Summary
Här presenterar vi ett protokoll för beredning av två olika former av kultur substrat utnyttja typ I-kollagen. Beroende på hur hanteras kollagen, kollagen molekyler antingen behålla tvådimensionell, fiberfrämmande form eller sätta ihop till tredimensionell, fibrill form. Cellproliferation på typ I-kollagen påverkas drastiskt av fibrillcellulosa bildandet.
Abstract
Typ I-kollagen, användbar som ett substrat för cellodling, finns i två former: den tvådimensionella, fiberfrämmande formen och tredimensionella, fibrill form. Båda formerna kan förberedas med samma typ I-kollagen. I allmänhet främjar formuläret fiberfrämmande celladhesion och spridning. Fibrill form (gels) ger mer fysiologiska förhållanden i många typer av celler. gel kultur är därför användbar för att undersöka fysiologiska beteenden av celler, såsom läkemedlet effekt.
Forskare kan välja lämplig form enligt ämna av dess användning. Till exempel när det gäller keratinocyter, har på-gel kultur använts som en modell för sårläkning. FEPE1L-8, en keratinocyter cellinje odlade på fiberfrämmande form av typ I kollagen, främja celladhesion. Särskilt, är keratinocyter spridning långsammare i formuläret fibrill än fiberfrämmande form. Protokoll för beredning av typ I-kollagen för cellodling är enkla och har breda tillämpningar beroende experimentella behov.
Introduction
Interstitiell bindväv består av en tredimensionell protein meshwork av heterogena sammansättning, huvudsakligen består av typ I kollagen fibriller1. Kollagen fibriller en nyckelroll som en byggnadsställning för celler1,2,3 och interagera med andra extracellulär matrix (ECM) proteiner3. In vitro, olika former av typ I kollagen kan användas som substrat för cellodling beroende på hantering metod1,2,3,4. Under sura förhållanden, typ I kollagen underhåller det fiberfrämmande form5. Beläggning på ytan av kultur rätter med formuläret fiberfrämmande främjar cell adhesion och spridning6,7. Vid Fysiologiskt pH och temperatur, typ I-kollagen molekyler ihop till fibriller som bildar geler som har en tredimensionell struktur1,2,3,4, 5,6,7,8. Det finns flera viktiga skillnader mellan fibrill och fiberfrämmande former av typ I kollagen, inklusive matrix stelhet och effektivitetsvinsterna av återuppbyggnaden av ECM komponenter av celler under kultur1. Matrix stelhet är en av de mest studerade reglerande faktorerna av cell kultur1, 9. De komplexa interaktioner mellan substrat och celler återstår dock klargöras. För att undersöka de komplexa interaktioner mellan celler och miljöfaktorer, är ett enkelt system användbart. Jämförelse av cellulära beteendet på två olika former av kollagen kan bidra till att förenkla effekten av miljöfaktorer. Beroende på syftet med deras användning, olika former av typ jag kan kollagen användas selektivt. Normalt keratinocyter är i kontakt med basalmembranet men inte med typ I-kollagen. Dock under sårläkning, keratinocyter flytta till dermal connective silkespapper, föröka sig och läka de sår10.
Nyligen har vi visat att koncentrationen av extracellulära kalcium är viktigt för spridningen av keratinocyter linje celler med hjälp av kultur-systemet på fibrill form av typ I-kollagen härma dermal connective silkespapper11. När keratinocyter cell linjen FEPE1L-8 var odlade på fibrill form av typ I-kollagen, formen på cellerna var rund och deras proliferations stoppades vid en extracellulär kalciumkoncentration på 30 μM11. När kalcium koncentrationen ökades till 1,8 mM, var celltillväxt återvunna11. Cellerna växte under både kalcium koncentrationer (30 μM och 1,8 mM) när odlade på fiberfrämmande formulär11, medan de var mer känsliga för exogena kalcium koncentrationen när odlade i formuläret fibrill. FEPE1L-8 genererades genom transfection med papillomvirus typ 16 omvandla generna E6 och E7 från human cervical cancer, icke-tumörframkallande, hämma obegränsad spridning med begränsad differentiering potentiella som normala keratinocyter 12,13. FEPE1L-8 celler kan bibehållas med hjälp av vissa typer av keratinocyter specifika medium, inklusive K110 typ-II med additiv komplettera K1 (K110)6. Här beskriver vi protokollet kultur av mänskliga keratinocyter cell linjen på den fiberfrämmande och fibrill former av typ I-kollagen.
Protocol
1. beredning av keratinocyter odlingsmedium
Obs: Utför alla procedurer under aseptiska förhållanden.
- Tillsätt 5 mL av penicillin-streptomycin och 10 mL av additiv tillägg k-1 500 ml K110 typ II medium (K110) med pipett.
2. beredning av fibrillcellulosa form av typ I-kollagen
Obs: Utför procedurer tills steg 2,6 under aseptiska förhållanden.
- Håll 10 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS (-)), avjoniserat vatten, kollagen, en platta med 96 brunnar kultur och en tom 2-mL-röret på is.
Obs: Använd inte samma platta för att förbereda fibrill och fiberfrämmande former. - Lägga till 1,12 mL avjoniserat vatten i ett tomt 2 mL rör med pipett. Tillsätt 200 µL 10 x PBS (-) i avjoniserat vatten i 2 mL röret med pipett. Skaka försiktigt röret flera gånger.
- Lägga till 0.66 mL av kollagen i 2 mL röret med pipett. Snabbt och försiktigt skaka röret flera gånger.
Obs: Undvik bubbla bildandet i lösningen så mycket som möjligt. Förbereda kollagen lösningen omedelbart före användning. - Häll 100 µL av kollagen lösningen från steg 2,3 till varje brunn av 96 brunnar kultur plattan. Skaka försiktigt kultur plattan i en vänster till rätt rörelse.
Anmärkning: Täck hela ytan av brunnarna med kollagen lösningen. Om lösningen inte täcker hela ytan, sprida lösningen med en pipettspetsen. Undvika bubbla bildas i lösningen så mycket som möjligt. - Placera kultur plattan i en CO2 inkubator och inkubera vid 37 ° C under 1 h. Kontrollera att gelation av kollagen och flytta kultur plattan till en ren bänk.
Obs: Bekräfta gelation genom att luta kultur plattan. - Häll försiktigt 150 µL av K110 på de geler med pipett längs väggen i brunnen, plats kultur plattan i en CO2 inkubator och inkubera vid 37 ° C under 1 h. flytta kultur plattan till en ren bänk. Innan cellkultur, försiktigt kasta K110 med pipett.
Obs: För att skydda gelerna, spetsen på pipetten ska röra väggen i brunnen.
3. beredning av fiberfrämmande form av typ I-kollagen
Obs: Utför alla procedurer under aseptiska förhållanden.
- Tillsätt 4 µL av kollagen i 1,2 mL av 1 mM saltsyra (HCl) i ett 1,5 mL rör och blanda försiktigt med pipett.
Obs: Förbereda kollagen omedelbart före användning. Hålla kollagen och HCl kylda ända fram till användning. - Häll 100 µL av kollagen i varje brunn 96 brunnar kultur platta med pipett. Skaka försiktigt kultur plattan i en vänster till höger rörelse och inkubera i rumstemperatur i 1 h.
Anmärkning: Se till att hela ytan av brunnarna är täckt med lösning. - Efter inkubering, kassera kollagen lösningen och Tvätta brunnarna med PBS (-) två gånger med pipett.
- Häll 150 µL av 1% bovint serumalbumin/PBS (-) (1% BSA) till en brunn av 96 brunnar kultur plattan och inkubera vid rumstemperatur under 1 h. före cellkultur, kasta 1% BSA.
Anmärkning: Se till att hela ytan av brunnarna är täckt med lösning.
4. kultur av FEPE1L-8 celler
Obs: Utför alla procedurer under aseptiska förhållanden.
- Upprätthålla FEPE1L-8 celler i K110 i en 100 mm kultur skålen i en CO2 inkubator och inkuberas vid 37 ° C och 5% CO2, till semi confluency.
- Förbereda K110, trypsin och trypsin-inhibitor i vattenbad vid 37 ° C.
- Försiktigt bort mediet från kultur skålen, tillsätt 3 mL 0,05% trypsin med pipett, placera skålen i en CO2 inkubator och inkubera vid 37 ° C i 5 min. Efter inkubation, kontrollera cellen avskildhet från ytan av kultur skålen med faskontrast mikroskopi vid 10 x förstoring.
Obs: Morfologi av fristående cellerna blir runda. Om cellerna sprids, Inkubera under en ytterligare 5 min. - Tillsätt 3 mL av trypsin-inhibitor och samla fristående cellerna i en 15 mL centrifugrör med pipett. Centrifugera cellerna i en 15 mL centrifugrör vid 200 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och slamma pelleten i 10 mL K110 med pipett. Räkna cellerna med faskontrast mikroskopi vid 10 x förstoring och förbereda cellkoncentrationen på 5,0 x 104 celler/mL genom lämplig utspädning med K110.
- Försiktigt utsäde 0,1 mL K110 med celler i varje brunn av kultur plattan med pipett längs väggen i brunnen. Placera kultur plattan i en CO2 inkubator och inkubera vid 37 ° C för den angivna tiden (2 h, 1 dag, 3 dagar).
Obs: För att skydda gelerna, spetsen på pipetten ska röra väggen i brunnen.
5. uppskattning av antalet livskraftiga celler
- Inkubera K110 i vattenbad vid 37 ° C. Blanda 130 µL tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, natriumglutamat salt (WST-8) och 1,3 mL K110 i en 2 mL tub med pipett.
- Flytta kultur plattan till en ren bänk och försiktigt kasta K110 med pipett. Försiktigt tvätta bort icke-anhängare celler med K110 med hjälp av en pipett
- Lägga till 110 µL av K110 blandat med WST-8 i varje brunn med hjälp av en pipett, placera kultur plattan i en CO2 inkubator och inkubera vid 37 ° C i 2 h.
- Flytta kultur plattan till en ren bänk, samla 100 µL av konditionerat medium från varje brunn och flytta den till en brunn av en annan 96 brunnar kultur plattan. Mäta absorbans vid en våglängd på 450 nm (OD450) med en microplate reader och uppskattning antalet livskraftiga celler.
Representative Results
En schematisk representation av behandlingen av ytbehandlar av kultur rätter med typ I-kollagen avbildas i figur 1. Cell morfologier observerats på formulären fiberfrämmande och fibrill presenteras i panelerna och höger-vänster i figur 2, respektive. FEPE1L-8 celler odlades för 2 h (övre paneler) och 3 dagar (lägre paneler). I de inledande 2 h i odling, cellerna följs och sprids på båda formerna av kollagen (figur 2, övre paneler). Tre dagar efter sådd, celler i formuläret fiberfrämmande fortsatte att sprida och cell nummer ökat (figur 2, nedre vänstra panelen). Däremot visade cellerna på formuläret fibrill begränsad spridning (figur 2, nedre högra panelen). FEPE1L-8 celler fortsatte att föröka på fiberfrämmande form av typ I kollagen (figur 3, solid svart linje, stängt svarta ringar) och den obehandlade skålen ytor (figur 3, Prickig grå linje, stängda grå cirklar). Däremot celler inte föröka sig på formuläret fibrill (figur 3, prickad linje, öppna cirklar). Figur 2 och figur 3 har ändrats från Fujisaki et al11.
Figur 1 : Schematiska representationer av kultur maträtt ytor behandlade med typ I kollagen. Under sura förhållanden, typ I-kollagen molekyler adsorberas på ytan av en maträtt i formuläret fiberfrämmande (till vänster). Under neutrala förhållanden vid 37 ° C, typ I-kollagen molekyler ihop till fibriller och adsorberat på ytan av rätter i formuläret gel (höger panel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Morfologi av FEPE1L-8 celler. FEPE1L-8 celler i K110 odlades med formuläret fiberfrämmande (10 µg/mL; vänster paneler) eller fibrill form (1 mg/mL; rätt panelerna) av typ I-kollagen för 2 h (övre paneler) eller 3 dagar (lägre paneler). Vita staplarna anger 100 µm. figur 2 har ändrats från Fujisaki et al. i figur 1E – H11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Spridning av FEPE1L-8 cells. Antalet livskraftiga celler uppskattades i formuläret fiberfrämmande (svart heldragen linje, svart fyllda cirklar) eller på fibrill form (prickade linjen, öppen cirkel) av typ I-kollagen eller obehandlad maträtt ytor (grå streckade linjen, grå fyllda cirklar) 2 h, 1 dag och 3 dagar. Experimenten utfördes i exemplar och värden visas som medel + SD. Denna siffra har ändrats från Fujisaki et al. i figur 1J11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vissa ECM komponenter, inklusive typ I-kollagen, form tredimensionella strukturer i vivo1. Odling på sådan en tredimensionell, gel substrat ger mer fysiologiska förhållanden i vitro än på en tvådimensionell, plast yta1,2,3,4. Många protokoll angående metoden gel kultur har rapporterats, såsom med hjälp av typ I kollagen1,2,3,4,6,7, 11, typ IV kollagen14,15och Matrigel16. Typ I-kollagen är en väldefinierad och utbredda material på grund av dess överflöd och enkel hantering. Funktioner i renat typ I kollagen beror på djurens art, ålder och rening metoder5,17. Typ I-kollagen kan renas med hjälp av ättiksyra eller proteaser, såsom pepsin, papain och proctase5,17. Syra-lösliga kollagen underhåller amino-telopeptider och proteas-lösligt kollagen är klyvs amino-telopeptider5,17. Amino-telopeptider reserverade längd beror på vilken typ av proteaser, och förekomsten av telopeptider påverkar fibrill morfologi och gel styrka5,17. Syra-lösliga kollagen fibriller viskositet är större än proteas-behandlade kollagen17. I denna studie använde vi Syra-lösliga nötkreatur typ I-kollagen. Pepsin-solubilized kollagen kan också användas i detta gel kultur protokoll. den gel styrkan är dock svagare17. Dessa skillnader i material kan orsaka cell beteendemässiga skillnader, men de är för närvarande inte väl förstått.
Det gel kultur-protokollet som beskrivs i denna studie är mycket enkel. Många modifieringar av denna metod har rapporterats. En möjlig ändring för kulturen av keratinocyter är att efterlikna basalmembranet. Typ IV kollagen geler kan vara bättre att hålla en basalmembranet-liknande substrat struktur i vitro15,18. Det krävs dock en lång inkubationstid för beredning av typ IV kollagen geler14,15,18. I stället blandning typ IV kollagen med typ I-kollagen geler kan producera nya kultur substrat (typ I / typ IV kollagen hybrid geler)19. Dessa hybrid geler är lätta att hantera, kräver en kort tid för gelation och ge mer basalmembranet-liknande förhållanden för keratinocyter. Typ på I / typ IV kollagen hybrid geler, keratinocyter överleva, bildar kolonier och inducera terminal differentiering19. Denna hybrid metod har mångsidiga applikationer.
På-gel kultur med hjälp av typ I kollagen påverkar cancerceller. På fibrill form av typ I-kollagen, Akt aktivering och tillväxten av Caco-2-celler (en kolon cancer cell linje) är undertryckta7. Dessutom är tillväxten av mänskliga melanomceller (M24met) i formuläret fibrill greps vid checkpoint G1/S20. Dessutom är markant ökade nivåer av reaktiva syreradikaler hos murina 3T3-L1 Preadipocyter odlade i formuläret fibrill. Dessutom cellproliferation och migration stimuleras i motsatta riktningar av det fiberfrämmande och fibrill former av typ I kollagen21.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Dr. K. Sekiguchi (Institute for Protein Research, Osaka University), Dr M. Yamada (Institute for Protein Research, Osaka University), Dr T. Ikejima (Kina-Japan Research Institute i medicinska och farmaceutiska vetenskaper, Wuya College of Innovation, Shenyang läkemedels universitet) och T. Hayashi (Kina-Japan Research Institute i medicinska och farmaceutiska vetenskaper, Wuya College of Innovation, Shenyang läkemedels universitet) för hjälpsamma kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
| Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
| disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
| human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
| K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
| K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
| Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
| Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
References
- Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
- Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
- Kleinman, H. K., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. Haralsonand, M. A., Hassell, J. R. , IRL Press. Oxford. 289-301 (1995).
- Yamato, M., Hayashi, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. , 123-140 (1998).
- Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
- Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
- Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
- Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
- Shih, Y. -R., Tseng, K. F., Lai, H. -Y., Lin, C. -H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
- Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).
- Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
- Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
- Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
- Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
- Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
- Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922 (2014).
- Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
- Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
- Japan Institute of leather Research and Osaka University. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. Hattori, S., et al. , 2489375 (11F019-EP) (2015).
- Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
- Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).
