Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis
Summary
Das vorgestellte diagnostische FL-DNA-Kit ist eine zeitsparende und benutzerfreundliche Methode, um die zuverlässige Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins von Darmkrebsläsionen zu bestimmen.
Abstract
Heute kann Stuhl-DNA mit mehreren Methoden isoliert und analysiert werden. Die langen DNA-Fragmente im Stuhl können durch einen qPCR-Assay nachgewiesen werden, der eine zuverlässige Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein von präneoplastischen oder neoplastischen dickdarmen Läsionen bietet. Diese Methode, die fluoreszenzlange DNA (FL-DNA) genannt wird, ist ein schnelles, nicht-invasives Verfahren, das eine Verbesserung gegenüber dem primären Präventionssystem darstellt. Diese Methode basiert auf der Bewertung der Fäkal-DNA-Integrität durch quantitative Verstärkung spezifischer Ziele der genomischen DNA. Insbesondere die Auswertung von DNA-Fragmenten von mehr als 200 bp ermöglicht den Nachweis von Patienten mit kolorektalen Läsionen mit sehr hoher Spezifität. Dieses System und alle derzeit verfügbaren Stuhl-DNA-Tests stellen jedoch einige allgemeine Probleme dar, die angegangen werden müssen (z. B. die Häufigkeit, mit der Tests durchgeführt werden sollten, und eine optimale Anzahl von Stuhlproben, die zu jedem Zeitpunkt für jeden einzelnen Personen gesammelt werden). Der Hauptvorteil von FL-DNA ist jedoch die Möglichkeit, sie in Verbindung mit einem Test zu verwenden, der derzeit im CRC-Screening-Programm verwendet wird, dem immunchemischen fekten okkulten Bluttest (iFOBT). Tatsächlich können beide Tests an derselben Probe durchgeführt werden, wodurch die Kosten gesenkt und eine bessere Vorhersage des eventuellen Vorhandenseins von kolorektalen Läsionen erreicht werden kann.
Introduction
Darmkrebs (CRC) leitet sich von einem mehrstufigen Prozess ab, bei dem sich gesundes Epithel langsam zu Adenomen oder Polypen entwickelt, die im Laufe der Zeit zu bösartigen Karzinomen übergehen1,2. Trotz der hohen Inzidenzrate des SCR wurde in den letzten zehn Jahren ein rückläufiger Trend beim Anteil der Todesfälle beobachtet3. Tatsächlich haben frühdiagnostische Instrumente, die in Screening-Programmen eingesetzt werden, zur Früherkennung und Entfernung von präneoplastischen Adenomen oder Polypen4geführt. Aufgrund der unterschiedlichen technischen Grenzen ist jedoch keine dieser Methoden optimal. Um die Empfindlichkeit und Spezifität zu verbessern, wurden viele Stuhl-DNA-Tests allein oder in Kombination mit aktuellen Routinediagnostiktestsvorgeschlagen 5,6.
Typischerweise, gesunde Schleimhaut vergießt in den Fäkalstrom apoptotische Kolonozyten, während kranke Schleimhaut Peeling nicht-apoptotische Kolonozyten. Fragmente von 200 bp oder mehr in der Länge charakterisieren nicht-apoptotische DNA. Diese DNA wird lange DNA (L-DNA) genannt und ist zu einem nutzbaren Biomarker für die CRC-Frühdiagnose geworden. Die L-DNA kann aus Stuhlproben isoliert und mit qPCR mit einem in vitro diagnostischen FL-DNA Kit7,8,9,10,11,12quantifiziert werden.
Der Test besteht aus zwei Assays zum Nachweis von FL-DNA-Fragmenten im Bereich von 138 bp bis 339 bp. Jeder Assay ermöglicht die Amplifikation von FL-DNA (FAM) sowie Spike-in-DNA (HEX). Um eine optimale Verstärkung aller Fragmente zu gewährleisten, wurde der Test in zwei Assays (genannt “A” und “B”) unterteilt. Der A-Test erkennt zwei Regionen von Exon 14 des APC-Gens (NM_001127511) und ein Fragment von Exon 7 des TP53-Gens (NM_001276760). Der B-Test erkennt ein Fragment von Exon 14 des APC-Gens (NM_001127511) und zwei Regionen der Exons 5 und 8 des TP53-Gens (NM_001276760). Die Assays unterscheiden nicht zwischen den erkannten Regionen. Die Spike-in-DNA entspricht der Oncorhynchus Keta Lachs DNA und ermöglicht die Überprüfung, ob das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wurde und überprüft das mögliche Vorhandensein von Inhibitoren, die zu falschen negativen Ergebnissen führen können. Die FL-DNA-Konzentration wird durch absolute Quantifizierung nach der Standardkurvenmethode ausgewertet und als ng/Reaktion ausgedrückt.
Die FL-DNA-Methode ist ein nicht-invasiver und kostengünstiger Stuhl-DNA-Test, der in Kombination mit dem immunchemischen fäkalen okkulten Bluttest (iFOBT) derzeit in CRC-Screening-Programmen verwendet wird und bessere Vorhersagen von CRC- und/oder Hochrisiko-Adenomaläsionenermöglicht 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frühere Studien haben gezeigt, dass die DNA-Integritätsanalyse von Hockern, die durch manuelle und halbautomatische Ansätze extrahiert wurden, ein alternatives Werkzeug zur Früherkennung von kolorektalen Läsionen darstellen kann7,8,9,,10,11,12. Molekulare, nichtinvasive Screening-Tests wurden im Laufe der Jahre für den …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keine Anerkennung.
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
References
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