Summary
Her presenterer vi en protokoll for utarbeidelse av to ulike former for kultur underlag utnytte skriver jeg kollagen. Avhengig av hvordan håndteres kollagen, kollagen molekyler enten opprettholde todimensjonal, ikke-fibrøs skjema eller montere i tredimensjonale, fibril skjema. Type I-celle spredning på kollagen er drastisk berørt av fibril formasjon.
Abstract
Skriver jeg kollagen, nyttig som et substrat for cellekultur, finnes i to former: skjemaet todimensjonal, ikke-fibrøs og tredimensjonale, fibril form. Begge skjemaene kan være forberedt med samme type I-kollagen. Generelt, fremmer ikke-fibrøs skjemaet celleadhesjon og spredning. Fibril skjemaet (gels) gir mer fysiologiske forhold i mange typer celler. Derfor er gel kultur nyttig for å undersøke fysiologiske atferd av celler, for eksempel narkotika effekt.
Forskere kan velge den riktige formen etter for bruken. For eksempel i tilfelle av keratinocytter, har på-gel kultur blitt brukt som et sår helbredelse modell. FEPE1L-8, en keratinocyte cellen linje kultivert på ikke-fibrøs form av type jeg kollagen, fremmer celleadhesjon. Spesielt er keratinocyte spredning tregere i skjemaet fibril enn ikke-fibrøs skjemaet. Protokoller for utarbeidelse av type I kollagen for cellekultur er enkle og har bred programmer avhengig av eksperimentelle behov.
Introduction
Interstitiell bindevev utgjør en tredimensjonal protein meshwork av heterogene komposisjon, hovedsakelig bestående av typen jeg kollagen fibrils1. Kollagen fibrils spiller en viktig rolle som et stillas for celler1,2,3 og samhandle med andre ekstracellulær matrix (EFM) proteiner3. In vitro, ulike former for type I-kollagen kan brukes som underlag for cellekultur avhengig av håndtering metode1,2,3,4. Sure forhold, skriver jeg kollagen opprettholder ikke-fibrøs skjemaet5. Belegg overflaten av kultur retter med skjemaet ikke-fibrøs fremmer celle vedheft og spredning6,7. Fysiologisk pH og temperatur, skriver jeg kollagen molekyler montere i fibrils som danner gels har en tredimensjonal struktur1,2,3,4, 5,6,7,8. Det er flere viktige forskjeller mellom fibril og ikke-fibrøs former for type jeg kollagen, inkludert matrix stivhet og effektiviteten av rekonstruksjon av ECM komponenter av cellene under den kultur1. Matrix stivhet er en av de mest studerte regulatoriske forhold av celle kultur1, 9. Komplekse interaksjoner mellom underlag og celler beholdes imidlertid å være avklart. For å undersøke de komplekse interaksjonene mellom celler og miljømessige faktorer, er et enkelt system nyttig. Sammenligning av mobilnettet virkemåten på to ulike former av kollagen kan bidra til å forenkle effekten av miljømessige faktorer. Avhengig av formålet med deres bruk, former av typen jeg kan kollagen selektivt brukes. Normalt keratinocytter er i kontakt med membranen kjeller, men ikke med type jeg kollagen. Men under sårheling, keratinocytter flytte til dermal bindevevet sprer og helbrede sår10.
Nylig vi viste at konsentrasjonen av ekstracellulære kalsium er viktig for spredning av keratinocyte linje celler ved hjelp av kultur-system på fibril form av type I-kollagen mimicking dermal bindevev11. Når keratinocyte celle linjen FEPE1L-8 ble kultivert på fibril form av skriver jeg kollagen, formen på cellene var rund og deres proliferations ble stoppet på en ekstracellulære kalsium konsentrasjon av 30 μM11. Når kalsium konsentrasjon ble økt til 1,8 mM, var cellevekst gjenopprettede11. Cellene vokste under begge kalsium konsentrasjoner (30 μM og 1,8 mM) når kultivert på ikke-fibrøs skjemaet11, mens de var mer følsomme for eksogene kalsium konsentrasjon når kultivert i skjemaet fibril. FEPE1L-8 ble generert gjennom hva med papillomavirus type 16 transformere gener E6 og E7 fra menneskelige cervical carcinoma, ikke-tumorigenic, hemmer ubegrenset spredning med begrenset differensiering potensielle som vanlig keratinocytter 12,13. FEPE1L-8 celler kan vedlikeholdes ved hjelp av noen typer keratinocyte bestemt medium, inkludert K110 Type-II med additiv supplement K-1 (K110)6. Her beskriver vi kultur protokollen av menneskelig keratinocyte cellen linje på den ikke-fibrøs og fibril former for type I-kollagen.
Protocol
1. utarbeidelse av keratinocyte kultur medium
Merk: Utfør alle prosedyrer under aseptiske forhold.
- Legge til 5 mL av penicillin-streptomycin og 10 mL additiv supplement K-1 til 500 mL av K110 Type-II medium (K110) bruker en pipette.
2. forberedelse fibril form av type I-kollagen
Merk: Utføre prosedyrer til trinn 2.6 under aseptiske forhold.
- Holde 10 x fosfat-bufret saltvann (PBS (-)), deionisert vann, kollagen, en 96-brønnen plate og en tom 2-mL tube på is.
Merk: Ikke bruk den samme platen for å forberede fibril og ikke-fibrøs skjemaer. - Legge til 1,12 mL deionisert vann i en tom 2 mL tube bruker en pipette. Legge til 200 µL av 10 x PBS (-) til deionisert vann i 2 mL tube bruker en pipette. Forsiktig risting røret flere ganger.
- Legge til 0,66 mL av kollagen 2 mL tube bruker en pipette. Forsiktig og raskt rist røret flere ganger.
Merk: Unngå boble dannes i løsningen som mulig. Forberede kollagen løsning umiddelbart før å bruke. - Hell 100 µL av kollagen løsningen fra trinn 2.3 i hver brønn av 96-brønnen plate. Forsiktig risting kultur plate i en venstre mot høyre bevegelse.
Merk: Dekk hele overflaten av brønnene med kollagen løsning. Hvis løsningen ikke dekker hele overflaten, spre løsningen bruker en pipette tips. Unngå boble dannes i løsningen som mulig. - Plasser kultur plate i en CO2 inkubator og ruge ved 37 ° C i 1 h. Sjekk gelation av kollagen og flytte kultur plate til en ren benk.
Merk: Bekreft gelation ved å vippe kultur plate. - Forsiktig helle 150 µL av K110 på geléer bruker en pipette langs godt, kultur plate i en CO2 inkubator og ruge ved 37 ° C i 1 h. flytte kultur plate til en ren benk. Før cellekultur, forsiktig kaste K110 bruker en pipette.
Merk: For å beskytte geléer, spissen av pipette bør berøre veggen av brønnen.
3. forberedelse av ikke-fibrøs skjemaet for type I-kollagen
Merk: Utfør alle prosedyrer under aseptiske forhold.
- Legge til 4 µL av kollagen 1,2 mL 1 mM saltsyre (HCl) i en 1,5 mL tube og bland forsiktig bruker en pipette.
Merk: Forberede kollagen umiddelbart før å bruke. Hold kollagen og HCl kjølt inntil bruk. - Hell 100 µL av kollagen i hver brønn av en 96-brønnen plate med en pipette. Forsiktig risting kultur plate i venstre til høyre bevegelse og ruge ved romtemperatur 1t.
Merk: Kontroller at hele overflaten av brønnene er dekket med løsning. - Inkubasjon forkaste kollagen løsningen og vaskes brønner med PBS (-) to ganger bruker en pipette.
- Hell 150 µL av 1% bovin serum albumin/PBS (-) (1% BSA) til et godt av 96-brønnen plate og ruge ved romtemperatur for 1 h. før cellekultur, forkaste 1% BSA.
Merk: Kontroller at hele overflaten av brønnene er dekket med løsning.
4. kultur på FEPE1L-8 celler
Merk: Utfør alle prosedyrer under aseptiske forhold.
- Opprettholde FEPE1L-8 celler i K110 i en 100 mm kultur parabol i en CO2 inkubator og ruges på 37 ° C og 5% CO2, semi confluency.
- Forberede K110, trypsin og trypsin hemmer i et vannbad på 37 ° C.
- Nøye fjerne mediet fra kultur parabol, legge 3 mL 0,05% trypsin bruker en pipette, plasser rett i en CO2 inkubator og ruge ved 37 ° C i 5 minutter. Etter inkubasjon sjekk celle avdeling fra overflaten av kultur parabol med kontrast mikroskopi på 10 x forstørrelse.
Merknad: Morfologi av frittstående cellene blir runde. Hvis cellene spredt, ruge for en ytterligere periode på 5 minutter. - Legge 3 mL trypsin hemmer og samle frittliggende cellene i en 15 mL sentrifuge rør med en pipette. Sentrifuge cellene i en 15 mL sentrifuge tube 200 x g i 5 min.
- Forkast nedbryting og å avbryte pellet 10 mL av K110 bruker en pipette. Telle celler med kontrast mikroskopi på 10 x forstørrelse og forberede celle konsentrasjonen på 5.0 x 104 celler/mL av aktuelle fortynning med K110.
- Forsiktig frø 0,1 mL K110 med celler i hver brønn av kultur plate med en pipette langs brønnen. Plasser kultur plate i en CO2 inkubator og ruge på 37 ° C i den angitte tid (2 h, 1 dag, 3 dager).
Merk: For å beskytte geléer, spissen av pipette bør berøre veggen av brønnen.
5. anslag over hvor mange levedyktige cellers
- Inkuber K110 i et vannbad på 37 ° C. Mix 130 µL tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) og 1,3 mL av K110 i en 2-mL tube bruker en pipette.
- Flytte kultur plate til en ren benk og forsiktig kast K110 bruker en pipette. Vask forsiktig bort ikke-tilhenger celler med K110 ved å bruke en pipette
- Legge til 110 µL av K110 blandet med WST-8 i hver brønn ved å en pipette, plassere kultur plate i en CO2 inkubator og ruge ved 37 ° C i 2 timer.
- Flytte kultur plate til en ren benk, samle 100 µL av betinget medium fra hver brønn og flytte det til et godt av en annen 96-brønnen plate. Måle absorbans ved en bølgelengde på 450 nm (OD450) bruker en microplate leseren og anslå antall levedyktig celler.
Representative Results
En skjematisk fremstilling av behandling av overflater av kultur matretter med skriver jeg kollagen er avbildet i figur 1. Celle morphologies observert i skjemaene ikke-fibrøs og fibril presenteres i venstre - og høyre paneler av figur 2, henholdsvis. FEPE1L-8 celler ble kultivert for 2t (øvre panel) og 3 dager (nedre panel). I første 2 h av dyrking, cellene overholdt og spredt på begge former kollagen (figur 2, øvre panel). Tre dager etter seeding, celler i skjemaet ikke-fibrøs fortsatte å spre og celle tall økte (figur 2, nedre venstre panel). Derimot viste cellene i skjemaet fibril begrenset spre (figur 2, nedre høyre panel). FEPE1L-8 celler fortsatte å spre på ikke-fibrøs form av type jeg kollagen (Figur 3, svart heltrukket, lukket svart sirkler) og på ubehandlet parabolen overflater (Figur 3med grå linjen, lukket grå sirkler). I kontrast, ikke sprer celler i skjemaet fibril (Figur 3, prikket linje, åpne sirklene). Figur 2 og Figur 3 er endret fra Tokyo Fujisaki et al11.
Figur 1 : Skjematiske representasjoner av kultur parabol overflater behandlet med type jeg kollagen. Sure forhold, skriv jeg kollagen molekyler er adsorbert på overflaten av en rett i skjemaet ikke-fibrøs (venstre panel). Under nøytral forholdene på 37 ° C, skriv jeg kollagen molekyler er satt sammen til fibrils og adsorbert på overflaten av retter i gel form (høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Morfologi av FEPE1L-8 celler. FEPE1L-8 celler i K110 ble kultivert med skjemaet ikke-fibrøs (10 µg/mL, venstre panel) eller fibril form (1 mg/mL, høyre paneler) for type I-kollagen for 2t (øvre panel) eller 3 dager (nedre panel). Hvit stolper angir 100 µm. figur 2 har blitt endret fra Tokyo Fujisaki et al. i figur 1E-H11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Spredning av FEPE1L-8 cellen. Antall levedyktige cellers var beregnet på ikke-fibrøs skjemaet (svart heltrukket, svart fylte sirkler) eller på fibril form (prikket linje, åpne sirkelen) for type I-kollagen eller ubehandlet parabolen overflater (grå stiplede linjen, grå fylte sirkler) 2 h, 1 dag og 3 dager. Eksperimenter ble utført i triplicates og vises som betyr + SD. Dette tallet er endret fra Tokyo Fujisaki et al. i figur 1J11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Noen ECM komponenter, inkludert type jeg kollagen, skjemaet tredimensjonale strukturer i vivo1. Dyrking på slike en tredimensjonal, gel substrat gir mer fysiologiske forhold i vitro enn på en todimensjonal, plast overflate1,2,3,4. Flere protokoller om gel kultur metoden har blitt rapportert, som benytter skriver jeg kollagen1,2,3,4,6,7, 11, type IV kollagen14,15og Matrigel16. Type I-kollagen er et veldefinert og brukte materiale på grunn av sin overflod og bevegelighet. Funksjonene i renset type jeg kollagen avhenger av dyr arter, alder og rensing metoder5,17. Type I-kollagen kan bli renset ved hjelp av eddiksyre og/eller proteaser, som pepsiner, papain og proctase5,17. Acid-oppløselig collagen opprettholder amino-telopeptides og protease-oppløselig collagen er kløyvde amino-telopeptides5,17. Reservert av amino-telopeptides avhenger av proteaser, og tilstedeværelsen av telopeptides påvirker fibril morfologi og gel styrke5,17. Viskositeten av syre-oppløselig collagen fibrils er større enn protease-behandlet collagens17. I denne studien har vi brukt syreoppløslig storfe skriver jeg kollagen. Pepsin-solubilized kollagen kan også brukes i denne gel kultur protokollen; men er gel styrken svakere17. Disse forskjellene i materialer kan forårsake celle atferdsdata forskjeller, men de er foreløpig ikke godt forstått.
Gel kultur protokollen beskrevet i denne studien er svært enkel. Mange endringer av denne metoden er rapportert. En mulig endring for kultur av keratinocytter er å etterligne kjelleren membranen. Type IV kollagen gels kan være bedre å holde en kjeller membran-lignende substrat struktur i vitro15,18. En lang inkubasjonstid er imidlertid nødvendig for utarbeidelse av type IV kollagen gels14,15,18. I stedet blande type IV kollagen med angir jeg kollagen gels kan produsere romanen kultur underlag (type I- / type IV kollagen hybrid gels)19. Disse hybrid gels er enkle å håndtere, krever kort tid for gelation, og gi mer kjelleren membran-lignende forhold for keratinocytter. Skriver videre jeg / type IV kollagen hybrid geleer, keratinocytter overleve, danne kolonier og indusere terminal differensiering19. Dette hybrid metoden har allsidig søknadene.
I-gel kultur bruker skriver jeg kollagen påvirker kreftceller. På fibril form av type jeg kollagen, Akt aktivisering og veksten av Caco-2 celler (en kolon kreft cellen linje) er undertrykt7. I tillegg er veksten av menneskelig melanom celler (M24met) i skjemaet fibril arrestert på G1/S checkpoint20. Videre er markert økte nivåer av reaktive oksygen arter observert i murine 3T3-L1 preadipocytes kultivert i skjemaet fibril. Videre celle spredning og migrasjon stimuleres i motsatt retning av den ikke-fibrøs og fibril former for type I-kollagen21.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Dr. K. Sekiguchi (Institute for Protein forskning, Osaka University), Dr. M. Yamada (Institute for Protein forskning, Osaka University), Dr. T. Ikejima (Kina-Japan Research Institute for medisinsk og farmasøytisk Sciences, Wuya College of Innovasjon, Shenyang farmasøytisk University) og T. Hayashi (Kina-Japan Research Institute for medisinsk og farmasøytisk Sciences, Wuya College for innovasjon, Shenyang farmasøytisk University) for nyttige kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
| Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
| disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
| human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
| K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
| K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
| Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
| Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
References
- Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
- Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
- Kleinman, H. K., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. Haralsonand, M. A., Hassell, J. R. , IRL Press. Oxford. 289-301 (1995).
- Yamato, M., Hayashi, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. , 123-140 (1998).
- Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
- Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
- Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
- Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
- Shih, Y. -R., Tseng, K. F., Lai, H. -Y., Lin, C. -H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
- Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).
- Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
- Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
- Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
- Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
- Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
- Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922 (2014).
- Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
- Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
- Japan Institute of leather Research and Osaka University. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. Hattori, S., et al. , 2489375 (11F019-EP) (2015).
- Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
- Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).
