Summary

Kolorektal Kanser Riski ve Yaygınlığının Dışkı DNA Bütünlüğü Saptanması ile Değerlendirilmesi

Published: June 08, 2020
doi:

Summary

Sunulan tanısal FL-DNA kiti kolorektal kanser lezyonlarının varlığı güvenilir olasılığını belirlemek için zaman kazandıran ve kullanıcı dostu bir yöntemdir.

Abstract

Günümüzde dışkı DNA’sı çeşitli yöntemlerle izole edilip analiz edilebilir. Dışkıdaki uzun DNA parçaları, pre-neoplastik veya neoplastik kolorektal lezyonların varlığına karşı güvenilir bir olasılık sağlayan bir qPCR testi ile saptanabilir. Floresan uzun DNA (FL-DNA) olarak adlandırılan bu yöntem, primer önleme sistemi üzerinde bir gelişme olan hızlı, non-invaziv bir işlemdir. Bu yöntem, genomik DNA’nın belirli hedeflerinin nicel amplifikasyonu ile dışkı DNA bütünlüğünün değerlendirilmesi üzerine kuruludur. Özellikle 200 bp’den uzun DNA parçalarının değerlendirilmesi, çok yüksek özgüllüğü olan kolorektal lezyonları olan hastaların saptanmasına olanak sağlar. Ancak, bu sistem ve mevcut tüm dışkı DNA testleri ele alınması gereken bazı genel sorunları (örneğin, testlerin yapılması gereken sıklığı ve her birey için her zaman noktasında toplanan dışkı örneklerinin en uygun sayıda) mevcut. Ancak, FL-DNA’nın en büyük avantajı, immünokimyasal tabanlı dışkı okült kan testi (iFOBT) olarak bilinen CRC tarama programında kullanılan bir testle birlikte kullanma imkanıdır. Gerçekten de, her iki test de aynı örnek üzerinde yapılabilir, maliyetleri azaltarak ve kolorektal lezyonların nihai varlığı daha iyi bir tahmin elde.

Introduction

Kolorektal kanser (CRC) hangi sağlıklı epitel yavaş yavaş adenomlar veya polipler, zamanla malign karsinomlar içine ilerleme gelişir çok aşamalı bir süreç türetilmiştir1,2. CRC’nin yüksek insidansı oranına rağmen, ölüm lerin yüzdesinde bir düşüş eğilimi gözlenmiştir3. Nitekim tarama programlarında benimsenen erken tanı araçları pre-neoplastik adenomların veya poliplerin erken saptanması ve çıkarılmasına yol açmıştır4. Ancak, farklı teknik sınırlar nedeniyle, bu yöntemlerin hiçbiri en uygun değildir. Nitekim, duyarlılık ve özgüllüğü artırmak için, birçok dışkı DNA testleri tek başına veya mevcut rutin tanı testleri ile birlikte önerilmiştir5,6.

Tipik olarak, sağlıklı mukoza dışkı akışı apoptotik kolonositler içine döker, hastalıklı mukoza non-apoptotik kolonositler eksfoliyates ise. 200 bp veya daha uzun parçaları non-apoptotic DNA karakterize. Bu DNA uzun DNA (L-DNA) olarak adlandırılır ve CRC erken tanısı için kullanılabilir bir biyomarker haline gelmiştir. L-DNA dışkı örneğinden izole edilebilir ve qPCR tarafından in vitro diagnostik FL-DNA kiti7,8,9,10,11,12kullanılarak ölçülebilir.

Test, 138 bp ile 339 bp arasında değişen FL-DNA parçalarının tespiti için iki testten oluşur. Her bir titre fl-DNA (FAM) yanı sıra ani DNA (HEX) amplifikasyon sağlar. Tüm parçaların en iyi şekilde amplifikasyonlanmasını sağlamak için test iki teste ayrılmıştır (“A” ve “B” olarak adlandırılır). A testi, APC geninin 14 ekon 14 bölgesinin iki bölgesini (NM_001127511) ve TP53 geninin (NM_001276760) ekson 7’sinin bir parçasını algılar. B testi, APC geninin 14(NM_001127511) ekson 14’ünün ve TP53 geninin 5 ve 8 ekonlarının iki bölgesinin (NM_001276760) bir parçasını algılar. Tahliller algılanan bölgeler arasında ayrım yapmaz. Ani DNA Oncorhynchus keta somon DNA karşılık gelir ve prosedür düzgün yapılmış ve yanlış negatif sonuçlar verebilir inhibitörleri olası varlığı için kontrol doğrulama sağlar. FL-DNA konsantrasyonu standart eğri yöntemi kullanılarak mutlak niceleme ile değerlendirilir ve ng/reaksiyon olarak ifade edilir.

FL-DNA yöntemi, immünokimyasal tabanlı dışkı okült kan testi (iFOBT) ile birlikte, şu anda CRC tarama programlarında kullanılan ve CRC ve / veya yüksek riskli adenom lezyonları daha iyi tahminler için izin veren non-invaziv ve ucuz dışkı DNA testi12.

Protocol

Hastalar 2013 ve 2015 yılları arasında Meldola’daki (FC, İtalya) Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori’de (IRST) işe alındı. Kayıtlı hastalar IRST Etik Komitesi tarafından onaylanan IRSTB002 protokolüne girmiştir (25/10/2012, ver. 1). Tüm yöntemler ilgili yönerge ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. 1. Dışkıdan DNA çıkarma Dışkı örnekleri hazırlamak içi…

Representative Results

Bu protokolün iş akışı Şekil 1’degösterilmiştir. İş akışı, bu adım sonuçlarına göre iki denetim adımı ve farklı eylemler sağlar. İlk olarak, bir örnek uygun olmayan denetimler sunuyorsa, amplifikasyon tekrarlanmalıdır. İkinci olarak, amplifikasyon inhibe edilirse, örnek baştan yeniden işlenmeli veya değerli değil olarak sınıflandırılmalıdır. Şekil 2 pozitif ve negatif örneklerle üretilen floresan eğrilerini göstermekte…

Discussion

Önceki çalışmalar, manuel ve yarı otomatik yaklaşımlar la elde edilen dışkıDNA bütünlüğü analizi kolorektallezyonlarınerken teşhisi için alternatif bir araç temsil edebilir göstermiştir7 ,8,9,10,11,12. Kolorektal kanserin saptanması için yıllar içinde moleküler, noninvaziv tarama testleri geliştiril…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarların hiçbir takdiri yok.

Materials

1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Absolute Ethanol (quality of analytical degree) Reagent required for DNA extraction
Benchtop centrifuge  Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction
EasyPGX analysis software version 2.0.0 Diatech Pharmacogenetics RT800-SW Analysis software 
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips Diatech Pharmacogenetics RT803 Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX qPCR instrument 96  Diatech Pharmacogenetics RT800-96 Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX ready FL-DNA Diatech Pharmacogenetics RT029 Kit required for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Powder-free disposable gloves Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
QIAamp Fast DNA Stool Qiagen 51604 Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Thermal block e.g. EasyPGX dry block Diatech Pharmacogenetics RT801 Instrument required for DNA extraction
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml  Diatech Pharmacogenetics RT802 Instrument required for DNA extraction

References

  1. Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
  2. Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
  3. Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
  4. Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
  5. Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
  6. Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
  7. Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
  8. Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
  9. Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
  10. De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
  11. Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).

Play Video

Cite This Article
Rengucci, C., De Maio, G., Menghi, M., Benzi, F., Calistri, D. Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. J. Vis. Exp. (160), e59426, doi:10.3791/59426 (2020).

View Video