ।
नोट: कोलेजन का उपयोग करने के लिए तुरंत पहले तैयार करें । कोलेजन और एचसीएल को इस्तेमाल के समय तक ठंडा रखें । - एक ९६-अच्छी तरह से संस्कृति एक पिपेट का उपयोग कर थाली के एक अच्छी तरह से में कोलेजन के १०० μL डालो । धीरे से सही गति के लिए एक बाएँ में संस्कृति थाली हिला और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेबेट.
नोट: सुनिश्चित करें कि कुओं की पूरी सतह समाधान के साथ कवर किया जाता है । - ऊष्मायन के बाद, कोलेजन समाधान त्यागने और PBS (-) दो बार एक पिपेट का उपयोग कर के साथ कुओं धोने ।
- 1% गोजातीय सीरम albumin/PBS (-) (1% BSA) की एक अच्छी तरह से ९६-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट और 1 के लिए कमरे के तापमान पर सेबेट की १५० μL डालो सेल संस्कृति से पहले, 1% BSA छोड़ ।
नोट: सुनिश्चित करें कि कुओं की पूरी सतह समाधान के साथ कवर किया जाता है ।
4. FEPE1L की संस्कृति-8 कोशिकाओं
नोट: अपूतित शर्तों के तहत सभी प्रक्रियाओं को निष्पादित करें ।
- K110 में FEPE1L-8 कोशिकाओं को एक CO2 इनक्यूबेटर में एक १०० मिमी संस्कृति डिश में बनाए रखने और अर्द्ध-संगम के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2में इनक्यूबेटिड ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में K110, ट्रिपसिन, और ट्रिपसिन अवरोध करनेवाला तैयार करें ।
- ध्यान से मध्यम संस्कृति पकवान से निकालें, ०.०५% ट्रिपसिन के 3 मिलीलीटर एक पिपेट का उपयोग कर जोड़ने के लिए, एक CO2 इंक्यूबेटर में पकवान प्लेस और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेने । ऊष्मायन के बाद, 10x आवर्धन पर कला-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर संस्कृति डिश की सतह से सेल टुकड़ी की जांच करें ।
नोट: अलग कोशिकाओं के आकारिकी दौर हो जाता है । यदि कोशिकाओं फैल, 5 मिनट की एक अतिरिक्त अवधि के लिए सेते । - ट्रिपसिन अवरोध करनेवाला के 3 मिलीलीटर जोड़ें और एक पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में अलग कोशिकाओं को इकट्ठा । 5 मिनट के लिए २०० x g पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं को सेंट्रलाइज ।
- छोड़ supernatant और K110 के 10 मिलीलीटर में एक पिपेट का उपयोग कर गोली फिर से निलंबित । 10x आवर्धन पर चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए कक्षों की गणना करें और K110 के साथ उचित तनुकरण द्वारा ५.० x 104 कोशिकाओं पर कोशिका सांद्रता/
- धीरे बीज संस्कृति थाली की एक अच्छी तरह से दीवार के साथ एक पिपेट का उपयोग कर के प्रत्येक में कोशिकाओं के साथ K110 मिलीलीटर की ०.१ । एक CO2 इंक्यूबेटर में संस्कृति थाली प्लेस और संकेत समय (2 ज, 1 दिन, 3 दिन) के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
नोट: जैल को सुरक्षित रखने के लिए, पिपेट की नोक को कुएं की दीवार को छूना चाहिए ।
5. व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का आकलन
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में K110 सेबेट । मिश्रण १३० μL tetrazolium नमक की, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl)-2एच टेट्राजोलियम, मोनोसोडियम नमक (wst-8), और १.३ मिलीलीटर एक पिपेट का उपयोग कर 2 मिलीलीटर ट्यूब में K110 ।
- कल्चर प्लेट को क्लीन बेंच पर ले जाएं और एक पिपेट का इस्तेमाल करते हुए K110 को धीरे से त्यागें । एक पिपेट का उपयोग करके K110 के साथ गैर-आसंन कोशिकाओं को धीरे से धोएं
- एक अच्छी तरह से एक pipette का उपयोग कर, एकCO 2 इंक्यूबेटर में संस्कृति प्लेट प्लेस और K110 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इन्सेबेट ११०
- एक साफ पीठ के लिए संस्कृति थाली हटो, एक अच्छी तरह से वातानुकूलित माध्यम के १०० μL इकट्ठा, और यह एक और ९६ की अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में चलते हैं । मापने के एक तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण ४५० एनएम (आयुध डिपो४५०) एक microplate रीडर का उपयोग कर और व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का अनुमान है ।
Representative Results
प्रकार मैं कोलेजन का उपयोग कर संस्कृति व्यंजन की सतहों के उपचार के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1में दिखाया गया है । गैर रेशेदार और तंतुक रूपों पर मनाया कोशिका morphologies क्रमशः चित्रा 2के बाईं और दाईं ओर पैनलों में प्रस्तुत कर रहे हैं । FEPE1L-8 कोशिकाओं 2 एच (ऊपरी पैनलों) और 3 दिन (कम पैनलों) के लिए सभ्य थे । Culturing के प्रारंभिक 2 एच में, कोशिकाओं का पालन किया और कोलेजन के दोनों रूपों पर फैल (चित्रा 2, ऊपरी पैनलों). तीन दिन बोने के बाद, गैर रेशेदार रूप पर कोशिकाओं के प्रसार और सेल संख्या में वृद्धि जारी (चित्रा 2, कम बाएं पैनल) । इसके विपरीत, तंतुक फार्म पर कोशिकाओं को सीमित फैल दिखाया (चित्रा 2, कम सही पैनल) । FEPE1L-8 कोशिकाओं को प्रकार मैं कोलेजन (चित्रा 3, ठोस काली रेखा, काले घेरे बंद) के गैर रेशेदार रूप पर पैदा करना जारी रखा और अनुपचारित डिश पर (चित्रा 3, बिंदीदार ग्रे लाइन, बंद ग्रे हलकों) । इसके विपरीत, कोशिकाओं फाइरिल फार्म (चित्रा 3, बिंदीदार रेखा, खुले हलकों) पर पैदा नहीं किया । चित्रा 2 और 3 चित्रा fujisaki एट अल11से संशोधित किया गया है ।
चित्रा 1 : संस्कृति डिश के योजनाबद्ध निरूपण प्रकार मैं कोलेजन के साथ इलाज सतहों । अम्लीय स्थिति के तहत, प्रकार मैं कोलेजन अणुओं गैर रेशेदार रूप (बाएँ पैनल) में एक डिश की सतह पर अधिशोषित हैं. ३७ डिग्री सेल्सियस पर तटस्थ शर्तों के तहत, प्रकार मैं कोलेजन अणुओं तंतुओं में फिर से इकट्ठा कर रहे है और जेल के रूप में बर्तन की सतह पर अधिशोषित (सही पैनल) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : FEPE1L-8 कोशिकाओं की आकारिकी । FEPE1L-8 K110 में कोशिकाओं को गैर रेशेदार रूप (10 μg/एमएल; बाएं पैनलों) या तंतुक फार्म (1 मिलीग्राम/एमएल; सही पैनलों) प्रकार मैं 2 एच (ऊपरी पैनलों) या 3 दिन (कम पैनलों) के लिए कोलेजन का उपयोग कर सभ्य थे । सफेद सलाखों से संकेत मिलता है १०० μm. चित्रा 2 Fujisaki एट अल से संशोधित किया गया है चित्रा में 1ई – एच11. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : FEPE1L-8 सेल के प्रसार । व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गैर रेशेदार रूप (काले ठोस रेखा, काले भरे हलकों) पर या प्रकार मैं कोलेजन, या अनुपचारित डिश सतहों (ग्रे बिंदीदार रेखा, ग्रे भरी हलकों) के 2 एच, 1 दिन, और 3 दिनों के लिए फाइरिल फार्म (बिंदीदार रेखा, खुले सर्कल) पर अनुमान लगाया गया । प्रयोग triplicates में प्रदर्शन किया गया और मूल्यों के रूप में दिखाया जाता है + एसडी । यह आंकड़ा Fujisaki एट अल से संशोधित किया गया है चित्रा 1J11में । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
Discussion
कुछ ECM घटक, प्रकार मैं कोलेजन सहित, तीन विवो1में आयामी संरचनाओं फार्म । इस तरह के एक त्रि-आयामी पर culturing, जेल सब्सट्रेट एक द्वि-आयामी, प्लास्टिक की सतह1,2,3,4पर से vitro में अधिक शारीरिक शर्तें प्रदान करता है । कई प्रोटोकॉल जेल संस्कृति विधि के बारे में रिपोर्ट किया गया है, जैसे प्रकार का उपयोग कर के रूप में मैं कोलेजन1,2,3,4,6,7, 11, प्रकार चतुर्थ कोलेजन14,15, और matrigel16। प्रकार मैं कोलेजन है एक अच्छी तरह से परिभाषित और व्यापक रूप से इसकी बहुतायत और हैंडलिंग में आसानी के कारण सामग्री का इस्तेमाल किया । शुद्ध प्रकार मैं कोलेजन की विशेषताएं पशु प्रजातियों पर निर्भर, उंर, और शोधन तरीकों5,17। प्रकार मैं कोलेजन एसिटिक एसिड का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है और/या proteases, जैसे पेप्सिन, papain, और proctase5,17। एसिड में घुलनशील कोलेजन अमीनो-telopeptides जारी रखता है और protease घुलनशील कोलेजन हैं cleaved अमीनो-टेलोपेप्टाइड5,17। एमिनो-telopeptides के आरक्षित लंबाई proteases के प्रकार पर निर्भर करता है, और telopeptides की उपस्थिति फाइब्रिल आकारिकी और जेल ताकत5,17को प्रभावित करता है । एसिड में घुलनशील कोलेजन तंतुओं का चिपचिपापन प्रोटीनेस-इलाज collagens से अधिक है17। इस अध्ययन में, हम एसिड घुलनशील बोवाइन प्रकार मैं कोलेजन का इस्तेमाल किया । पेप्सिन-घुलनकृत कोलेजन भी इस जेल संस्कृति प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, जेल ताकत कमजोर17है । सामग्री में इन मतभेदों सेल व्यवहार मतभेद पैदा कर सकता है, लेकिन वे वर्तमान में अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं ।
इस अध्ययन में वर्णित जेल संस्कृति प्रोटोकॉल बहुत सरल है । इस विधि के कई संशोधनों की सूचना दी गई है । Keratinocytes की संस्कृति के लिए एक संभव संशोधन तहखाने झिल्ली की नकल है । प्रकार चतुर्थ कोलेजन जैल इन विट्रो15,18में एक तहखाने झिल्ली की तरह सब्सट्रेट संरचना रखने के लिए बेहतर हो सकता है । हालांकि, एक लंबे ऊष्मायन अवधि प्रकार चतुर्थ कोलेजन जैल14,15,18की तैयारी के लिए आवश्यक है । इसके बजाय, प्रकार मैं कोलेजन जैल के साथ मिश्रण प्रकार चतुर्थ कोलेजन उपंयास संस्कृति substrates उत्पादन कर सकते है (मैं प्रकार/ इन संकर जैल संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं, जिलेटन के लिए एक कम समय की आवश्यकता होती है, और keratinocytes के लिए और अधिक तहखाने झिल्ली की तरह शर्तों उपज । प्रकार I/प्रकार चतुर्थ कोलेजन संकर जैल पर, keratinocytes जीवित रहते हैं, फार्म कालोनियों, और टर्मिनल भेदभाव19प्रेरित । इस हाइब्रिड विधि बहुमुखी अनुप्रयोगों है ।
पर जेल प्रकार मैं कोलेजन का उपयोग संस्कृति कैंसर की कोशिकाओं को प्रभावित करता है । प्रकार मैं कोलेजन के तंतुक फार्म पर, एकेटी सक्रियण और caco-2 कोशिकाओं के विकास (एक बृहदांत्र कैंसर सेल लाइन)7दबा रहे हैं । इसके अलावा, मानव मेलेनोमा कोशिकाओं के विकास फाइब्रॉल फार्म पर (M24met) G1/ इसके अलावा, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्पष्ट रूप से बढ़ स्तर murine 3t3 में मनाया जाता है-L1 तंतुक रूप पर सभ्य preadipocytes. इसके अलावा, सेल प्रसार और प्रवास के विपरीत दिशा में गैर रेशेदार और प्रकार मैं कोलेजन21के तंतुक रूपों से प्रेरित हैं ।
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
हम डॉ के सेकिगुची (प्रोटीन अनुसंधान संस्थान, ओसाका विश्वविद्यालय), डॉ एम यामाडा (प्रोटीन अनुसंधान के लिए संस्थान, ओसाका विश्वविद्यालय) के आभारी हैं, डॉ. अभिनव, शेनयांग फार्मास्युटिकल विश्वविद्यालय) और टी Hayashi (चीन-जापान चिकित्सा और फार्मास्युटिकल विज्ञान अनुसंधान संस्थान, अभिनव के Wuya कॉलेज, शेनयांग फार्मास्युटिकल विश्वविद्यालय) सहायक टिप्पणी के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
| Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
| disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
| human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
| K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
| K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
| Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
| Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
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