Summary
여기, 우리는 두 가지 다른 형태의 문화 기판의 준비에 대 한 프로토콜 제시 활용 유형 I 교원 질. 콜라겐, 처리 하는 방법을 따라 콜라겐 분자 2 차원, 비-섬유 형태를 유지 하거나 3 차원, fibril 형태로 재조립 합니다. 세포 증식에 유형 I 교원 질 크게 fibril 형성에 의해 영향을.
Abstract
유형 I 교원 질, 두 가지 형태로 존재 하는 세포 배양을 위한 기질으로 유용: 2 차원, 비-섬유 형태와 3 차원, fibril 형태. 두 폼 같은 준비 될 수 있다 유형 I 교원 질. 일반적으로, 비-섬유 양식 세포 접착 및 확산을 촉진합니다. Fibril 형태 (젤) 셀;의 많은 종류에서 더 많은 생리 적 조건 제공 따라서, 젤 문화 셀, 약물 효능 등의 생리 적 행동을 조사 하기 위한 유용 합니다.
연구원은 그것의 사용의 목적에 따라 적절 한 형태를 선택할 수 있습니다. 예를 들어 keratinocytes의 경우에 젤 문화 모델을 치유 하는 상처로 사용 되었습니다. FEPE1L-8, keratinocyte 셀 라인 교양 형식의 비 섬유 형태에 나 콜라겐, 세포 접착을 촉진. 특히, keratinocyte 확산이 느립니다 fibril 형태에 비 섬유질 형태 보다. 준비에 대 한 프로토콜 유형 I 교원 질 세포 배양은 간단 하 고 실험적인 요구에 따라 다양 한 응용 프로그램.
Introduction
중간 결합 조직을 구성 하는 3 차원 단백질 채널 이기종 구성의 주로 구성 된 형식의 나 콜라겐 소1. 교원 질 소 셀1,2,3 에 대 한 비 계 서 핵심 역할을 하 고 다른 세포 외 기질 (ECM) 단백질3와 상호 작용. 생체 외에서, 다른 형태의 유형 I 교원 질 처리에 따라 세포 배양에 대 한 기판으로 사용할 수 있습니다1,2,,3방법4. 산 성 조건 하에서 유형 I 콜라겐 유지 비-섬유 양식5. 코팅 비 섬유 형태와 문화 요리 표면 세포 접착 및 확산6,7촉진 합니다. 유형 I 교원 질 분자 생리 적 pH와 온도, 3 차원 구조1,2,,34, 를 가진 젤을 형성 하는 소에 재조립 5,6,,78. 몇 가지 중요 한 차이점 fibril 비 섬유 형태의 유형 사이 나 콜라겐 매트릭스 강성과 문화1동안 ECM 구성 요소 셀으로의 개조의 효율성을 포함 하 여 있다. 매트릭스 강성 셀 문화1, 9의 가장 공부 규제 요인 중 하나입니다. 그러나, 기질과 세포 사이 복잡 한 상호 작용을 명확히 해야 남아 있다. 셀과 환경 요인 간의 복잡 한 상호 작용을 검사 하는 간단한 시스템이 유용 합니다. 콜라겐의 두 가지 형태에 세포 행동의 비교는 환경 요인의 영향을 단순화 하는 데 도움이 있습니다. 내가 다른 형태의 유형, 그들의 사용의 목적에 따라 콜라겐 선택적으로 사용할 수 있습니다. 일반적으로, keratinocytes 지하실 멤브레인와 접촉 하지만 유형 I 교원 질 하지. 그러나, 상처 치유, 동안 keratinocytes 피부 결합 조직으로 이동, 확산, 그리고10의 상처 치유.
최근에, 우리는 세포 외 칼슘의 농도 keratinocyte의 확산에 대 한 중요 한 증명 fibril 형태의에 문화 시스템을 사용 하 여 라인 셀 유형 I 교원 질 피부 결합 조직11을 흉내 낸. FEPE1L-8의 fibril 형태에 경작 되었다 keratinocyte 셀 라인 유형 I 교원 질 때 셀의 모양을 라운드 되었고 그들의 proliferations는 30 μ M11의 세포 외 칼슘 농도에서 중단 했다. 1.8 m m 칼슘 농도 증가, 세포 성장을 복구 된11했다. 셀 두 칼슘 농도 (30 μ M, 1.8 m m)에서 성장 했다 그들이 때 fibril 양식에 양식 exogenous 칼슘 농도에 더 민감한 반면 비-섬유 양식11, 경작 하는 경우. FEPE1L-8 papillomavirus 유형 16 변형 유전자 E6 transfection을 통해 생성 된 및 E7 인간의 자 궁 경부 암, tumorigenic에서 정상적인 keratinocytes 같은 잠재적인 제한 된 차별화 된 무제한 확산을 억제 12,13. FEPE1L-8 셀 K110 유형-II를 포함 하 여 추가 보완 K-1 (K110)6keratinocyte 특정 매체의 어떤 종류를 사용 하 여 유지할 수 있습니다. 여기, 우리는 비-섬유에 인간의 keratinocyte 셀 라인의 문화 프로토콜을 설명 하 고 fibril 형태의 유형 I 교원 질.
Protocol
1입니다. 준비 keratinocyte 문화 매체의
참고: 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
- 페니실린-스와는 피 펫을 사용 하 여 첨가제 K110 유형-II 매체 (K110)의 500 mL를 보충 K-1의 10 mL 5 mL를 추가 합니다.
2. 준비의 fibril 형태의 유형 I 교원 질
참고: 무 균 조건 하에서 2.6 단계까지 절차를 수행 합니다.
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS (-)), 이온된 수, 콜라겐, 96 잘 문화 플레이트, 그리고 얼음에 빈 2 mL 튜브 x 10을 유지.
참고: fibril 비 섬유 형태를 준비 하는 같은 접시를 사용 하지 마십시오. - 피 펫을 사용 하 여 빈 2 mL 튜브에 이온된 수의 1.12 mL를 추가 합니다. 10 x PBS (-)의 200 µ L를 피 펫을 사용 하 여 2 mL 튜브에 이온된 수를 추가 합니다. 부드럽게 튜브 여러 번 흔들어.
- 피 펫을 사용 하 여 2 mL 튜브에 콜라겐의 0.66 mL를 추가 합니다. 빠르고 부드럽게 흔들어 튜브 여러 번.
참고: 가능한 솔루션에 거품 형성을 피하십시오. 즉시 사용 하기 전에 콜라겐 솔루션을 준비 합니다. - 96 잘 문화 접시의 각 음에 2.3 단계에서 콜라겐 솔루션의 100 µ L를 붓는 다. 부드럽게 오른쪽 모션을 왼쪽에 문화 접시를 흔들.
참고: 콜라겐 솔루션 우물의 전체 표면을 커버. 솔루션 전체 표면을 커버 하지 않는, 피 펫 팁을 사용 하 여 솔루션을 전파. 가능한 솔루션에 거품 형성을 하지 마십시오. - 장소 문화와 CO2 인큐베이터에 접시 1 h. 위해 37 ° C에서 품 어 콜라겐 겔 화를 확인 하 고 깨끗 한 벤치에 문화 접시를 이동.
참고: 문화 접시를 기울이기로 겔 화를 확인 합니다. - 부드럽게 잘, 장소 문화와 CO2 인큐베이터에 접시 1 h. 이동 문화 접시 깨끗 한 벤치를 37 ° C에서 품 어의 벽을 따라 피 펫을 사용 하 여 젤에 K110의 150 µ L를 붓는 다. 세포 배양 전에 부드럽게는 K110 삭제는 피 펫을 사용 하 여.
참고:는 젤을 보호 하는 피 펫의 끝 우물의 벽을 터치 한다.
3. 준비의 비 섬유 형태의 유형 I 교원 질
참고: 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
- 1.5 mL 튜브에 1 m m 염 산 (HCl)의 1.2 mL에 콜라겐의 4 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합 한 피 펫을 사용 하 여.
참고: 콜라겐 즉시 사용 하기 전에 준비. 콜라겐과 HCl 사용의 시간까지 냉장 하십시오. - 피 펫을 사용 하 여 96 잘 문화 판의 각 우물에 콜라겐 100 µ L를 붓으십시오. 부드럽게 1 시간 실 온에서 품 어 모션 마우스 오른쪽 왼쪽에 문화 접시를 흔들.
주: 확인 우물의 전체 표면 솔루션으로 덮여 있다. - 부 화 후 콜라겐 솔루션을 삭제 하 고 PBS (-)를 피 펫을 사용 하 여 두 번으로 우물을 씻어.
- 1% 소 혈 청 알 부 민/PBS (-) (1 %BSA) 96 잘 문화 접시의 우물을의 150 µ L를 부 어 1 헤 셀 문화 이전에 대 한 실 온에서 품 어, 1 %BSA 삭제.
주: 확인 우물의 전체 표면 솔루션으로 덮여 있다.
4입니다. FEPE1L-8 세포의 문화
참고: 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
- K110 100 m m에서 FEPE1L-8 셀 문화 공동2 인큐베이터에 접시와 37 ° C, 5% CO2, 반 confluency에서 incubated 유지 합니다.
- K110, 트립 신, 트립 신 억제제 37 ° c.에 물 욕조에 준비
- 조심 스럽게 문화 접시에서 매체를 제거, 추가 피 펫을 사용 하 여 0.05 %trypsin 3 mL, CO2 인큐베이터에 접시를 놓고 하 고 5 분 동안 37 ° C에서 품 어. 부 화, 후 10 배 확대에 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 문화 접시의 표면에서 셀 분리를 확인 합니다.
참고: 분리 된 세포의 형태는 라운드 됩니다. 만약 셀 확산, 5 분의 추가 기간 동안 품 어. - 트립 신 억제 물 3 mL를 추가 하 고는 피 펫을 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브에서 분리 된 세포를 수집 합니다. 5 분 동안 200 x g에서 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 원심
- 상쾌한 삭제 하 고 다시는 피 펫을 사용 하 여 K110 10 mL에 펠 릿을 일시 중단. 10 배 확대에 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀을 계산 하 고 셀 농도 104 셀/mL x 5.0에 K110와 적절 한 희석에 의해 준비.
- 부드럽게 셀에 우물의 벽을 따라 피 펫을 사용 하 여 문화 판의 각 잘 K110의 0.1 mL 씨. CO2 배양 기에서 문화 접시를 놓고 지정된 시간 (2 시간, 1 일, 3 일)에 대 한 37 ° C에서 품 어.
참고:는 젤을 보호 하는 피 펫의 끝 우물의 벽을 터치 한다.
5. 가능한 셀 수의 추정
- K110 37 ° c.에 물 목욕에 품 어 Tetrazolium 소금, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, 글루타민 (서 부 표준시-8), 소금과 피 펫을 사용 하 여 2 mL 튜브에 K110의 1.3 mL의 믹스 130 µ L.
- 클린 벤치를 문화 접시를 이동 하 고 부드럽게는 K110 삭제는 피 펫을 사용 하 여. 부드럽게 멀리 세척 K110와 비 부착 한 세포를 피 펫을 사용 하 여
- K110의 110 µ L 혼합 서 부 표준시-8 잘 사용 하 여 각는 피 펫에 추가, 문화 접시 CO2 배양 기에 놓고 2 h 37 ° C에서 품 어.
- 깨끗 한 벤치에 문화 접시를 이동, 각 우물에서 조절된 하는 매체의 100 µ L를 수집 하 고 다른 96 잘 문화 격판덮개의 우물으로 이동. 450의 파장에서 흡 광도 측정 nm (OD450) microplate 리더와 예상 가능한 셀 수를 사용 하 여.
Representative Results
문화 요리를 사용 하 여 표면 처리의 도식 표현 유형 I 콜라겐은 그림 1에 표시 된. 비 섬유 및 fibril 양식에 관찰 세포 형태학 각각 그림 2의 왼쪽 및 오른쪽 패널에 표시 됩니다. 2 h (상위 패널)과 3 일 (낮은 패널) FEPE1L-8 세포 배양 했다. 경작의 초기 2 h, 셀 준수 하 고 콜라겐 (그림 2, 상단 패널)의 두 형태에 확산. 시드, 후 3 일 비 섬유 형태에 셀 확산과 세포 수 증가 (그림 2, 하단 왼쪽된 패널)을 계속 했다. 반면, fibril 형태에 셀 제한 확산 (그림 2, 낮은 오른쪽 패널) 보여주었다. FEPE1L-8 세포 나 콜라겐 (그림 3, 검은 실선, 폐쇄 검은 동그라미) 타입의 비 섬유 형태에 증식을 계속 고 치료 접시에 표면 (그림 3, 회색 선, 닫힌된 회색 원이 점선). 반면, 셀 fibril 형태 (그림 3, 점선, 오픈 서클)에 확산 되지 않았다. 그림 2 및 그림 3 후지사키 외11에서 수정 되었습니다.
그림 1 : 문화 요리 표면의 도식 표현 치료 유형 나 콜라겐. 산 성 조건 입력 난 콜라겐 분자 흡착 비 섬유 형태로 (왼쪽된 패널) 접시의 표면에. 37 ° C에서 중립 조건 입력 난 콜라겐 분자는 소로 재조 립 하 고 흡착 젤 형태로 (오른쪽 패널)의 표면에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : FEPE1L-8 셀의 형태. FEPE1L-8 셀 K110 비 섬유 형태를 사용 하 여 경작 했다 (10 µ g/mL; 왼쪽된 패널) 또는 fibril 양식 (1 mg/mL; 오른쪽 패널)의 유형 I 교원 질 2 h (상위 패널) 또는 3 일 (낮은 패널). 흰색 막대 표시 100 µ m. 그림 2 수정 되었습니다 후지사키 외에서 그림 1E-H11에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : FEPE1L-8 셀의 확산. 실행 가능한 세포의 수 비-섬유 양식 (검은 실선, 채워진된 검은 동그라미)에 견적 되었다 또는 fibril의 형태 (점선, 오픈 원) 나 콜라겐, 또는 입력 치료 접시 표면 (회색 점선, 회색 채워진된 동그라미) 2 h, 1 일, 그리고 3 일. Triplicates에서 실험 수행 및 값 의미 + sd.로 표시 됩니다. 이 그림은 그림 1J11에 후지사키 외에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
포함 한 일부 ECM 구성 요소 유형 I 교원 질, 양식 3 차원 구조 생체 조건1. 에 같은 3 차원 배양, 젤 기판 2 차원, 플라스틱 표면에 더 많은 생리 적 조건 보다 vitro 제공1,2,,34. 젤 문화 방법에 관한 수많은 프로토콜 보고 되었습니다, 그리고 유형 I 교원 질1,2,,34,6,7, 사용 하 여 11,15, 유형 IV의 콜라겐14,및 Matrigel16. 유형 I 그것의 풍부 및 취급의 용이성 때문에 콜라겐은 잘 정의 되 고 널리 사용 소재. 정제 타입의 특징 나 콜라겐 동물 종, 나이, 및 정화 방법5,17에 따라 달라 집니다. 유형 I 콜라겐 아세트산 및 프로 테아 제, 펩 신, papain, 및 proctase5,17등을 사용 하 여 순화 될 수 있다. 산-수용 성 콜라겐 아미노 telopeptides 및 프로 테아 제-수용 성 콜라겐은 쪼개진된 아미노 telopeptides5,17유지 합니다. 아미노-telopeptides 예약된 기간 프로 테아 제, 종류에 따라 다릅니다 및 telopeptides의 존재 fibril 형태에 영향을 미치는 젤 힘5,17. 산-수용 성 콜라겐 소의 점도 효소 처리 collagens17의 그것 보다 큽니다. 이 연구에서 우리는 산 성 사용 소 유형 I 교원 질. 펩 신 solubilized 콜라겐이 젤 문화 프로토콜;에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 젤 강도가 약한17입니다. 재료에 이러한 차이 셀 행동 차이 발생할 수 있습니다 하지만 그들은 현재 잘 이해 되지.
이 연구에서 설명 젤 문화 프로토콜은 매우 간단 합니다. 이 방법의 많은 수정 보고 되었습니다. Keratinocytes의 문화에 대 한 한 가지 가능한 수정 지하실 멤브레인을 모방 하는 것입니다. 유형 IV 교원 질 젤 시험관15,18에 지하실 막 같은 기판 구조를 유지 하는 수 있습니다. 그러나, 긴 잠복기는 종류 IV 콜라겐 젤14,,1518의 준비를 위해 필요 합니다. 대신, 유형 IV 교원 질과 혼합 유형 I 교원 질 젤 소설 문화 기판 생성할 수 있다 (유형 I / IV 콜라겐 하이브리드 젤 타입)19. 이러한 하이브리드 젤 쉽게 처리, 겔 화, 짧은 시간 필요 하 고 항복 keratinocytes에 대 한 더 많은 지하실 막 같은 조건. 에 유형 I/유형 IV 교원 질 하이브리드 젤, keratinocytes 생존, 식민지, 양식과 터미널 차별화19유도. 이 하이브리드 메서드는 다양 한 응용 프로그램.
젤에 문화를 사용 하 여 유형 I 교원 질에 영향을 미치는 암 세포. fibril 형태에서 유형 I 교원 질, Akt 활성화 및 Caco-2 셀 (결 장 암 세포 선)의 성장을 억제7. 또한, fibril 형태에 인간 흑색 종 세포 (M24met)의 성장은 G1/S 검사점20에서 체포 됩니다. 또한, 반응성 산소 종의 현저 하 게 증가 시킨된 수준 murine 3T3-L1 preadipocytes fibril 양식에 양식에서 관찰 된다. 또한, 세포 증식 및 비-섬유에 의해 반대 방향으로 자극 하 고 fibril 형태의 유형 I 교원 질21.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 감사 닥터 K. 구치 (단백질 연구소, 오사카 대학), 박사 M. 야마다 (단백질 연구소, 오사카 대학), 박사 T. Ikejima (중국-일본 연구 연구소의 의학 및 약 학, Wuya의 대학 혁신, 심 양 약과 대학)와 토니 하 야 시 (중국-일본 연구 연구소의 의료 및 약 제 과학, Wuya를 대학 혁신의 심 양 약과 대학) 도움이 의견에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
| Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
| disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
| human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
| K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
| K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
| Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
| Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
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