Summary

Strategie non invasive per la manipolazione cronica dell'attività neuronale controllata da DREADD

Published: August 25, 2019
doi:

Summary

Qui descriviamo due metodi non invasivi per controllare cronicamente l’attività neuronale usando la chemiogenetica nei topi. Le gocce oculari sono state utilizzate per fornire ogni giorno clozapina-n-ossido (CNO). Descriviamo anche due metodi per una somministrazione prolungata di CNO nell’acqua potabile. Queste strategie per il controllo neuronale cronico richiedono un intervento minimo riducendo lo stress degli animali.

Abstract

Le strategie chemiogenetiche sono emerse come strumenti affidabili per il controllo remoto dell’attività neuronale. Tra questi, i recettori dei progettisti attivati esclusivamente da farmaci di design (DREADD) sono diventati l’approccio chemiogenetico più popolare utilizzato nelle neuroscienze moderne. La maggior parte degli studi fornisce il ligando clozapina-n-ossido (CNO) utilizzando una singola iniezione intraperitoneale, che è adatto per l’attivazione/inibizione acuta della popolazione neuronale mirata. Ci sono, tuttavia, solo alcuni esempi di strategie per la modulazione cronica dei neuroni controllati da DREADD, la maggior parte dei quali si basano sull’uso di sistemi di consegna che richiedono un intervento chirurgico. Qui, espandiamo su due strategie non invasive per fornire il Ligand CNO per manipolare cronicamente la popolazione neurale nei topi. Il CNO è stato somministrato sia utilizzando gocce oculari ripetitive (giornaliere), sia cronicamente attraverso l’acqua potabile dell’animale. Questi paradigmi non invasivi si traducono in una robusta attivazione dei recettori dei progettisti che persistevano in tutti i trattamenti CNO. I metodi qui descritti offrono alternative per il controllo mediato cronico danzico danzico dell’attività neuronale e possono essere utili per esperimenti progettati per valutare il comportamento in animali liberamente in movimento, concentrandosi su metodi di somministrazione CNO meno invasivi.

Introduction

I progressi tecnici nel campo delle neuroscienze hanno permesso agli scienziati di identificare e controllare con precisione l’attività di particolari popolazioni neuronali1. Questo ha contribuito a comprendere meglio la base dei circuiti neuronali e il loro impatto sul comportamento animale, così come, rivedendo i dogmi stabiliti2,3. Tra questi nuovi strumenti, le strategie optogenetiche e chemiogenetiche hanno avuto un profondo impatto non solo sulla qualità delle scoperte, ma anche sul modo in cui gli esperimenti sono concepiti e progettati4. Nel presente manoscritto, ci concentriamo sulle strategie chemiogenetiche per controllare l’attivazione dei neuroni tramite strategie ingegnerizzate recettore-ligando. Recettori di design attivati esclusivamente da farmaci di design (DREADDs) rappresentano uno degli strumenti chemiogenetici più popolari per il controllo remoto dell’attività neuronale, come esaminato da Roth 20165. I DREADD utilizzano recettori acetilline muscarinic modificati che sono specificamente attivati da un ligando inerte, clozapina-n-ossido (CNO)6.

Maggior parte degli studi utilizzano CNO somministrato da iniezioni intraperitoneali (i.p.), che controlla efficacemente il dosaggio e la tempistica dei recettori ingegnerizzati attivazione in modo acuto. Tuttavia, quando è necessaria l’attivazione ReREADD ripetitiva o cronica, l’uso di iniezioni multiple i.p. diventa irrealizzabile. Per risolvere questo problema, sono state segnalate diverse strategie per la consegna cNO cronica, tra cui minipumps7 impiantate e cannule intracraniche8,9. In misura diversa, tutte queste strategie causano agli animali stress e dolore10e richiedono un intervento chirurgico che potrebbe anche avere un impatto diretto sulle risposte comportamentali da testare11. Qui, descriviamo tre strategie non invasive per la consegna cNO cronica.

A questo scopo, i topi sono stati iniettati stereotassicamente nell’ippocampo con un virus adeno-associato (AAV) che codifica una versione ingegneristica del recettore muscarinico M3 eccitatorio (hM3Dq) che quando attivato dal ligando CNO porta alla cottura a raffica di neuroni6. È stato precedentemente dimostrato che un singolo occhio contenente CNO può effettivamente suscitare una robusta attivazione di neuroni che esprimono DREADD12. Qui descriviamo un metodo modificato per la consegna ripetitiva di colliri. Per ottenere un controllo cronico e sostenuto dei recettori dei progettisti, descriviamo quindi una strategia non invasiva per fornire CNO ai topi attraverso l’acqua potabile. Infine, descriviamo un paradigma alternativo per fornire CNO in acqua potabile durante una finestra temporale limitata. L’attività locomotoria dei topi, così come il comportamento di bere e il consumo di soluzioni caloriche dolci, sono per lo più limitate alla parte scura del ciclo luce / scuro13,14. Pertanto, abbiamo adottato un protocollo basato sulla preferenza del topo per il saccarosio. Misurando l’induzione del gene immediatamente precoce c-Fos nelle cellule infettate da AAV, come lettura per l’attivazione neuronale12,15, abbiamo scoperto che queste strategie di erogazione CNO attivano in modo robusto i neuroni controllati da DREADD Durate.

Protocol

Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida dei comitati per la cura e l’uso degli animali dell’Istituto Nazionale di Salute Mentale (NIMH). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il dolore e il numero di animali utilizzati. 1. Iniezioni di virus associati ad Adeno nell’ippocampo NOT:</ I topi maschi di tipo selvatico di sottofondo misto (B6/129 F1 ibrido, 3 mesi) erano per iniettati stereotassicamente con un …

Representative Results

Abbiamo osservato che la consegna ripetitiva di CNO mediante gocce oculari ha provocato una robusta induzione dell’espressione c-Fos nella maggior parte dei neuroni infetti (Figura1C), dimostrando che l’efficacia della consegna CNO è sostenuta durante l’esposizione ripetitiva. Inoltre, è stata osservata una significativa induzione di c-Fos nei campioni raccolti 2 h dopo il trattamento cNO, rispetto ai campioni ottenuti 6 h dopo l’esposizione al CNO (figura1D-E), dimostrand…

Discussion

I DREADD sono emersi come un approccio popolare ed efficace per manipolare da remoto l’attività neuronale17. La progettazione di strategie alternative per la consegna di CNO aumenterà ampiamente lo spettro delle opzioni disponibili per specifiche impostazioni sperimentali. Inoltre, le strategie non invasive per la consegna di CNO riducono al minimo qualsiasi potenziale interpretazione errata dei risultati riducendo gli effetti collaterali negativi che possono avere un impatto diretto sulla salut…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di ricerca intramurale presso l’Istituto Nazionale di Salute Mentale (Istituto Nazionale di Salute Mentale). Ringraziamo il sostegno del NIMH IRP Rodent Behavioral Core(

Materials

BSA Sigma life science #A2153-100G Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis)
C57BL/6J mice The Jackson laboratory #000664 male mice, 3 months old
Capillaries Drummond Scientific Company #3-000-203-G/X Outer diameter: 1.14 in.
Clozapine-N-oxide Sigma #C0832 5mg
Forane Baxter #NDC 10019-360-60 Isoflurane, USP
Microinjector III Drummond Scientific Company #3-000-207 Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector
Mounting media Invitrogen #P36930 Prolong Gold antifade reagent
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences #15710 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml
Primary c-Fos Antibody Cell signaling technology #2250S c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl)
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry UNC Vector Core Titer: ~3x10e12 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherry UNC Vector Core Titer: ~3x10e12 vg/mL
Secondary Antibody Invitrogen #A21206 Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml
Triton X-100 americanbio.com #AB02025-00100

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Cite This Article
Zhan, J., Komal, R., Keenan, W. T., Hattar, S., Fernandez, D. C. Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity. J. Vis. Exp. (150), e59439, doi:10.3791/59439 (2019).

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