Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes
Summary
O kit de DNA de DIAGNÓSTICO apresentado é um método de economia de tempo e fácil de usar para determinar a probabilidade confiável da presença de lesões de câncer colorretal.
Abstract
Hoje em dia, o DNA das fezes pode ser isolado e analisado por vários métodos. Os longos fragmentos de DNA nas fezes podem ser detectados por um ensaio qPCR, que fornece uma probabilidade confiável da presença de lesões colorretais pré-neoplásicas ou neoplásicas. Este método, chamado DNA longo fluorescência (FL-DNA), é um procedimento rápido e não invasivo que é uma melhoria no sistema de prevenção primário. Este método baseia-se na avaliação da integridade do DNA fecal por amplificação quantitativa de alvos específicos do DNA genômico. Em particular, a avaliação de fragmentos de DNA com mais de 200 bp permite a detecção de pacientes com lesões colorretais com especificidade muito alta. No entanto, este sistema e todos os testes de DNA de fezes disponíveis atualmente apresentam algumas questões gerais que precisam ser abordadas (por exemplo, a frequência em que os testes devem ser realizados e o número ideal de amostras de fezes coletadas em cada ponto de tempo para cada indivíduo). No entanto, a principal vantagem do FL-DNA é a possibilidade de usá-lo em associação com um teste atualmente utilizado no programa de triagem de CRC, conhecido como o exame de sangue oculto fecal à base imunoquímica (iFOBT). De fato, ambos os testes podem ser realizados na mesma amostra, reduzindo custos e obtendo uma melhor previsão da eventual presença de lesões colorretais.
Introduction
O câncer colorretal (CRC) deriva de um processo de várias etapas em que o epitélio saudável lentamente se desenvolve em adenomas ou pólipos, que progridem em carcinomas malignos ao longo do tempo1,,2. Apesar da alta taxa de incidência do CRC, observou-se tendência de queda no percentual de óbitos na última década3. De fato, as ferramentas de diagnóstico precoce adotadas em programas de triagem levaram à detecção e remoção precoce de adenomas pré-neoplásicos ou pólipos4. No entanto, devido aos diferentes limites técnicos, nenhum desses métodos é o ideal. De fato, para melhorar a sensibilidade e a especificidade, muitos testes de DNA de fezes foram propostos sozinhos ou em combinação com os testes de diagnóstico de rotina atuais5,6.
Tipicamente, a mucosa saudável se lança nos colonos apoptóticos do fluxo fecal, enquanto a mucosa doente esfolia colonos não apoptóticos. Fragmentos de 200 bp ou mais de comprimento caracterizam DNA não apoptótico. Este DNA é chamado de DNA longo (L-DNA) e tornou-se um biomarcador utilizado para o diagnóstico precoce do CRC. O L-DNA pode ser isolado da amostra de fezes e quantificado por qPCR usando um kit de DNA FL-DNA in vitrodiagnóstico 7,8,9,,10,,11,12.
O teste consiste em dois ensaios para a detecção de fragmentos de DNA FL variando de 138 bp a 339 bp. Cada ensaio permite a amplificação do FL-DNA (FAM) bem como o DNA de spike-in (HEX). Para garantir a amplificação ideal de todos os fragmentos, o teste foi dividido em dois ensaios (chamados “A” e “B”). O ensaio A detecta duas regiões do exon 14 do gene APC (NM_001127511) e um fragmento de exon 7 do gene TP53 (NM_001276760). O ensaio B detecta um fragmento de exon 14 do gene APC (NM_001127511) e duas regiões dos gônons 5 e 8 do gene TP53 (NM_001276760). Os ensaios não distinguem entre as regiões detectadas. O DNA de pico corresponde ao DNA do salmão Oncorhynchus keta e permite verificar que o procedimento foi feito corretamente e verifica a possível presença de inibidores, o que pode produzir resultados falsos negativos. A concentração fl-DNA é avaliada por quantificação absoluta usando o método de curva padrão e é expressa como ng/reação.
O método FL-DNA é um teste de DNA de fezes não invasivo e barato que, combinado com o exame de sangue oculto fecal à base imunoquímica (iFOBT), é atualmente usado em programas de triagem de CRC e permite melhores previsões de LESÕES de Adenomas de CRC e/ou de alto risco12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudos anteriores demonstraram que a análise da integridade do DNA das fezes extraídas por abordagens manuais e semiautomáticas pode representar uma ferramenta alternativa para a detecção precoce das lesões colorretais7,,8,,9,,10,,11,,12. Testes de triagem molecular e não invasivo foram desenvolvidos ao longo dos anos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores não têm reconhecimentos.
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
References
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