Summary
今回培養基板の 2 つの異なるフォームの準備のためのプロトコルを利用した I 型コラーゲン。コラーゲンの処理方法に応じて、コラーゲン分子は 2次元、非繊維状のフォームを維持するか、または立体的線維に再構築します。細胞増殖には I 型コラーゲンは線維形成によって大幅に影響を受けます。
Abstract
I 型コラーゲン、2 つの形態で存在する細胞培養の基質として有用な: 二次元非線維性フォームと立体的線維。両方のフォームは同じで準備できる I 型コラーゲン。一般に、非繊維のフォームは細胞接着と増殖を促進します。セルの多くの種類の生理学的な条件を提供する線維フォーム (ゲル)したがって、ゲル文化、薬効などの細胞の生理学的行動を調べるのに役立ちます。
研究者は、その使用目的に応じて適切な形式を選択できます。たとえば、ケラチノ サイトの場合、ゲルの文化は創傷治癒モデルとして使用されています。FEPE1L-8、ケラチノ サイト細胞株培養型の非繊維のフォームで私コラーゲン、細胞粘着を促進します。特に、表皮細胞の増殖、線維フォーム非線維性フォームより遅い。準備のためのプロトコルは細胞培養、単純な I 型コラーゲンと実験のニーズに応じて幅広い用途があります。
Introduction
間質の結合組織を構成する三次元異種組成のタンパク質網目主, I 型コラーゲン線維1。コラーゲン線維は細胞1,2,3の足場として重要な役割を果たすし、他の細胞外マトリックス (ECM) 蛋白質3対話します。生体外で, 別のフォーム タイプ I コラーゲンを処理によって細胞培養の基板として使用することができる方法1,2,3,4。酸性条件下でタイプ I コラーゲンは非繊維様式5を維持します。細胞接着と増殖6,7を促進するフォームを非線維性培養皿の表面をコーティングします。生理的な pH や温度の変化で I 型コラーゲン分子立体構造1,2,3,4,を有するゲルを形成する繊維に再構築5,6,7,8。いくつかの重要の違い線維と非繊維状タイプ私コラーゲン、剛性マトリックスと文化1セルによる ECM 成分の復興の効率などを含むがあります。剛性マトリックスは細胞文化1, 9の最も研究の規制要因の一つです。ただし、基板と電池の間の複雑な相互作用は明らか。細胞と環境要因間の複雑な相互作用を調べるシンプルなシステムが便利です。コラーゲンの 2 つの異なる形式の携帯電話の動作の比較は環境要因の影響を簡素化に役立つかもしれない。私の使用、種類の異なるフォームの目的に応じてコラーゲン選択的に使用できます。通常、表皮基底膜と接触しているではなく I 型コラーゲン。しかし、創傷治癒、皮膚の結合組織にケラチノ サイトを移動中に、増殖、10の傷を癒します。
最近では、細胞外カルシウム濃度はケラチノ サイトの増殖に重要なデモンストレーションを行った線維状培養系を用いた細胞タイプ I コラーゲン真皮結合組織11を模倣しました。FEPE1L 8 が線維状に培養した表皮細胞ライン I 型コラーゲン、細胞の形状が丸いと彼らの増殖が細胞外カルシウム濃度 30 μ M11で停止していた。カルシウム濃度は 1.8 mM に増加した、細胞増殖は回復11をだった。セルの両方のカルシウム濃度 (30 μ M と 1.8 mM) の下で育った線維フォーム上で培養したときの外因性カルシウム濃度に対する感受性が高かったに対し非線維性フォーム11、培養した場合。FEPE1L 8 がヒトパピ ローマ ウイルスの型 16 変形遺伝子 E6 のトランスフェクションによって生成され、ひと子宮頸癌、非発癌性から E7 正常ケラチノ サイトのような潜在的な差別化と無制限の増殖を抑制します。12,13。FEPE1L 8 セルは、K110 タイプ II を含む添加剤サプリメント K-1 (K110)6ケラチノ サイトの特定のメディアのいくつかの種類を使用して管理できます。ここでは、非繊維のひと細胞株の培養のプロトコルについて述べるし、線維の形態 I 型コラーゲン。
Protocol
1. 表皮細胞培養培地の調製
注: は、無菌条件の下ですべての手順を実行します。
- ペニシリン-ストレプトマイシンの K110 タイプ II 媒体 (K110) の 500 mL に添加サプリメント K-1 の 10 mL のピペットを使用して 5 mL を追加します。
2. 線維状の準備 I 型コラーゲン
注: は、無菌条件下でステップ 2.6 までの手順を実行します。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS (-))、脱イオン水、コラーゲン、96-well 培養プレート、氷の上の空の 2 mL チューブ × 10 を維持します。
注: 線維と非線維性フォームを準備するのに同じプレートを使用しないでください。 - ピペットを使用して空の 2 mL チューブに 1.12 mL の脱イオン水を追加します。ピペットを使用して 2 mL チューブに脱イオン水に 200 μ L の 10 x PBS (-) を追加します。数回チューブを軽く振る。
- コラーゲンの 0.66 mL をピペットを使用して 2 mL チューブに追加します。慎重かつ迅速には、チューブを数回振る。
注: は、気泡の可能な限りのソリューションを避けてください。使用する前にすぐにコラーゲン溶液を準備します。 - 96 ウェル培養プレートの各ウェルにステップ 2.3 からコラーゲン溶液 100 μ L を注ぐ。左右の動きからの培養プレートを軽く振る。
注: は、コラーゲン溶液と井戸の表面全体をカバーします。ソリューションが表面全体をカバーしていない場合は、ピペット チップを使用して、ソリューションを普及します。気泡の可能な限りのソリューションを避けてください。 - CO2のインキュベーターで培養プレートを配置し、, 1 h. チェック コラーゲンのゲル化の 37 ° C で培養プレートをクリーン ベンチに移動します。
注: は、培養プレートを傾けることによってゲル化を確認します。 - 場所文化 CO2インキュベーターでプレートし、, 1 h. クリーン ベンチへの培養プレートの 37 ° C で、井戸の壁に沿ってピペットを使用してゲルの K110 の 150 μ L をそっと注ぐ。細胞培養の前にそっと破棄、K110 ピペットを使用しています。
注: ゲルを保護するためにピペットの先端は井戸の壁をタッチする必要があります。
3. 非繊維状の準備 I 型コラーゲン
注: は、無菌条件の下ですべての手順を実行します。
- 1.2 mL 1 mM 塩酸 (HCl) 1.5 mL チューブにコラーゲンの 4 μ L を追加し、ピペットを使用して軽く混ぜます。
注: 使用する前にすぐにコラーゲンを準備します。コラーゲンを保ち、使用時まで冷蔵して HCl。 - ピペットを使用して 96 ウェル培養プレートの各ウェルに 100 μ L のコラーゲンを注ぐ。運動し 1 時間室温で孵化させなさい左の培養プレートを軽く振る。
注: は、井戸の表面全体がソリューションで覆われていることを確認します。 - 、孵化後コラーゲン液を捨て、PBS (-) 2 回ピペットを使用しての洗浄します。
- 1% ウシ血清アルブミン/PBS (-) (1 %bsa) 96 ウェル培養プレートの井戸までの 150 μ L を注ぐと細胞培養の前に 1 時間室温で孵化させなさい、1 %bsa を破棄します。
注: は、井戸の表面全体がソリューションで覆われていることを確認します。
4. FEPE1L 8 細胞の培養
注: は、無菌条件の下ですべての手順を実行します。
- 100 mm の K110 で FEPE1L 8 セル CO2インキュベーターで皿を文化し、37 ° C、5% CO2、半合流で維持します。
- K110、トリプシン、トリプシン ・ インヒビターの 37 ° C の水浴中準備します。
- 慎重に培養皿からメディアを取り出して、ピペットを使用して 0.05% トリプシンの 3 mL を加える、CO2インキュベーターに皿を置き、5 分の 37 ° C で孵化させなさい。インキュベーション後、10 倍の倍率で位相差顕微鏡を用いた培養皿の表面の細胞の剥離を確認します。
注: 独立した細胞の形態になるラウンド。細胞が広がっている場合は、5 分の追加期間インキュベートします。 - トリプシン ・ インヒビターの 3 mL を追加し、ピペットを使用して 15 mL 遠心管中の剥離細胞を収集します。5 分間 200 x g で 15 mL 遠心管の細胞を遠心します。
- 上澄みを廃棄し、再 K110 の 10 mL のピペットを使用してにペレットを中断します。10 倍の倍率で位相差顕微鏡を使用してセルをカウントし、K110 適切な希釈による細胞濃度 5.0 x 104セル/mL を準備します。
- 優しく K110 井戸の壁に沿ってピペットを使用して培養プレートの各ウェルに細胞を 0.1 mL をシードします。CO2インキュベーターで培養プレートを置き、37 ° C で示された時間 (2 時間、1 日、3 日) 孵化させなさい。
注: ゲルを保護するためにピペットの先端は井戸の壁をタッチする必要があります。
5. 生菌数の推定
- K110 37 ° C の水浴中に孵化させなさいテトラゾリウム塩、2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2Hテトラゾリウム、ナトリウム塩 (WST-8)、K110 の 1.3 mL をピペット 2 mL チューブにミックス 130 μ L。
- 培養プレートをクリーン ベンチに移動し、優しく破棄、K110 ピペットを使用しています。優しく洗い流す K110 と非付着性のセル ピペットを使用して
- よくピペットを使用して各 WST 8 混ぜ K110 の 110 μ L を追加、CO2インキュベーターで培養プレートを配置、37 ° C 2 時間で孵化させなさい。
- 培養プレートをクリーン ベンチに移動、各ウェルから馴化培地の 100 μ L を収集し、別の 96 ウェル培養プレートのウェルに移動します。450 の波長で吸光度を測定 nm (外径450) マイクロ プレート リーダーおよび実行可能なセルの数の見積もりを使用しています。
Representative Results
使用して培養皿の表面の治療の概略図は I 型コラーゲンが図 1に描かれています。非線維と線維の形態で観察された細胞の形態はそれぞれ図 2の左サイドと右パネルに表示されます。2 h (上部パネル) と 3 日 (下のパネル) FEPE1L 8 細胞を培養されました。培養初期の 2 h で細胞は付着し、コラーゲン (図 2、上部のパネル) の両方のフォームの上に広げ.播種後 3 日間非線維性フォームのセルは広がるし、細胞数増加 (図 2の左下パネル) を続けた。対照的に、線維フォームの細胞は限られた拡散 (図 2、右下のパネル) を示した。FEPE1L 8 細胞はコラーゲン (図 3、黒の実線は、黒い丸を閉じた状態) に型の非繊維のフォームで増殖する継続し、未処理の皿の表面 (図 3、灰色の点線をすれば、閉じた灰色の円)。対照的に、細胞は、線維の形 (図 3点線、白抜きの円) には増殖しなかった。図 2と図 3は、藤崎ら11から変更されています。
図 1: 培養皿表面の図式的な表示はマイク コラーゲンの種類で処理します。酸性条件下で I 型コラーゲンの分子が吸着した非繊維形 (左) の皿の表面に。37 ° C での中性条件下で I 型コラーゲンの分子が組み立てには線維および吸着ゲル形 (右側のパネル) で料理の表面に。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: FEPE1L 8 細胞の形態。K110 FEPE1L 8 細胞培養非線維性のフォームを使用して (10 μ G/ml; 左パネル) または線維フォーム (1 mg/mL; 右パネル) のタイプ I コラーゲン 2 h (上部パネル) または 3 日 (下のパネル)。白いバーを示す 100 μ m.図 2で変更されている藤崎らから図 1のE-H11。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: FEPE1L 8 細胞の増殖します。非線維性フォーム (黒実線、黒の塗りつぶされた円) で実行可能なセルの数を推定したまたは線維の形態 (点線, 白丸) I 型コラーゲン、または未処理のパラボラ面 (灰色の点線、灰色の黒丸) 2 h、1 日と 3 日。トリプリケートで実験を行なった、手段 + の SD として値が表示されます。この図は、図 1J11藤崎らから変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
など、いくつかの ECM コンポーネント I 型コラーゲン、フォームの三次元構造体内の1。このような 3次元培養、ゲル基板は二次元、プラスチック表面に vitroよりもより生理的条件を提供します1,2,3,4。ゲル培養法に関する多数のプロトコルが報告されている, 使用するなど I 型コラーゲン1,2,3,4,6,7、マトリゲル16IV 型コラーゲン14,15、 11。I 型コラーゲンは明確に定義され広く使用されている素材、その豊かさと取り扱いの容易さのため。精製タイプの特徴私コラーゲンは、動物種、年齢、および浄化方法5,17に依存します。I 型コラーゲンは、酢酸やペプシン、パパイン、プロクターゼ5,17などのプロテアーゼを使用して精製することができます。酸可溶性コラーゲンは、アミノ酸テロペプチドとプロテアーゼ可溶性コラーゲンは、劈開アミノ テロペプチド5,17を保持します。アミノ テロペプチドの予約の長さ、プロテアーゼの種類に依存してゲル強度5,17テロペプチドの存在線維の形態に影響を与えます。酸可溶性コラーゲン細線維の粘度は、プロテアーゼ処理コラーゲン17のより大きいです。この研究では、酸可溶性を用いてウシ型コラーゲン。ペプシン可溶化コラーゲンはこのゲル文化プロトコルにも使用できます。しかし、ゲル強度は弱い17です。材料のこれらの相違はセル動作の違いを引き起こす可能性が、彼ら現在よく理解されていません。
本研究で記述されているゲル文化プロトコルは非常に簡単です。このメソッドの多くの変更が報告されています。ケラチノ サイトの文化の 1 つの可能な変更は、基底膜を模倣することです。IV 型コラーゲン ・ ゲル培養15,18で基底膜のような基板構造を維持するより良いかもしれません。ただし、長い潜伏期間は、タイプ IV コラーゲン ゲル14,15,18の準備のため必要です。代わりに、IV 型コラーゲンとの混合タイプ I コラーゲン ・ ゲル培養基質を作り出すことができる (タイプ I/タイプ IV コラーゲン複合ゲル)19。これらのハイブリッドのゲル、ゲル化に必要な短い時間、処理し易い、ケラチノ サイトのより多くの基底膜のような条件をもたらします。種/IV 型コラーゲン複合ゲル、ケラチノ サイト生き残るためのコロニーを形成、分化19を誘発します。このハイブリッド法には、多彩なアプリケーションがあります。
I 型を用いたゲル上培養コラーゲンががん細胞に影響します。線維状の I 型コラーゲン、Akt の活性化、caco-2 細胞 (大腸癌細胞株) の成長が抑制された7。さらに、ひと悪性黒色腫細胞 (M24met) 線維フォーム上の成長は G1/S チェックポイント20で逮捕されました。さらに、線維フォーム上で培養したマウス 3t3-l1 脂肪前駆細胞における活性酸素のレベルを著しく増加が観察されます。さらに、反対の方向で非繊維による細胞増殖および移行を刺激、線維状タイプ I コラーゲン21。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
博士関口 (大阪大学蛋白質研究所) に感謝しております山田昌博士 (大阪大学蛋白質研究所)、博士隆池島 (中国日本研究所の医療、薬学、Wuya の大学技術革新、瀋陽薬科大学) と有用なコメントのための林孝信 (中国日本研究所の医療、薬学、Wuya イノベーション大学瀋陽薬科大学)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
| Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
| disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
| human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
| K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
| K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
| Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
| Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
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