Summary
Здесь мы представляем протокол для подготовки двух различных форм культуры субстратов использования типа коллагена. В зависимости от того, как обрабатывается коллагена молекул коллагена поддерживать двухмерный, неволокнистые формы или соберите в трехмерном, волосики форму. Пролиферация клеток на типа коллаген резко пострадавших от формирования волосики.
Abstract
Тип I коллаген, полезные как субстрат для клеточной культуры, существует в двух формах: двухмерный, неволокнистые формы и объемно, волосики. Обе формы может быть подготовлен с той же типа коллагена. В общем неволокнистые форма способствует клеточной адгезии и распространения. Волосики форма (гели) обеспечивает более физиологических условиях во многих типах клеток; Таким образом культура гель является полезным для изучения физиологических поведение клеток, таких как эффективность препарата.
Исследователи могут выбрать подходящую форму согласно цели его использования. Например в случае кератиноцитов, использовалась на гель культуры как ранозаживляющее модель. FEPE1L-8, линии клеток кератиноцитов культивированный неволокнистые форму типа я коллагена, способствуют клеточной адгезии. В частности кератиноцитов распространение в форме фибриллярных медленнее неволокнистые формы. Протоколы для подготовки я коллагена для тип культуры клеток просты и имеют широкое применение в зависимости от потребностей в экспериментальной.
Introduction
Интерстициальный соединительной ткани составляют трехмерной белка сеть разнородных композиции, в основном состоят из типа я фибрилл коллагена1. Фибрилл коллагена играют ключевую роль в качестве лески для клетки1,2,3 и взаимодействовать с другими белков внеклеточного матрикса (ECM)3. В пробирке, различные формы типа коллаген может использоваться как субстраты для культуры клеток в зависимости от обработки метода1,2,3,4. В кислых условиях, тип I коллаген поддерживает неволокнистые форма5. Покрытие поверхности культуры блюд с неволокнистые форма способствует ячейки адгезии и распространения6,7. В физиологических рН и температуры, типа молекул коллагена собрать в фибрилл, которые формируют гели, обладая трехмерной структуры1,2,3,4, 56,,,78. Существует несколько важных различий между волосики и неволокнистые форм типа я коллагена, включая матрицы жесткости и эффективность восстановления компонентов ECM клеток во время культуры1. Матрицы жесткости является одним из наиболее изученных регулирования факторов культуры клеток в1, 9. Однако сложных взаимодействий между субстратов и клетки еще предстоит уточнить. Для изучения сложного взаимодействия между клетками и экологические факторы, простая система является полезным. Сравнение клеточного поведения на двух различных форм коллагена может помочь упростить влияние экологических факторов. В зависимости от цели их использования, различные формы типа я коллагена может использоваться выборочно. Как правило кератиноциты находятся в контакте с базальной мембраны, но не с типа я коллагена. Однако во время заживления ран, кератиноциты переместить в кожных соединительной ткани, размножаться и залечить раны10.
Недавно, мы показали, что концентрации внеклеточного кальция имеет важное значение для распространения кератиноцитов линии клетки с помощью системы культуры на форме фибриллярных типа коллагена, имитируя кожный соединительной ткани11. Когда линии клеток кератиноцитов, FEPE1L-8 был культивированный на форме фибриллярных типа я коллагена, форма клеток была круглой и их разрастания были остановлены на концентрации внеклеточного кальция 30 мкм11. Когда концентрация кальция было увеличено до 1,8 мм, клеточный рост был восстановленные11. Клетки рос под обе концентрации кальция (30 мкм и 1,8 мм) при культивированный неволокнистые форму11, в то время как они были более чувствительны к концентрации экзогенных кальция при культивировали в форме волосики. FEPE1L-8 был создан через трансфекции с вирусом папилломы тип 16 преобразование генов E6 и E7 от человека рак шейки матки, опухолеобразования, подавляют неограниченное распространение с ограниченным дифференциация потенциал как нормальные кератиноцитов 12,13. FEPE1L-8 клеток может поддерживаться с помощью некоторых видов конкретных средний кератиноцитов, включая K110 тип-II с добавкой дополнение K-1 (K110)6. Здесь мы описываем протокол культуры человека кератиноцитов клеточной линии на неволокнистые и фибриллярных форм типа коллагена.
Protocol
1. Подготовка носителя культуры кератиноцитов
Примечание: Выполните все процедуры в асептических условиях.
- Добавьте 5 мл пенициллина и стрептомицина и 10 мл Добавка дополнение K-1 до 500 мл среды K110 типа-II (K110) с помощью пипетки.
2. Подготовка фибриллярных формы типа коллагена
Примечание: Выполните процедуры до шага 2.6 в асептических условиях.
- Держите 10 x фосфат амортизированное saline (PBS (-)), деионизированной воды, коллаген, плиту 96-луночных культуры и пустой 2-мл на льду.
Примечание: Не используйте пластину же подготовить волосики и неволокнистые форм. - Добавьте 1.12 мл деионизованной воды пустой 2-мл пробирку с помощью пипетки. Добавьте 200 мкл 10 x PBS (-) для обессоленной воды в 2-мл пробирку с помощью пипетки. Осторожно встряхните трубки несколько раз.
- Добавьте 0,66 мл коллагена в 2-мл пробирку с помощью пипетки. Аккуратно и быстро несколько раз взболтайте трубки.
Примечание: Во избежание формирования пузыря в решении как можно больше. Готовят непосредственно перед использованием коллагена раствор. - Залейте 100 мкл раствора коллагена от шага 2.3 в каждой скважине пластину 96-луночных культуры. Осторожно встряхните пластину культуры в левом правом движения.
Примечание: Покрывают всю поверхность скважин с коллагена раствор. Если решение не покрывает всю поверхность, распространение решения с помощью кончика пипетки. Избегайте образования пузыря в решении как можно больше. - Место культуры пластины в инкубатор CO2 и Инкубируйте на 37 ° C в течение 1 ч. проверить гелеобразования коллагена и двигаться пластину культуры к чистой скамейке.
Примечание: Подтвердите гелеобразования, отогнув пластину культуры. - Осторожно наливайте 150 мкл K110 на гелях, с помощью пипетки вдоль стены колодца, место культуры пластины в инкубатор CO2 и Инкубируйте на 37 ° C в течение 1 ч. двигаться пластину культуры к чистой скамейке. До клеточной культуры, аккуратно удалить K110 с помощью пипетки.
Примечание: Чтобы защитить гели, кончиком пипетки должны касаться стены колодца.
3. Подготовка неволокнистые формы типа коллагена
Примечание: Выполните все процедуры в асептических условиях.
- 4 мкл коллагена до 1,2 мл 1 мм соляной кислоты (HCl) в 1,5 мл тюбик и осторожно перемешать с помощью пипетки.
Примечание: Готовят непосредственно перед использованием коллагена. Держите коллагена и HCl, охлажденной до момента использования. - Залейте 100 мкл коллагена в каждой скважине 96-луночных культуры пластины с помощью пипетки. Осторожно встряхните пластину культуры в слева направо движения и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч.
Примечание: Убедитесь, что вся поверхность лунки покрыта решения. - После инкубации отменить решение коллаген и Промыть лунки с PBS (-) дважды с помощью пипетки.
- Залить 150 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина/PBS (-) (1% BSA) хорошо пластины 96-луночных культуры и инкубации при комнатной температуре за 1 ч до культуры клеток, выбросьте BSA 1%.
Примечание: Убедитесь, что вся поверхность лунки покрыта решения.
4. Культура клеток FEPE1L-8
Примечание: Выполните все процедуры в асептических условиях.
- Сохранить FEPE1L-8 клеток в K110 в 100 мм культуры блюдо в инкубатор CO2 и инкубировали при 37 ° C и 5% CO2, на полу confluency.
- Подготовить K110, трипсина и ингибитор трипсина в водяной бане при температуре 37 ° C.
- Тщательно удалить носитель из культуры блюдо, добавить 3 мл 0,05% трипсина, с помощью пипетки, поместите блюдо в инкубатор CO2 и инкубировать при 37 ° C за 5 мин. После инкубации Проверьте ячейки отряда от поверхности культуры блюдо с помощью фазово контрастной микроскопии при 10-кратном.
Примечание: Морфология отдельностоящий клеток становится раунда. Если клетки, Инкубируйте на дополнительный период, 5 мин. - Добавить 3 мл ингибитора трипсина и собирать отдельные ячейки в 15 мл пластиковых пробирок с помощью пипетки. Центрифуга для ячеек в 15 мл пластиковых пробирок на 200 x g за 5 мин.
- Отменить супернатант и вновь приостановить гранулы в 10 мл K110 с помощью пипетки. Подсчитать ячейки, используя фазово контрастной микроскопии при 10-кратном и подготовить концентрации клеток на 5,0 x 10-4 клеток/мл соответствующих разрежения с K110.
- Аккуратно семян 0,1 мл K110 с ячейками в каждой скважине культуры пластины с помощью пипетки вдоль стены колодца. Место пластину культуры в CO2 инкубатора и инкубации при 37 ° C для указанного времени (2 часа, 1 день, 3 дня).
Примечание: Чтобы защитить гели, кончиком пипетки должны касаться стены колодца.
5. Оценка количество жизнеспособных клеток
- Инкубировать K110 в водяной бане при температуре 37 ° C. Mix 130 мкл tetrazolium соли, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, мононатрия соли (WST-8) и 1,3 мл K110 в 2-мл пробирку с помощью пипетки.
- Двигаться пластину культуры на лавочке чистой и аккуратно Выбросьте K110 с помощью пипетки. Аккуратно смыть non сторонник клетки с K110 с помощью пипетки
- Добавить что 110 мкл K110 смешанного с WST-8 в каждой хорошо с помощью пипетки, место пластину культуры в CO2 инкубатора и инкубировать при 37 ° C на 2 ч.
- Переместить пластину культуры к чистой скамейке, собирать 100 мкл кондиционером среды от каждой скважины и переместить его в скважину другой культуры 96-луночных пластины. Измерять поглощение на длине волны 450 Нм (450OD) с помощью Считыватель микропланшетов и оценкам количество жизнеспособных клеток.
Representative Results
Схематическое представление обработки поверхностей культуры блюд с использованием типа коллаген изображен на рисунке 1. Морфологии клеток наблюдается на неволокнистые и фибриллярных формы представлены в левой и правой стороне панели Рисунок 2, соответственно. FEPE1L-8 клеток были культивированный 2 h (верхняя панели) и 3 дня (нижняя панели). В первоначальных 2 ч культивирования клетки придерживался и выкладывают на обеих форм коллагена (рис. 2, верхней панели). Через три дня после посева, клетки неволокнистые форме продолжали распространять и клеточной число возросло (рис. 2, нижней левой панели). В отличие от клеток в форме фибриллярных показал, ограниченного распространения (рис. 2, нижней правой панели). FEPE1L-8 клетки продолжают размножаться неволокнистые форму типа коллагена (рис. 3, сплошная черная линия, закрытые черные круги) и на блюдо необработанной поверхности (рис. 3, пунктирной серой линии, закрытые серые круги). В отличие от клеток не увеличивается число фибриллярных формы (рис. 3, пунктирная линия, кружков). Фудзисаки et al11были изменены Рисунок 2 и на рисунке 3 .
Рисунок 1 : Схематические представления культуры блюдо поверхностей обращаться с типом коллаген. В кислых условиях тип I коллагена, который адсорбированных молекул на поверхности блюдо в форме неволокнистые (левая панель). В нейтральных условиях при 37 ° C тип I коллагена молекулы собрал в фибриллами и адсорбироваться на поверхности блюд в форме геля (правая панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Морфология клеток FEPE1L-8. FEPE1L-8 клеток в K110 были культивируемых с помощью неволокнистые формы (10 мкг/мл; левой панели) или фибриллярных форме (1 мг/мл; правой панели) тип I коллагена для 2 h (верхняя панели) или 3 дней (нижняя панели). Белые бары показывают 100 µm. Рисунок 2 был изменен из Фудзисаки et al. в Рисунок 1E – H11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Распространение клеток FEPE1L-8. Количество жизнеспособных клеток оценивались на неволокнистые форме (черная сплошная линия, черные круги, заполненные) или на волосики формы (пунктирная линия, открытые круг) тип I коллагена, или необработанной блюдо поверхности (серый пунктирная линия, серые круги заполнены) за 2 ч, 1 день и 3 дня. Эксперименты были проведены в triplicates и значения отображаются как средства + ур. Эта цифра была изменена от Фудзисаки et al. в Рисунок 1J11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Некоторые компоненты ECM, включая тип I коллаген, формы трехмерных структур в естественных условиях1. Культивирование на такой трехмерный, субстрат гель обеспечивает более физиологических условиях в vitro чем на двухмерный, пластиковые поверхности1,2,3,4. Поступили многочисленные протоколы относительно метода культуры гель, например с помощью типа коллагена1,2,3,4,6,7, 11, тип IV коллаген14,15и16Matrigel. Тип I Коллаген является четко определенной и широко используется материал из-за его изобилия и простотой в обращении. Особенности очищенный типа я коллагена зависит от животных видов, возраст и очистки методы5,17. Тип I коллагена могут быть очищены с помощью уксусной кислоты или протеаз, например пепсин, папаин и proctase5,17. Кислотно растворимых коллагена утверждает, что амино telopeptides и протеаз растворимый коллаген, рассеченного амино telopeptides5,17. Защищены длина амино telopeptides зависит от типа протеаз, и присутствие telopeptides влияет на морфологию волосики и гель прочности5,17. Вязкость фибрилл коллагена кислотно растворимых больше, чем лечить протеазы коллагены17. В этом исследовании, мы использовали кислотно растворимых бычьего типа коллагена. Коллаген, пепсин солюбилизирован может также использоваться в настоящем Протоколе гель культуры; Однако прочность геля-слабее17. Эти различия в материалах может вызвать поведенческие различия клетки, но они в настоящее время не вполне понятны.
Протокол культуры гель, описанный в настоящем исследовании является очень простой. Было зарегистрировано много модификаций этого метода. Один из возможных изменений для культуры кератиноцитов заключается в том, чтобы имитировать базальной мембраны. Тип IV коллагеновые гели могут быть лучше сохранить структуру базальной мембраны как субстрат в vitro15,18. Однако длительный инкубационный период необходим для подготовки типа IV коллагеновые гели14,15,18. Вместо этого, смешивания коллаген типа IV, с I типа коллагеновые гели могут производить Роман культуры субстратов (тип I / тип IV коллагена гибридные гели)19. Эти гибридные гели легко обрабатывать, требуется некоторое время для гелеобразования и принести больше базальной мембраны как условия для кератиноцитов. На тип I / тип IV коллагена гибридные гели, кератиноциты выжить, формируют колонии и побудить терминала дифференциация19. Этот метод гибрид имеет универсальность применения.
Культура-гель с использованием типа коллаген влияет на раковые клетки. На форме фибриллярных типа коллаген, Akt активации и рост клеток Caco-2 (линия клетки рака толстой кишки), подавленные7. Кроме того рост человека меланомы клеток (M24met) в форме фибриллярных арестован на G1/S контрольно-пропускного пункта20. Кроме того заметно повысить уровень реактивнооксигенных видов наблюдаются в мышиных 3T3-L1 preadipocytes культивировали в форме волосики. Кроме того пролиферации и миграции стимулируются в противоположных направлениях неволокнистые и фибриллярных форм типа коллаген21.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны доктор K. Секигучи (Институт исследований белков, Осакский университет), д-р м. Ямада (Институт исследований белков, Осакский университет), д-р T. Ikejima (Китай-Япония исследовательский институт медицинских и фармацевтических наук, колледж Wuya Инновации, Шэньян фармацевтический университет) и т. Хаяси (Китай-Япония исследовательский институт медицинских и фармацевтических наук, колледж Wuya инноваций, Шэньян фармацевтический университет) за полезные замечания.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin, from bovine serum (BSA) | Merck KGaA | A4503 | |
| 1 % BSA | Merck KGaA | A4503 | Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 347-07621 | tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, monosodium salt (WST-8) |
| Collagen type I (Acid soluble collgen) | Nippi Inc. | ASC-1-100-20 | from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL |
| disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate | ADVANTEC Co., LTD. | 25CS020AS | 0.2 µm pore size |
| human keratinocyte line cell FEPE1L-8 | Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) | ||
| K-1 | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 µg of h-EGF and 5 mg of heparin |
| K110 Type-II medium | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | keratinocyte basal culture medium |
| K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110) | Kyokuto Seiyaku Inc. | 28204 | Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium |
| PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate |
| 10x PBS (-) | Merck KGaA | P-5368 | Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals, LLC | 1670049 | 10000 units/mL of penisillin G and 10,000μg/mL of streptmycin sulfate in physiological saline |
| Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4 | Merck KGaA | P-5368-10 pack | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck KGaA | T4799 | |
| 0.05 % trypsin | Merck KGaA | T4799 | Dissolve 0.25 g of trypsin and 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
| Trypsin inhibitor from soybean | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | |
| Trypsin inhibitor | FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation | 202-20123 | Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate |
References
- Kanta, J. Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior. Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).
- Kleinman, H. K. Fibroblast adhesion to collagen substrates. Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).
- Kleinman, H. K., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. Haralsonand, M. A., Hassell, J. R. , IRL Press. Oxford. 289-301 (1995).
- Yamato, M., Hayashi, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. Extracellular Matrix-Cell Interaction. Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. , 123-140 (1998).
- Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen. Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).
- Fujisaki, H., Hattori, S. Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling. Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).
- Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils. Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).
- Wang, Z., Li, R., Zhong, R. Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).
- Shih, Y. -R., Tseng, K. F., Lai, H. -Y., Lin, C. -H., Lee, O. K. Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).
- Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan. BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).
- Fujisaki, H., et al. Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8. Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).
- Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames. Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).
- Kaur, P., Carter, W. G. Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).
- Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen. Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).
- Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels. Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).
- Yonemura, S. Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment. Plos One. 9, 112922 (2014).
- Sato, K., et al. Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).
- Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH. Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).
- Japan Institute of leather Research and Osaka University. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. Hattori, S., et al. , 2489375 (11F019-EP) (2015).
- Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).
- Liu, X., et al. Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration. Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).
