Summary
I denne protokol viser og uddyber vi, hvordan man bruger menneskeskabte pluripotente stamceller til differentiering og rensning af kardiomyocytter, og yderligere om, hvordan man kan forbedre sin transplantations effektivitet med Rho-associeret proteinkinasehæmmer forbehandling i en mus myokardieinfarkt model.
Abstract
En afgørende faktor for at forbedre cellulære terapi effektivitet for Myokardie regenerering er at sikkert og effektivt øge cellen engraftment sats. Y-27632 er en meget potent hæmmer af Rho-associeret, coiled-spole-holdige protein kinase (RhoA/ROCK) og bruges til at forhindre dissociation-induceret celle apoptose (anoikis). Vi viser, at Y-27632 forbehandling for menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CMs+ Ri) forud for implantation resulterer i en celle engraftment rate forbedring i en musemodel af akut MYOKARDIEINFARKT (MI). Her beskriver vi en komplet procedure af hiPSC-CMs differentiering, rensning, og celle forbehandling med Y-27632, samt den resulterende celle sammentrækning, calcium forbigående målinger, og transplantation i mus MI modeller. Den foreslåede metode giver en enkel, sikker, effektiv og billig metode, som i væsentlig grad øger cellengraftment sats. Denne metode kan ikke kun anvendes i forbindelse med andre metoder til yderligere at forbedre celletransplantation effektivitet, men også giver et gunstigt grundlag for studiet af mekanismerne i andre hjertesygdomme.
Introduction
Stamcelle baserede terapier har vist et betydeligt potentiale som en behandling for hjerte skader forårsaget af MI1. Brugen af differentierede hiPSCs giver en uudtømmelig kilde til hiPSC-CMs2 og åbner døren for en hurtig udvikling af banebrydende behandlinger. Men, mange begrænsninger for terapeutisk oversættelse forbliver, herunder udfordringen med den alvorligt lave engraftment sats af implanterede celler.
Dissocierende celler med trypsin initierer anoikis3, som kun accelereres, når disse celler injiceres i barske miljøer som den iskæmiske myokardiet, hvor det hypoxiske miljø accelererer kursen mod celledød. Af de resterende celler, en stor del vaskes ud fra implantationsstedet ind i blodbanen og spredes i hele periferien. En af de vigtigste apoptotiske veje er RhoA/ROCK pathway4. Baseret på tidligere forskning, rhoa/rock pathway regulerer actin cytoskelet organisation5,6, som er ansvarlig for celle dysfunktion7,8. Rock inhibitor Y-27632 er meget udbredt under somatisk og stamcelle dissociation og passaging, at øge celle vedhæftning og reducere celle apoptose9,10,11. I dette studie anvendes Y-27632 til behandling af hiPSC-CMs før transplantation i et forsøg på at øge cellernes engraftment.
Der er fastlagt flere metoder til forbedring af celle engraftment, såsom varmechok og kælder membran matrix belægning12. Bortset fra disse metoder kan genteknologi også fremme kardiomyocyt proliferation13 eller vende nonmyokardial celler til kardiomyocytter14. Fra Bioengineering perspektiv, cardiomyocytter seedet på en biomaterialet stilladset for at forbedre transplantationen effektivitet15. Desværre er de fleste af disse metoder komplicerede og dyre. Tværtimod er den metode, der foreslås her, enkel, omkostningseffektiv og effektiv, og den kan bruges som basal behandling før transplantation, samt i konjugering med andre teknologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg i denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle dyrepleje-og brugs Komité (IACUC) fra University of Alabama i Birmingham og var baseret på de nationale institutter for sundheds laboratoriets dyrepleje og retningslinjer for anvendelse (NIH publication No 85-23).
1. forberedelse af kultur medier og kultur plader
-
Medium forberedelse
- For hiPSC medium blandes 400 mL humant pluripotente stamcelle (hPSC) basal medium (tabel over materialer 1) og 100 ml hpsc 5x supplement; blandingen opbevares ved 4 °C.
- For RPMI 1640/B27 minus insulin (RB-) medium, bland 500 mL RPMI 1640 og 10 mL B27 supplement minus insulin.
- For RPMI 1640/B27 (RB +) medium, bland 500 mL RPMI 1640, 10 mL B27 supplement, og 5 mL penicillin-streptomycin (pen-STREP) antibiotikum.
- Til rensning medium16blandes 500 ml No-GLUCOSE rpmi 1640, 10 ml B27 supplement, 5 ml pen-STREP antibiotikum og 1.000 ΜL natrium DL-laktat opløsning (i en endelig koncentration på 4 mm).
- Til neutraliserende opløsning blandes 200 mL RPMI 1640, 50 mL føtal bovint serum (FBS), 2,5 mL pen-STREP antibiotikum og 50 μL Y-27632 (i en endelig koncentration på 10 μM).
- For fryse middel blandes 9 mL FB'ER, 1 mL dimethylsulfoxid (DMSO) og 10 μL Y-27632 (i en endelig koncentration på 10 μM).
- For ekstracellulær matrix opløsning (EMS), tø koncentreret ekstracellulær matrix (tabel over materialer 1) ved 4 °c, indtil den har nået en jævnt konsistent væske tilstand. Precool pipettespidser og-rør, før du laver matrix-aliquoter på 350 μL hver på isen, og opbevar aliquoterne ved-20 °C. Før pladerne over lakerer, fortyndes en optøet alikvot til 24 mL iskold DMEM/F12-medium (EMS). hold EMS i 4 °C i op til 2 uger.
Bemærk: Udfør alle belægning trin på isen for at forhindre kælder membran matrix solidificering. - For Tyrode opløsning, tage 90% af den endelige krævede volumen af væv kultur kvalitet vand, tilsæt passende mængde af følgende reagenser, og rør indtil opløst. Brug derefter 1 N NaOH til at justere pH-værdien til 7,4. Tilsæt ekstra vand til en endelig koncentration på 140 mmol/L natriumchlorid, 1 mmol/L magnesium klorid, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L kaliumchlorid, 10 mmol/L glucose, og 1,8 mmol/L calciumchlorid. Sterilisere ved filtrering ved hjælp af en 0,22 μm membran.
-
Cellekultur plade belægning
- For hiPSC-kultur plader anvendes 1 mL EMS til hver brønd på en 6-brønd plade, og pladen inkubates i mindst 1 time ved 37 °C. Aspirere DMEM/F12-opløsning før såning af celler.
- For gelatine belægning, opløses 0,2 g gelatine pulver i væv kultur kvalitet vand til at gøre en 0,2% (w/v) opløsning. Steriliseres ved autoklavering ved 121 °c, 15 psi i 30 min. frakke hver brønd af en 6-brønd plade med 2 ml af opløsningen og Inkuber i 1 time ved 37 °c. Før passaging cellerne, aspirere opløsningen og lad pladen tørre i mindst 1 h ved stuetemperatur inde i vævs kulturen hætte.
2. hiPSC vedligeholdelse og Kardiomyocyte Ddifferentiering
- Kultur hiPSCs i hiPSC medium (Se trin 1.1.1) med en daglig medium ændring indtil cellerne nå 80%-90% sammenløbet per brønd.
Bemærk: Til vedligeholdelsesformål er hiPSCs generelt klar til passage hver 4. - Til passage hiPSCs, aspirere mediet og vaske godt 1x med 1x fosfat-Buffered saltvand (PBS). Tilsæt 0,5 mL stamcelle løsrivelse (tabel over materialer 1) til hver brønd og Inkuber ved 37 °c i 5 – 7 min.
Bemærk: Inkubationstiden afhænger af cellernes tæthed og dissociations graden, som kan observeres under et mikroskop. - Neutraliser Stam cellens løsrivelse med 1 mL hiPSC-medium suppleret med 5 μM Y-27632. Blandingen opsamles i et 15 mL centrifugeglas. Centrifuger røret i 5 minutter ved 200 x g, Aspirér supernatanten uden at forstyrre celle pellet, og resuspender derefter cellerne i 1 ml hipsc-medium, der indeholder 5 μM Y-27632.
- Frø hiPSCs på en ny EMS-belagt 6-brønd plade i et forhold mellem 1:6 til 1:18. Skift medium til hiPSC medium uden Y27632 efter 24 h.
- For at indefryse cellerne skal du resuspendere de dissocierede hiPSCs i fryse middel i en koncentration på 0,5-1 million/500 μL, placere suspensionen i cryovials og opbevare dem i en-80 °C fryser. De frosne hætteglas overføres til flydende nitrogen efter 24 timer.
- For at differentiere, Udskift hiPSC medium med 2 mL RB-medium suppleret med 10 μM GSK-3β inhibitor CHIR99021 (CHIR) ved 80%-90% celle-sammenløbet. Udskift mediet med 3 mL RB-medium efter 24 timer og Inkuber i yderligere 48 h (dag 3).
- På dag 3, ændre medium til 3 mL RB-medium med 10 μM WNT-hæmmer IWR1 for 48 h (dag 5), og derefter erstatte mediet med 3 mL RB-medium og vedligeholde for 48 h (dag 7).
- På dag 7, udskifte mediet med 3 mL RB medium og ændre mediet hver 3 dage går fremad. Spontan prygl af hiPSC-CMs skal observeres mellem dag 7 – 10.
3. hiPSC-CMs rensning og lille molekyle forbehandling
Bemærk: Højt rensede, rekombinante celle dissociations enzymer (tabel over materialer 1) blev brugt til at adskille hipsc-CMS.
- På dag 21 efter hiPSC-CM differentiering, aspirere mediet og vaske cellerne 1x med sterile PBS. Cellerne inkubates med 0,5 mL celle dissociations enzymer pr. brønd i 5 – 7 minutter ved 37 °C. Pipette cellesuspensionen gentagne gange med en 1 mL pipette for at adskille cellerne grundigt.
- Når cellerne er dissocierede, tilsættes 1 mL neutraliserende opløsning til hver brønd, Saml celle blandingen i et 15 mL centrifugeglas og centrifugeres ved 200 x g i 3 min. kassér supernatanten, og resuspender cellerne i neutraliserende opløsninger.
- Genplant cellerne på gelatine belagte 6-brønd plader ved en tæthed på 2.000.000 celler pr. brønd.
- Efter 24 – 48 h, Udskift dyrkningsmediet med rensnings mediet i 3 – 5 dage.
Bemærk: Rensning er færdig, når mere end 90% af cellerne i hvert mikroskop visningsfelt slår. For at forhindre yderligere beskadigelse af kardiomyocytterne, må ikke forlænge rensnings varigheden ud over 5 dage. Hvis den første runde ikke giver den nødvendige renhed, Udskift rense mediet med RB + medium i 1 dag, og derefter fuldføre en anden runde af rensning. - Før transplantation, kultur cellerne i behandlingsgruppen for 12 h i RB + medium suppleret med 10 μM Y-27632. Tilsvarende, udføre verapamil behandling på cellerne i RB + medium med 1 μM verapamil for 12 h (hiPSC-CMs+ ver).
- Efter behandling vaskes hiPSC-CMs 1x med PBS og inkuberer cellerne med 0,5 mL celle dissociations enzymer pr. brønd i højst 2 minutter. gentagne gange pipetteres cellesuspensionen ved hjælp af en 1 mL pipette for at adskille cellerne grundigt. Neutraliserer cellerne med neutraliserende opløsning, Saml celle blandingen i et 15 mL centrifugeglas, og centrifugeres ved 200 x g i 3 min. resuspension af CELLERNE i PBS i en koncentration på 100.000 celler/5 μl som forberedelse til injektion.
4. myokardieinfarkt og celle transplantation
Bemærk: Alle kirurgiske instrumenter er præsteriliseret med autoklave og vedligeholdes i aseptisk tilstand under flere operationer via en varm perle sterilisator (tabel over materialer 2).
- Anesthetize NOD/scid mus (tabel over materialer 2) med inhaleret isofluran (1,5% – 2%). Overvåge anæstesi niveauer ved musene svar til en tå knivspids. Placer dyrlægen optisk salve på øjnene for at forhindre dem i at tørre under operationen.
- Lever 0,1 mg/kg buprenorphin subkutant til smertebehandling før operationen.
- Placer og fastgør musen i en liggende position på et opvarmet operationsbord, Fjern håret fra ventrale halsregionen og venstre thorax ved hjælp af en depilatory creme, udsætte huden og desinficere den med 70% alkohol.
- Skær en 0,5 cm snit i midten af halsen ved hjælp af kirurgisk saks, adskille det subkutane fedt med sterile pincet, og udsætte luftrøret. Indfør oralt intubationskanylen ind i luftrøret, Tilslut kanylen til en lille dyre ventilator, og Juster ventilations indstillingerne (Indstil tidevands volumenet til 100 – 150 μL og respirationshastigheden på 100x – 150x pr. minut).
- Efter at musen stabiliserer, skæres et 0,5 cm snit i midten af venstre bryst hud. Brug pincet til at adskille muskellag og lave et lille snit i den femte interkostale plads til at udsætte brysthulen. Placer retractoren i snittet for at åbne brysthulen og Find den venstre faldende koronararterie (LAD). Under en dissekere kirurgisk mikroskop, ligere drengen med en 8-0 ikke-absorbtelig sutur.
- Umiddelbart efter MI induktion, injicere 5 μL hiPSC-CMs-Ri, Hipsc-CMS+ Ri, hipsc-CMS-ver, hipsc-CMS+ ver, eller en tilsvarende mængde PBS i musens myokardiet på hvert sted (3 x 105 celler/dyr, 1 x 105 celler/sted), en i infarkt området og to i områderne omkring infarktet.
Bemærk: Da 5 μL er meget lille volumen, er det ikke let at præcist styre lydstyrken ved direkte at sutte den med en sprøjte. Låget på en steril Petri skål kan vendes, og 5 μL af cellerne kan først deponeres på låget med en pipette. På grund af overfladen spændinger, vil det ikke spredes, men vil kondensere i en lille flydende masse. Dette kan let absorberes og injiceres i musens myokardiet. - Eliminer den resterende luft i brysthulen ved at fylde den op med varm isotonisk saltvandsopløsning. Sy ribbenene, musklerne og huden i rækkefølge med en 6-0 absorberbare sutur. Sluk for isofluran anæstesi injektion. Hold kirurgi dyrene på varmepuden og nøje observere dem, mens de genvinde fuld bevidsthed. Placer derefter dyrene i et rent bur. Du må ikke returnere dyrene til virksomheden af andre dyr, før de er fuldt tilbagebetalt.
- Efter operationen injiceres musene intraperitonealt med buprenorphin (0,1 mg/kg) hver 12 h i 3 på hinanden følgende dage og injicerer dem med ibuprofen (5 mg/kg) hver 12 h for en dag. Udføre efterfølgende analyse undersøgelser på bestemte tidspunkter.
Bemærk: Følg din lokale Animal Care Komité retningslinjer for analgesi.
5. calcium transitorisk og kontraktilitet optagelse
- Autoclave 15 mm-diameter dæksedler (tabel over materialer 2) og pincet i et lille glasbæger ved 121 °c, 15 psi i 15 min. forcool dæksedler og pincet ved 4 °c.
- Brug pincetterne til at anbringe dæksedlen i en 12-brønd plade og pipette 300 μL ekstracellulær matrix på hver dækseddel.
Bemærk: Lad ikke matrixen overskride kanten af dæksedlen for at forhindre, at matrix belægningen reduceres. Inkubér 12-brønd pladen i en 37 °C cellekultur inkubator i 1 time. - Aspirér mediet i den gelatine belagte 6-brønd plade med renset hiPSC-CMs, vask det 1x med PBS, og fordøje det derefter med 0,5 mL celle dissociations enzymer til 1,5 min. Tilsæt 1 mL neutraliserende opløsning, pipette gentagne gange for ikke mere end 5x-10x med en 1 mL pipette , og centrifuge blandingen centrifugeres ved 200 x g i 3 min.
- Udsug den coatede ekstracellulære matrix fra dæksedlerne. Tæl celle nummeret, og resuspender cellerne i den neutraliserende opløsning til en koncentration på 40000/300 μL, og tilsæt derefter 300 μL af cellesuspensionen på hver dækseddel. Kultur pladen i en 37 °C inkubator.
- Efter 24 timer, forsigtigt aspirere den neutraliserede opløsning, tilsæt 500 μL RB + medium til hver brønd af pladen, og fortsætte til kultur i 2 dage.
- Tilsæt Y-27632 (10 μM), Rho kinase aktivator (RA, 100 nM), verapamil (1 μM), eller en tilsvarende mængde PBS i kulturmediet i hiPSC-CMs, 12 h før calcium forbigående og kontraktilitet detektion.
Bemærk: Ud over påvisning af cellernes calcium forbigående og kontraktilitet efter 12 timers kemisk behandling blev påvisning af disse parametre også afprøvet ved 12, 24, 48 og 72 h efter kemisk tilbagetrækning. - Tag pladen ud, kassér mediet, og vask pladen 1x med PBS. Mediet ændres til en phenol-fri DMEM, der indeholder 0,02% (w/v) af overfladeaktivt polyol (tabel over materialer 1), 5 μm calcium indikator (tabel over materialer 1) og den tilsvarende Y-27632 (10 μM), RA (100 nm), verapamil (1 μM) eller en tilsvarende volumen af PBS, og inkubatér pladen i 30 minutter ved 37 °C.
- Kassér supernatanten, vask cellerne 3x med Dye-fri DMEM medium, og lad medium hvile i 30 min til at de-esterificere mapping farvestof.
- Placer den celle seedede dækseddel i et åbent bade kammer, og sæt kammeret i et mikroinkubations system, der er ækvibreret til 37 °C med en automatisk temperaturregulator (tabel over materialer 2), gennemgå det med tyrode opløsning, og Tilføj kontinuerligt Rho kinasehæmmer (RI), RA eller PBS til perfusions opløsningen.
- Brug et inverteret fluorescens mikroskop (tabel over materialer 2) og et laser scannings hoved (tabel over materialer 2) til at registrere spontan calcium forbigående ved at anvende en x-t-linje scanning ved hjælp af en 488 nm argon-laser til farve excitation og en 515 ± 10 nm barriere filter til opsamling af emissionlys. Optag den spontane sammentrækning af hiPSC-CMs ved hjælp af differens interferens kontrast funktionalitet af den confokale mikroskop (tabel af materialer 2).
Bemærk: Calcium-forbigående optagelser blev behandlet og analyseret ved hjælp af MATLAB R2016A software (tabel over materialer 4). Ændringer i celle sammentrækning blev udført ved hjælp af ImageJ software (tabel over materialer 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det hipsc-CMS, der anvendes i dette studie, stammer fra menneskelig oprindelse med der reporter-genet; Overlevelsesraten for de transplanterede celler in vivo blev derfor påvist ved bioluminescens Imaging (BLI)17 (figur 1a, B). For histologiske hjerte sektioner blev Human-specifikke kardiale troponin T (hcTnT) og humane nukleare antigen (HNA) dobbelt positive celler klassificeret som enpodet hiPSC-CMs (figur 1c). Begge resultater indikerede, at Y-27632 forbehandling signifikant forbedrede cellengraftraten. Luciferaseaktiviteten i hiPSC-CM+ Ri -gruppen blev forøget ca. seks gange på dag 3, 7 og 28 efter transplantationen sammenlignet med HIPSC-cm-Ri -gruppens (figur 1b). Desuden steg hcTnT/HNA-ekspressionen tæt på Sevenfold i hiPSC-CM+ Ri -gruppen i forhold til den i HIPSC-cm-Ri- gruppen (figur 1c).
Resultaterne viste også, at Y-27632 forbehandling regulerede cytoskelet ændringer i transplanterede celler. På dag 7 og 28 i transplantation udviste hiPSC-CMs+ Ri en større og mere defineret stang formet cytoskelet struktur sammenlignet med Hipsc-CMS-Ri (figur 1d).
Desuden har Y-27632 forbehandling potentialet til at reducere den transplanterede hiPSC-CM apoptose in vivo. TUNEL-farvning viste, at antallet af TUNEL-positive celler var signifikant nedsat i hiPSC-CM+ Ri -gruppen i forhold til den i HIPSC-cm-Ri -gruppen på dag 2 efter transplantation (figur 1E).
KLIPPE hæmning fremmede vedhæftningen af transplanterede celler og havde potentialet til yderligere at øge opbevaringen af implanterede celler på administrations stederne. Western blot og hjertevæv immunofarvning foreslog, at Y-27632 forbehandling reversibelt fremmet den øgede ekspression af anti β1 og N-cadherin og nedsat ekspression af phospho-myosin lyskæde 2 (p-MLC2) (figur 2a, B ).
Musens cellelinje HL-1 blev valgt som kontrol CMs for in vitro-celle vedhæftnings eksperimenter. Resultaterne indikerede, at Y-27632 forbehandling øgede hiPSC-CM-tilslutningen signifikant i forhold til HL-1. For yderligere at bekræfte disse fund blev hipsc-CMS+ Ri inkuberet med N-cadherin eller anti β1 neutraliserende antistof i 1 time, hvilket resulterede i en forsvindings grad af den forbedrede vedhæftning set tidligere (figur 2c).
Sammenlignet med hipsc-cm-Ri gruppen blev kontraktile Force i hipsc-cm+ Ri gruppen reduceret med 32%, og i hipsc-cm+ RA gruppen (hipsc-CMS forbehandlet med rock aktivator, tabel over materialer 1), blev det forhøjet med 42% ( Figur 3a). I mellemtiden, sammenlignet med hiPSC-CM-Ri gruppen, Peak calcium forbigående fluorescens (peak δf/F0) for hipsc-cm+ RI gruppen blev reduceret med 41%, og calcium forbigående varighed (CaTD50) blev reduceret med 11% (figur 3b , C). I modsætning hertil blev peak ΔF/F0 for hipsc-cm+ RA -gruppen forhøjet med 48%, og CaTD50 blev forhøjet med 13% (figur 3b, C).
Desuden reducerede en forbehandling af kardiomyocytterne med Y-27632 i 12 timer før transplantationen signifikant ekspression af cTnI og cTnT (figur 3D), som begge er troponin (TN) under enheder, der regulerer kardiomyocyt-sammentrækning.
Svarende til Y-27632, en verapamil forbehandling (1 μM, 12 h) signifikant øget engraftment hastighed af hiPSC-CMs i induceret MI mus. Hypotesen blev bekræftet ved observation af et øget der-signal i bioluminescens assay (figur 4a) og et øget antal hctnt/Hna-dobbelt positive celler på dag 7 og 28 efter celletransplantation (figur 4b).
Figur 1: Y-27632 forbehandling øget engraftment hastighed af hiPSC-CMS i mi mus hjerter. A) standard kurve for bli-målinger. (B) luciferin signal i NOD/scid mus behandlet med PBS, Hipsc-CMS-Ri, eller hipsc-CMS+ Ri på dag 3, 7, og 28 efter operationen. n = 6-9 mus pr. gruppe. *P < 0,05 vs. PBS; † P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-Ri. C) immun farvning af hjerte sektioner for hcTnT og Hna. Skala stænger = 100 μm (10x billeder); 20 μm (40x billeder). n = 5 mus pr. gruppe. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-Ri. D) repræsentative billeder af hjerte sektioner, som er plettet med phalloidin og hcTnT. Scale bar = 20 μm. n = 5 mus pr. gruppe. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-Ri. E) repræsentative billeder af hjerte sektioner til Tunel-farvning. Scale bar = 20 μm. n = 4-6 mus pr. gruppe. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-Ri. Dette tal er blevet ændret fra Zhao et al.18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Y-27632 forbedrede vedhæftningen af hiPSC-CMS ved at opretholde ekspression af adhæsions proteiner. (A og B) Western blot analyse af ekspression af anti ß1, N-cadherin og fosforylering af MLC2 (p-MLC2) i hipsc-CMS behandlet med RI og i ikke-behandlet hipsc-CMS. N = 5 replikater pr. gruppe. C) hctnt immunofluorescens farvning analyse af-Ri og + Ri hipsc-CMS med og uden forbehandling af anti-n-cadherin (N-CAD) og anti-integrin ß1 (integ) antistoffer. Skala stænger = 100 μm. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-Ri; † P < 0,05 vs. Hipsc-CMS+ Ri. Dette tal er blevet ændret fra Zhao et al.18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: forbehandling med Y-27632 reducerede kontraktilitet af hiPSC-CMS og ned-reguleret ekspression af hjertetroponin under enheder. A) kvantificering af den procentvise forkortelse af hipsc-CMS, der er EKSPONERET for Ri-og RA-behandling. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-Ri; † P < 0,05 vs. Hipsc-CMS+ Ri. (B og C) repræsentative billeder og kvantificering af forbigående calcium målinger af hipsc-CMS behandlet med RI og RA og af en ikke-behandlet gruppe. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-Ri; † P < 0,05 vs. Hipsc-CMS+ Ri. D) Western blot analyse af ekspression af hjertetroponin under enheder (ctnc, ctnt og ctni) i hipsc-CMS behandlet med RI og RA og i en ikke-behandlet gruppe. Dette tal er blevet ændret fra Zhao et al.18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: verapamil forbehandling forbedrede engraftment raten for hiPSC-CMS i mi-mus. A) luciferin-signalet i NOD/scid-mus behandlet med PBS, Hipsc-CMS-vereller hipsc-CMS+ ver på dag 3, 7 og 28 efter operationen. n = 8 mus pr. gruppe. *P < 0,05 vs. PBS; † P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-ver. B) immun farvning af hjerte sektioner for hcTnT og Hna. Til 10x billeder, skala stænger = 100 μm (10x billeder); 20 μm (40x billeder). n = 5 mus pr. gruppe. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMS-ver. Dette tal er blevet ændret fra Zhao et al.18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vigtigste trin i denne undersøgelse omfatter at opnå ren hiPSC-CMs, forbedre aktiviteten af hiPSC-CMs gennem Y-27632 forbehandling, og endelig, transplantere en præcis mængde hiPSC-CMs i en mus MI model.
De centrale spørgsmål, der blev behandlet her, var, at vi først optimerede de glucosefri rensningsmetoder19 og etablerede et nyt effektivt rensningssystem. System proceduren omfattede anvendelse af celle dissociations enzymer, genbeplantning af celler i gelatine belagte plader, dyrkning af cellerne i neutraliserings mediet i 24 timer efter replating og minimering af fordøjelsestid for cellerne før transplantation, alle af disse blev udført for at opnå den højeste aktivitet af cellerne samtidig opnå ren kardiomyocytter.
For det andet, vi uddybet på forbehandling af hiPSC-CMs med Y-27632 ved 12 h før celle injektion. Anoikis er normalt induceret af ændringen af cellernes adhæsion proteiner, såsom integriner4,20 og N-cadherin21, der fører til aktivering af apoptotiske pathway. Vi påviste, at Y-27632 forbehandling kunne fremme adhæsion af hipsc-CMS til transplantations stedet ved at opretholde ekspression af anti β1 og N-cadherin, undertrykke ekspression af p-MLC2, som er relateret til ændringer i cytoskelet arkitektur22,23. Syv dage efter hiPSC-CM transplantation resulterede hiPSC-CMs+ Ri i et større celle engraftment område, finere definerede stang former, og en mere komplet cytoskelet organisation sammenlignet med Hipsc-CMS-Ri (figur 1b-D).
For det tredje etablerede vi et nyt intracellulært indsprøjtningssystem i mus MI-modeller, med 5 μL pr. injektionssted for nøjagtigt at injicere det påkrævede antal celler, samtidig med at man undgår et fald i musens overlevelsesrate på grund af overdreven Injektionsvolumen.
For det fjerde uddybede vi, hvordan man afgør ændringer i celle sammentrækning og calcium forbigående i hiPSC-CMs efter forbehandling med RI eller RA. Vi fandt, at Y-27632 kan reversibelt reducere cellernes kontraktilitet og calcium forbigående. Hypotesen her er, at på grund af den lavere energibehov af de transplanterede celler, engraftment sats steg. Lignende virkninger kan opnås ved hjælp af calcium kanal hæmmeren verapamil. Den foreslåede mekanisme, der resulterer i kontraktilitet hæmning, er, at Y-27632 reducerer ekspression af troponin under enheder cTnT og cTnI i hiPSC-CMs.
Den vigtigste begrænsning er, at Y-27632 kun spillede en forbigående rolle under transplantationen. Hvordan man kan hæmme Rho kinase i en længere periode, og dermed yderligere forbedre transplantations effektiviteten af hiPSC-CMs, er et problem, der skal løses i fremtiden. Som for flere anvendelser af denne metode, kan ROCK inhibitor ikke kun forbedre aktiviteten af kardiomyocytter under transplantation, men også øge aktiviteten af andre celler; Derfor kan det også bruges under forbehandlingen i transplantations processerne i andre celler. Desuden er den fremgangsmåde, der præsenteres her, en god eksperimentel fundament for mere forskning i hjertesygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Joseph C. Wu (Stanford University) for venligt at give Fluc-GFP konstruere og Dr. Yanwen Liu for fremragende teknisk assistance. Denne undersøgelse er støttet af National Institutes of Health RO1 tilskud HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (til J.Z.), og HL121206A1 (til L.Z.), og en R56 Grant HL142627 (til W.Z.), en amerikansk hjerte forening videnskabsmand udvikling Grant 16SDG30410018, og University of Alabama på Birmingham Faculty Development Grant (til W.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
