Summary
Vi præsenterer her, en protokol for forberedelse af to forskellige former for kultur substrater udnytte type I-kollagen. Afhængigt af hvordan håndteres kollagen, kollagen molekyler enten opretholde todimensional, ikke-fiberholdigt form eller samle ind i tre-dimensionelle, fibril form. Type I-celledelingen på kollagen påvirkes kraftigt af fibril formation.
Abstract
Type I-kollagen, nyttige som et substrat for cellekultur, findes i to former: to-dimensionelle, ikke-fiberholdigt form og tre-dimensionelle, fibril form. Begge former kan være forberedt med samme type I-kollagen. Generelt er fremmer formen ikke-fiber celle vedhæftning og spredning. Formen fibril (gel) giver flere fysiologiske tilstande i mange typer af celler. gel kultur er derfor nyttig for behandlingen af fysiologiske opførsel af celler, såsom narkotika effektivitet.
Forskere kan vælge den passende form efter formålet af dens anvendelse. For eksempel, i tilfælde af keratinocytter, har på gel kultur været brugt som en sårheling model. FEPE1L-8, en keratinocytter cellelinie kulturperler på de ikke-fiberholdigt form af type jeg kollagen, fremme celle vedhæftning. Bemærkelsesværdigt, er keratinocytter spredning langsommere i formen fibril end formen ikke-fiberholdigt. Protokoller for udarbejdelsen af type I kollagen for cellekultur er enkle og har bredt programmer alt efter de eksperimentelle behov.
Introduction
Interstitielle bindevæv omfatter en tre-dimensionel protein meshwork af heterogene sammensætning, primært bestående af typen jeg kollagen fibriller1. Kollagen fibriller spiller en central rolle som et stillads til celler1,2,3 og interagere med andre ekstracellulære matrix (ECM) proteiner3. In vitro, forskellige former for type I-kollagen kan bruges som underlag for cellekultur afhængigt af håndtering metode1,2,3,4. Under sure forhold, skriver jeg kollagen fastholder ikke-fiberholdigt form5. Belægning overfladen af kultur retter med formen ikke-fiber fremmer celle vedhæftning og spredning6,7. Ved fysiologisk pH og temperatur, Skriv jeg kollagen molekyler Saml ind fibriller, der danner geler besidder en tredimensionel struktur1,2,3,4, 5,6,7,8. Der er flere vigtige forskelle mellem fibril og ikke-fiberholdigt forms af typen jeg kollagen, herunder matrix stivhed og effektivitetsgevinster af genopbygningen af ECM komponenter af celler under kultur1. Matrix stivhed er en af de mest studerede regulerende faktorer af celle kultur1, 9. Det komplekse samspil mellem substrater og celler er dog stadig at blive afklaret. For at undersøge det komplekse samspil mellem celler og miljømæssige faktorer, er et simpelt system nyttige. Sammenligning af den cellulære opførsel på de to forskellige former for kollagen kan bidrage til at forenkle miljømæssige faktorers indvirkning. Afhængigt af formålet med deres anvendelse, forskellige former for type kan kollagen selektivt bruges. Normalt, keratinocytter er i kontakt med basalmembranen, men ikke med type I kollagen. Men i løbet af sårheling, keratinocytter flytte til dermal bindevæv, formere, og helbrede sår10.
For nylig, vi viste, at koncentrationen af ekstracellulære calcium er vigtig for spredningen af keratinocytter linje celler ved hjælp af kultur-systemet på fibril form af type I-kollagen efterligne dermal bindevæv11. Når linjen keratinocytter celle FEPE1L-8 var kulturperler på fibril form af type I-kollagen, form af cellerne var rund og deres proliferations blev stoppet i en ekstracellulære calcium koncentration på 30 μM11. Når calcium koncentrationen var steget til 1,8 mM, var cellevækst gendannede11. Cellerne voksede under begge calcium koncentrationer (30 μM og 1,8 mM) når kulturperler på de ikke-fiberholdigt form11, der henviser til, at de var mere følsomme over for eksogene calcium koncentrationen når kulturperler på formen fibril. FEPE1L-8 blev genereret gennem Transfektion med de papillomavirus type 16 transformerende gener E6 og E7 fra menneskelige cervikal karcinom, tumorfremkaldende, hæmme ubegrænset spredning med begrænset differentiering potentielle som normale keratinocytter 12,13. FEPE1L-8 celler kan opretholdes ved hjælp af nogle former for keratinocytter specifikt medium, herunder K110 Type-II med tilsætningsstoffet supplement K-1 (K110)6. Her beskriver vi kultur-protokollen af menneskelig keratinocyt cellelinje på den ikke-fiberholdigt og fibril former for type I-kollagen.
Protocol
1. forberedelse af keratinocytter næringssubstratet
Bemærk: Udføre alle procedurer under aseptiske forhold.
- Der tilsættes 5 mL af penicillin-streptomycin og 10 mL additiv tillæg K-1 500 ml af K110 Type-II medium (K110) ved hjælp af en pipette.
2. forberedelse af fibril form af type I-kollagen
Bemærk: Udføre procedurer indtil trin 2.6 under aseptiske forhold.
- Holde 10 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS (-)), deioniseret vand, kollagen, en 96-og kultur plade og en tom 2-mL-rør på is.
Bemærk: Brug ikke den samme plade til at forberede fibril og ikke-fiberholdigt former. - 1.12 mL deioniseret vand tilsættes til en tom 2 mL rør med pipette. Tilføje 200 µL 10 x PBS (-) til den deioniseret vand i 2 mL rør med pipette. Ryst forsigtigt røret flere gange.
- Tilføje 0,66 mL af kollagen til 2 mL rør med pipette. Forsigtigt og hurtigt ryste røret flere gange.
Bemærk: Undgå boble dannelse i opløsningen så meget som muligt. Forberede kollagen løsning umiddelbart før anvendelsen. - Hæld 100 µL af opløsningen kollagen fra trin 2.3 i hver brønd i 96-og kultur-pladen. Ryst forsigtigt kultur plade i en venstre mod højre bevægelse.
Bemærk: Dække hele overfladen af brønde med kollagen løsning. Hvis løsningen ikke dækker hele overfladen, spredt løsning ved hjælp af en pipette tip. Undgå boble dannelse i opløsningen så meget som muligt. - Kultur pladen anbringes i en CO2 inkubator og inkuberes ved 37 ° C i 1 h. Check gellation af kollagen og flytte kultur pladen til en ren bænk.
Bemærk: Bekræft gellation ved at vippe kultur pladen. - Forsigtigt hæld 150 µL af K110 på geler ved hjælp af en pipette langs væggen i brønden, sted kultur plade i en CO2 inkubator og inkuberes ved 37 ° C i 1 h. Flyt kultur pladen til en ren bænk. Før cellekultur, forsigtigt kassere K110 ved hjælp af en pipette.
Bemærk: For at beskytte geler, spidsen af pipetten skal røre væggen i brønden.
3. forberedelse af ikke-fiberholdigt form af type I-kollagen
Bemærk: Udføre alle procedurer under aseptiske forhold.
- Tilføj 4 µL af kollagen til 1,2 mL 1 mM saltsyre (HCl) i 1,5 mL rør og forsigtigt blandes ved hjælp af en pipette.
Bemærk: Forberede kollagen umiddelbart før anvendelsen. Holde kollagen og HCl kølet indtil brug. - Hæld 100 µL af kollagen i hver brønd med en 96-og kultur plade ved hjælp af en pipette. Ryst forsigtigt kultur plade i en venstre mod højre bevægelse og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
Bemærk: Sikre at hele overfladen af brøndene er dækket med løsning. - Efter inkubation, kassere kollagen løsning og brøndene vaskes med PBS (-) to gange ved hjælp af en pipette.
- Hæld 150 µL 1% bovint serumalbumin/PBS (-) (1% BSA) i en brønd i 96-og kultur-pladen og inkuberes ved stuetemperatur i 1 h. før cellekultur, kassere 1% BSA.
Bemærk: Sikre at hele overfladen af brøndene er dækket med løsning.
4. kultur af FEPE1L-8 celler
Bemærk: Udføre alle procedurer under aseptiske forhold.
- Opretholde FEPE1L-8 celler i K110 i en 100 mm kultur fad i en CO2 inkubator og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2, at semi-confluency.
- Forbered K110, trypsin og trypsin inhibitor i et vandbad ved 37 ° C.
- Forsigtigt fjerne medium fra kultur parabol, tilsættes 3 mL 0,05% trypsin ved hjælp af en pipette, Placer fadet i en CO2 inkubator og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Efter inkubationen kontrollere celle løsrivelse fra overfladen af kultur skålen bruge fasekonstrastmikroskopi ved 10 x forstørrelse.
Bemærk: Morfologi af fritliggende cellerne bliver runde. Hvis cellerne spredes, inkuberes i en yderligere periode på 5 min. - Tilføj 3 mL trypsin inhibitor og indsamle de fritliggende celler i en 15 mL centrifugeglas ved hjælp af en pipette. Der centrifugeres celler i en 15 mL centrifugeglas på 200 x g i 5 min.
- Supernatanten og genopslæmmes toerstoffet i 10 mL K110 ved hjælp af en pipette. Tælle celler ved hjælp af fasekonstrastmikroskopi ved 10 x forstørrelse og forberede celle koncentration på 5,0 x 104 celler/mL af passende fortynding med K110.
- Forsigtigt podes 0,1 mL af K110 med celler i hver brønd af kultur plade ved hjælp af en pipette langs væggen i brønden. Kultur pladen anbringes i en CO2 inkubator og inkuberes ved 37 ° C for den angivne tid (2 h, 1 dag, 3 dage).
Bemærk: For at beskytte geler, spidsen af pipetten skal røre væggen i brønden.
5. vurdering af antallet af levedygtige celler
- Inkuber K110 i et vandbad ved 37 ° C. Mix 130 µL af tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, mononatrium salt (WST-8), og 1,3 mL K110 i et 2-mL-rør ved hjælp af en pipette.
- Flytte kultur pladen til en ren bænk og forsigtigt skille sig af med K110 ved hjælp af en pipette. Forsigtigt vaske væk ikke-tilhænger celler med K110 ved hjælp af en pipette
- Tilføje 110 µL af K110 blandet med WST-8 i hver brønd med en pipette, kultur pladen anbringes i en CO2 inkubator og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
- Flytte kultur pladen til en ren bænk, indsamle 100 µL af konditioneret medium fra hver brønd, og flytte det til et godt af en anden 96-og kultur plade. Måling af absorbans ved en bølgelængde på 450 nm (OD450) ved hjælp af en mikrotiterplade læser og skøn antallet af levedygtige celler.
Representative Results
En skematisk gengivelse af behandling af overflader af kultur retter ved hjælp af type I-kollagen er afbildet i figur 1. Celle morfologier observeret i formen ikke-fiberholdigt og fibril præsenteres i panelerne venstre og højre side af figur 2, henholdsvis. FEPE1L-8 celler blev kulturperler for 2 h (øvre paneler) og 3 dage (nederste del). I de første 2 h af dyrkning, cellerne overholdes og spredes på begge former for kollagen (figur 2, øvre paneler). Tre dage efter såning, celler i formen ikke-fiberholdigt fortsatte med at sprede og celle numre øget (figur 2, nederste venstre panel). Derimod viste cellerne i formen fibril begrænset spredning (figur 2, nederste højre panel). FEPE1L-8 celler fortsættes til formere på ikke-fiberholdigt form af type kollagen (figur 3, solid sort linje, lukket sorte cirkler), på den ubehandlede parabol overflader (figur 3, stiplede grå linie, lukket grå cirkler). Derimod celler ikke formere sig på fibril form (figur 3, stiplede linje, åbne cirkler). Figur 2 og figur 3 er blevet ændret fra Fujisaki mfl11.
Figur 1 : Skematisk repræsentationer af kultur parabol overflader behandlet med type kollagen. Under sure forhold, Skriv jeg kollagen molekyler er adsorberet på overfladen af en parabol i formen ikke-fiber (venstre panel). Under neutrale forhold ved 37 ° C, Skriv jeg kollagen molekyler samles i fibriller og adsorberet på overfladen af retter i gel form (højre panel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Morfologi af FEPE1L-8 celler. FEPE1L-8 celler i K110 var kulturperler ved hjælp af formen ikke-fiber (10 µg/mL, venstre paneler) eller fibril form (1 mg/mL, rigtige paneler) for type I-kollagen for 2 h (øvre paneler) eller 3 dage (nederste del). Hvid angiver 100 µm. figur 2 er blevet ændret fra Fujisaki et al. i figur 1E-H11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Spredning af FEPE1L-8 celle. Antallet af levedygtige celler blev anslået på ikke-fiberholdigt form (sort streg, sort udfyldte cirkler) eller på fibril form (stiplede linje, åben cirkel) for type I-kollagen, eller ubehandlet parabol overflader (grå stiplede linje, grå udfyldte cirkler) for 2 timer, 1 dag og 3 dage. Eksperimenter blev udført i tre og værdier er vist som middel + SD. Dette tal er blevet ændret fra Fujisaki et al. i figur 1J11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Nogle ECM komponenter, herunder type jeg kollagen, form tre-dimensionelle strukturer in vivo1. Dyrkning på sådan en tredimensionel, gel substrat giver flere fysiologiske tilstande i vitro end på en to-dimensionelle plastic overflade1,2,3,4. Mange protokoller vedrørende metoden gel kultur er blevet rapporteret, som ved hjælp af type I-kollagen1,2,3,4,6,7, 11, type IV kollagen14,15, og Matrigel16. Type I-kollagen er en veldefineret og udbredte materiale på grund af sin overflod og nem håndtering. Funktionerne i renset form jeg kollagen afhænger af dyrenes art, alder og rensning metoder5,17. Type I-kollagen kan renses ved hjælp af eddikesyre og/eller proteaser, såsom pepsin, papain og proctase5,17. Syre-opløselige kollagen fastholder amino-telopeptides og protease-opløseligt kollagen er kløvet amino-telopeptides5,17. Den reserverede længde af amino-telopeptides afhænger af typen af proteaser, og tilstedeværelsen af telopeptides påvirker fibril morfologi og gel styrke5,17. Viskositet af syre-opløselige kollagen fibriller er større end protease-behandlede collagens17. I denne undersøgelse, brugte vi syre-opløselige kvæg type I-kollagen. Pepsin-solubilized collagen kan også bruges i denne gel kultur protokol; gel styrke er imidlertid svagere17. Disse forskelle i materialer kan forårsage celle adfærdsmæssige forskelle, men de er i øjeblikket ikke godt forstået.
Gel kultur protokollen beskrevet i denne undersøgelse er meget enkel. Mange ændringer af denne metode er blevet rapporteret. En eventuel ændring for kulturen af keratinocytter er at efterligne basalmembranen. Type IV kollagen geler kan blive bedre til at holde en basalmembran-lignende substrat struktur i vitro15,18. Men en lang inkubationstid er påkrævet til forberedelse af type IV kollagen geler14,15,18. I stedet blanding type IV kollagen med type I-kollagen geler kan producere roman kultur substrater (type I- / type IV kollagen hybrid gel)19. Disse hybrid gel er let at håndtere, kræver en kort tid for gellation, og give flere basalmembranen-lignende betingelser for keratinocytter. Skriver af jeg / type IV kollagen hybrid geler, keratinocytter overleve, danne kolonier og fremkalde terminal differentiering19. Denne hybrid metode har alsidige programmer.
På gel kultur ved hjælp af type I-kollagen påvirker kræftceller. På fibril form af type I-kollagen, Akt aktivering og vækst af Caco-2 celler (et kolon kræft cellelinje) er undertrykt7. Derudover er væksten af menneskelige melanom celler (M24met) på formen fibril anholdt på G1/S checkpoint20. Desuden er markant forhøjede niveauer af reaktive ilt arter observeret i murine 3T3-L1 preadipocytes kulturperler på formen fibril. Derudover celleproliferation og migration er stimuleret i modsatte retninger af den ikke-fiberholdigt og fibril former for type I-kollagen21.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Dr. K. Sekiguchi (Institute for Protein Research, Osaka University), Dr. M. Yamada (Institute for Protein Research, Osaka University), Dr. T. Ikejima (Kina-Japan Research Institute af medicinske og farmaceutiske videnskaber, Wuya College of Innovation, Shenyang farmaceutiske Universitet) og T. Hayashi (Kina-Japan Research Institute af medicinske og farmaceutiske videnskaber, Wuya College of Innovation, Shenyang farmaceutiske Universitet) for nyttige kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
| Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
| disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
| human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
| K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
| K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
| Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
| Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
References
- Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
- Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
- Kleinman, H. K., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. Haralsonand, M. A., Hassell, J. R. , IRL Press. Oxford. 289-301 (1995).
- Yamato, M., Hayashi, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. , 123-140 (1998).
- Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
- Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
- Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
- Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
- Shih, Y. -R., Tseng, K. F., Lai, H. -Y., Lin, C. -H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
- Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).
- Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
- Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
- Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
- Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
- Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
- Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922 (2014).
- Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
- Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
- Japan Institute of leather Research and Osaka University. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. Hattori, S., et al. , 2489375 (11F019-EP) (2015).
- Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
- Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).
