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Bioengineering

एक के साथ इंजीनियर Biofilms के तीन आयामी Patterning यह अपने आप Bioprinter

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59477
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2
1Department of Bionanoscience & Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 2Department of Biology, University of Rochester
* These authors contributed equally

Summary

इस लेख में एक कम लागत वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर एक जीवाणु 3D प्रिंटर है कि नमूनों biofilms के मुद्रण की सुविधा कर सकते में बदलने की एक विधि का वर्णन है । बायोफिल्मस और बायो-इंक को तैयार करने के सभी आवश्यक पहलुओं का वर्णन किया गया है, साथ ही बायोफिल्म्स के गठन का आकलन करने के लिए सत्यापन के तरीके भी बताए गए हैं ।

Abstract

Biofilms एक स्व में एंबेडेड बैक्टीरिया का समुच्चय है spatially नमूनों extracellular मैट्रिक्स का उत्पादन किया । एक biofilm के भीतर बैक्टीरिया बढ़ाया एंटीबायोटिक प्रतिरोध है, जो संभावित स्वास्थ्य खतरों बन गया है विकसित, लेकिन यह भी पीने के पानी की शुद्धि के रूप में पर्यावरण अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद हो सकता है । विरोधी बैक्टीरियल चिकित्सा और biofilm प्रेरित अनुप्रयोगों के आगे विकास, biofilm निर्माण के लिए प्रतिलिपि बनाने योग्य, इंजीनियनीय तरीकों के विकास की आवश्यकता होगी । हाल ही में, biofilm तैयारी का एक उपंयास विधि एक संशोधित तीन आयामी एक जीवाणु स्याही के साथ (3D) प्रिंटर का उपयोग कर विकसित किया गया है । यह लेख इस कुशल, कम लागत 3 डी बायोप्रिंटर कि जीवाणुजनित-प्रेरित सामग्री प्रसंस्करण में कई अनुप्रयोगों प्रदान करता है बनाने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन है । प्रोटोकॉल एक अनुकूलित वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर जिसमें extruder एक जैव स्याही एक सिरिंज पंप एक नियंत्रणीय सक्षम, जैव स्याही के सतत प्रवाह को सक्रिय करने के लिए कनेक्ट मशीन के साथ प्रतिस्थापित किया गया है के साथ शुरू होता है । बायोफिल्म प्रिंटिंग के लिए उपयुक्त बायो-इंक को विकसित करने के लिए, इंजीनियर एचेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया को एल्जिनेट के सॉल्यूशन में निलंबित कर दिया गया, ताकि वे कैल्शियम युक्त सतह के संपर्क में जम जाएं । मुद्रण सब्सट्रेट के भीतर एक प्रेरक रसायन का समावेश biofilm प्रोटीन की अभिव्यक्ति मुद्रित जैव स्याही के भीतर ड्राइव । इस विधि मुद्रित biofilms के असतत परतों से बना विभिन्न स्थानिक पैटर्न के 3 डी मुद्रण के लिए सक्षम बनाता है । इस तरह के spatially नियंत्रित biofilms मॉडल सिस्टम के रूप में सेवा कर सकते है और कई क्षेत्रों में अनुप्रयोगों है कि समाज पर एक व्यापक प्रभाव एंटीबायोटिक प्रतिरोध की रोकथाम या पीने के पानी के शुद्धिकरण सहित, में मिल सकता है, दूसरों के बीच ।

Introduction

वर्तमान में एक बढ़ती जरूरत है spatially-नमूनों सामग्री के उत्पादन के लिए पर्यावरण के अनुकूल, टिकाऊ समाधान विकसित करने के लिए, इस तरह की सामग्री के लिए बाजार के विस्तार की संख्या के कारण1। यह लेख इस तरह की सामग्री के उत्पादन के लिए एक सरल, किफायती तरीका प्रस्तुत करता है और इसलिए भविष्य के अनुप्रयोगों के एक बड़े स्पेक्ट्रम की पेशकश । विधि यहां प्रस्तुत की अनुमति देता है तीन आयामी (3 डी) spatially-patterned संरचनाओं के मुद्रण एक जैव-स्याही युक्त रहने वाले बैक्टीरिया का उपयोग कर । बैक्टीरिया एक सप्ताह से अधिक के लिए मुद्रित संरचनाओं के भीतर व्यवहार्य रहते हैं, बैक्टीरिया को प्राकृतिक या इंजीनियर चयापचय गतिविधियों प्रदर्शन करने के लिए सक्षम । मुद्रित बैक्टीरिया इस प्रकार उत्पादन और मुद्रित संरचना के भीतर वांछित घटक जमा कर सकते हैं, उदाहरण के लिए एक कार्यात्मक पार से जुड़े biofilm2बनाने ।

उंनत सामग्री के उत्पादन के लिए पारंपरिक तरीकों उच्च ऊर्जा व्यय शामिल (जैसे, उच्च तापमान और/या दबाव) और रासायनिक अपशिष्ट की बड़ी मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं, अक्सर विषाक्त पदार्थ है कि लागत-व्यापक उपयोग की आवश्यकता3 ,4. इसके विपरीत, एकाधिक बैक्टीरियल प्रजातियों सामग्री है कि विभिंन उद्योगों में आसानी से लागू किया जा सकता है का उत्पादन करने में सक्षम हैं । इन सामग्रियों में पॉलीहाइड्रॉक्सीऐल्कानोट्स (फ़्लिपकार्ट)5 या पॉली (ग्लाइकोलाइड-सह-लैक्टाइड) (पीजीएलए)6, बैक्टीरियल सेलुलोस7, बैक्टीरियल कंक्रीट मैटेरियल्स8, बायोमिकल कंपोजिट9, जैसे पॉलिमर शामिल हैं । एमिलॉयड आधारित चिपकने वाले10, या जैव आधारित विद्युत स्विच11, दूसरों के बीच में । इसके अलावा, मूल्यवान सामग्री के जीवाणु उत्पादन आमतौर पर लगभग परिवेश तापमान और दबाव और जलीय वातावरण में जगह लेता है, की आवश्यकता होती है या जहरीले यौगिकों के उत्पादन के बिना. जबकि साहित्य में बैक्टीरिया के साथ सामग्री का उत्पादन किया गया है और कुछ औद्योगिक अनुप्रयोगों पहले से ही12,13उभरा है, स्थानिक ऐसी सामग्रियों के नमूनों के लिए एक विश्वसनीय तरीका एक चुनौती बनी हुई है ।

यह लेख एक 3 डी बैक्टीरियल प्रिंटर में एक कम लागत वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर परिवर्तित करने के लिए एक सीधे आगे की विधि प्रदर्शित करता है । इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे तैयार करने के लिए एक जैव स्याही युक्त और जीवित बैक्टीरिया को बनाए रखने, साथ ही कैसे substrates तैयार करने के लिए जिस पर 3 डी मुद्रण प्रदर्शन किया जा सकता है । इस विधि प्राकृतिक और इंजीनियर बैक्टीरियल उपभेदों सामग्री का उत्पादन करने में सक्षम की एक किस्म के साथ प्रयोग करने के लिए उपयुक्त है । इन बैक्टीरिया स्थानिक रूप एक 3 डी मुद्रित संरचना के भीतर वितरित किया जा सकता है और अभी भी उनकी चयापचय गतिविधि जारी है, जो वांछित बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित सामग्री का एक स्थानिक वितरण में परिणाम होगा ।

इस मुद्रण विधि biofilms के additive के निर्माण में सक्षम बनाता है, एक आत्म उत्पादित extracellular मैट्रिक्स से घिरे बैक्टीरिया के समुच्चय । Biofilms विषमांगी 3 डी नेटवर्क है जिसमें प्रोटीन, पॉलिमर, जीवाणु कोशिकाओं, ऑक्सीजन, और पोषक तत्वों सभी स्थानिक रूप14संरचित कर रहे हैं । जबकि एक biofilm के रूप में, जीवाणु एक वृद्धि हुई एंटीबायोटिक प्रतिरोध और संरचनात्मक मजबूती, उंहें चिकित्सा कैथेटर और प्रत्यारोपण सहित सतहों से उंमूलन मुश्किल बना प्रदर्शन । Biofilm संपत्तियों के लिए महत्वपूर्ण है, और भी biofilm अनुसंधान के लिए सबसे बड़ी चुनौती है, biofilm की विविधता15,16,17लगता है । स्थानिक-नियंत्रित मॉडल बायोफिल्ंस का उत्पादन विशेष रूचि का होता है, क्योंकि यह जैव-फिल्म घटकों के आकाशीय पैटर्न को या तो पुन: उत्पादित करने या समस्वरण के लिए अनुमति देगा, लगभग किसी भी सतह पर बायोफिल्ंस के स्थिर जमाव को समझने में सहायता करेगा । प्रकृति.

इस अनुच्छेद 3 डी-मुद्रित hydrogels युक्त इंजीनियर ई. कोलाई बैक्टीरिया है कि एक प्रेरक की उपस्थिति में biofilms प्रोटीन का उत्पादन, साथ ही biofilms निर्माण के सत्यापन के तरीकों का उपयोग कर biofilms के उत्पादन के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है2 . इन जैव-फिल्मों के प्रमुख कोशिकामय मैट्रिक्स घटक हैं कर्ली एमीलॉयड फाइबर18 जिनमें स्व-संयोजित सीएसजीए प्रोटीन होते हैं । जब इंजीनियर ई. कोलाई बैक्टीरिया csga प्रोटीन व्यक्त करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं, वे एक स्थिर मॉडल biofilm कि कोशिकाओं की रक्षा के खिलाफ मुद्रण सतह से धोया जा रहा है फार्म । इस तरह के एक 3 डी मुद्रित biofilm और स्थानिक रूप नियंत्रित किया जा सकता है multiscale biofilm संरचना की जांच के लिए एक उपयोगी अनुसंधान उपकरण के रूप में सेवा कर सकते है-फंक्शन यांत्रिकी या भौतिकविज्ञान19। ये bespoke biofilms biofilms गठन और उनके यांत्रिक गुणों के सिद्धांतों की समझ सहायता, अंय अनुप्रयोगों के बीच एंटीबायोटिक प्रतिरोध के तंत्र में आगे अनुसंधान को सक्षम करेगा ।

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Protocol

1. एक 3 डी बायोप्रिंटर में एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर के रूपांतरण

  1. प्रिंटर फ्रेम से एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर (सामग्री की मेज) के extruder और हीटर निकालें, और मुख्य सर्किट बोर्ड से इन तत्वों को नियंत्रित तारों हाल चलाना (चित्रा 1a) । प्रिंटर के संचालन तापमान को नियंत्रित करता है कि सेंसर के बाद से प्रिंटर सॉफ्टवेयर के साथ संवाद करने के लिए कार्यात्मक होने की जरूरत है, मुद्रण सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म है कि देरी मुद्रण जब तक परिचालन तापमान तक पहुँच गया है से हटा दें ।
  2. एक सिरिंज पंप में लोड एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के लिए सिलिकॉन टयूबिंग (1 मिमी के भीतरी व्यास) के माध्यम से एक पिपेट टिप (२०० μl टिप) कनेक्ट । 3 डी प्रिंटर extruder सिर पर मूल extruder के लिए एक प्रतिस्थापन के रूप में पिपेट टिप माउंट (चित्र 1b) ।
  3. यदि एक से अधिक प्रकार की बायो-इंक का उपयोग किया जाएगा, तो प्रिंटर पर अतिरिक्त ट्यूबिंग सिस्टम (एस) और पिपेट टिप (ओं) को माउंट करें ।

2.3 डी मुद्रण के लिए सब्सट्रेट तैयारी

  1. 1% w/v आगर के ४०० एमएल के लिए 5 एम cacl2 समाधान के 4 मिलीलीटर में जोड़ें दुबरिया-bertani शोरबा (पौंड) माध्यम में भंग, उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं और प्रेरकों के साथ पूरक (यहां ३४ μg/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल और ०.५% rhamnose) ।
  2. प्रत्येक १५० मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में £-आगर समाधान के 20 मिलीलीटर बांटना । सूखी 30 मिनट ढक्कन आधा खुला के साथ कमरे के तापमान पर ।
    नोट: इन प्रिंटिंग सबस्ट्रेट्स को 4 डिग्री सेल्सियस तक कई दिनों तक संग्रहित करके प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है ।

3. जैव स्याही तैयारी

  1. एक सोडियम alginate समाधान (3% w/) तैयार है, और उबलते बिंदु करने के लिए तीन बार गर्मी समाधान जीवाणुरहित करने के लिए । उपयोग किए जाने तक 4 ° c पर संग्रहीत ।
  2. ई. कोलाई MG1655 प्रो Δcsga ompR234 (ई. कोलाई δcsga) जीवाणु plasmids ले जाने के pSB1C3-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (gfp) (संरचक जीएफपी अभिव्यक्ति)2 या PSB1C3-gfp-csga (संरचक जीएफपी अभिव्यक्ति, rhamnose-inducible csga) अभिव्यक्ति) ३७ ° c में २५० rpm पर झटकों के साथ लेग बाइ मीडियम के ५० मिलीलीटर में ३४ μg/mL क्लॉरॅंफेनिकोल और ०.५% rhamnose युक्त ।
  3. ३,२२० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए कोशिका संस्कृति केंद्राभ बैक्टीरिया गोली करने के लिए । सुपरनेटंट को हटा दें ।
  4. पौंड मध्यम के 10 मिलीलीटर में बैक्टीरिया गोली को फिर से निलंबित और 10 मिलीलीटर सोडियम alginate (3% w/v) जोड़ें ।

4.3 डी मुद्रण प्रक्रिया

  1. स्थापित करें और एक कंप्यूटर पर 3 डी प्रिंटिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) को खोलने । 3D प्रिंटर को कंप्यूटर से कनेक्ट करें । X, Y और Z अक्षों के लिए होम बटन क्लिक करके प्रिंटीहेड को उसके घर की स्थिति में ले जाएं ।
  2. प्रत्येक प्रिंट के लिए, प्रिंटिंग बेड पर किसी विशेष स्थान पर एक तैयार प्रिंटिंग सब्सट्रेट रखें ।
  3. Z अक्ष में प्रिंटाहेड की ऊंचाई कैलिनेट करें ।
    1. प्रिंटहेड को मैन्युअल कंट्रोल के तहत 22 एमएम की ऊंचाई पर उठाएं, ताकि वह मनचाहे पोजिशन पर जाने पर पेट्री डिश के किनारे से टकरा न जाए । थाली का प्रिंटआउट ऊपर की ओर करें और उसे तब तक नीचे की ओर ले जाएं जब तक कि पिपेट टिप मुद्रण सतह से संपर्क न करे । इस Z-अक्ष की स्थिति को Z1 (मुद्रण सतह की ऊंचाई) के रूप में असाइन करें ।
    2. प्रिंटाहेड उठाएं, और इसे X, Y और Z अक्षों में मैंयुअल नियंत्रण द्वारा प्लेट क्षेत्र के बाहर ले जाएं । यदि printhead और प्लेट सतह के बीच कार्य दूरी Z2 के रूप में परिभाषित किया गया है, मुद्रण के दौरान Z-मान के रूप में मुद्रण प्रोग्राम में Z1 + Z2 दर्ज करें ।
  4. वांछित प्रक्षेप पथ के अनुसार एक स्व-विकसित बिन्दु-बिन्दु निर्देशांक-निर्धारित विधि द्वारा मुद्रण आकृति को प्रोग्राम करें ।
    1. यदि वांछित प्रक्षेप पथ एक सीधी रेखा है, तो केवल प्रारंभ और अंत बिंदुओं को परिभाषित करें । घुमावदार लाइनों पर अतिरिक्त अंक सहित चिकनी घटता में परिणाम होगा । प्रिंटाहेड को मैंयुअल रूप से हर बिंदु पर क्रमिक रूप से ले जाएं, और इन बिंदुओं के निर्देशांकों को क्रमानुसार रिकॉर्ड करें । इन सभी निर्देशांकों के साथ-साथ प्रत्येक मुद्रित खंड के लिए G-कोड संपादक में प्रिंसहेड गतिमान गति दर्ज करें ।
  5. मुद्रण से पहले और बाद में, प्रिंटाहेड को प्लेट एज (20 मिमी) से अधिक दूरी पर उठाएं, और सीधे प्लेट क्षेत्र से बाहर ले जाएं । एक जी कोड फ़ाइल के रूप में इस कार्यक्रम को बचाने और बाद में प्रिंट में उपयोग के लिए सीधे लोड, जबकि फिर से प्रत्येक नए मुद्रण सब्सट्रेट के लिए Z अक्ष ऊंचाई को मापने ।
    नोट: एक वर्ग मुद्रण के लिए एक उदाहरण G-कोड के लिए तालिका 1 देखें ।
  6. पूर्व क्रमादेशित जी कोड फ़ाइल लोड । सॉफ्टवेयर में जी कोड संपादक खोलें, और वांछित आकार मुद्रण के लिए आदेश में कार्यक्रम । प्रत्येक कमांड लाइन पर, प्रिंहैड की स्थिति को X, Y, और/या Z अक्ष में परिवर्तित किया जा सकता है । के रूप में सभी मुद्रण चरणों के दौरान Z मान इनपुट Z1 + Z2 (मुद्रण सतह की ऊंचाई + काम दूरी).
    नोट: चलती गति भी समायोज्य है; ९,००० mm/min ठेठ मुद्रण दरों के लिए एक उपयुक्त मूल्य है ।
  7. सिरिंज (एस) में तरल जैव स्याही लोड, और उन्हें 3 डी bioprinter के सिरिंज पंप (ओं) में माउंट.
  8. मुद्रण सब्सट्रेट पर बायो-इंक प्रिंट करें बटन पर क्लिक करके मुद्रित करें ।
  9. मुद्रण के दौरान, प्रिंटहेड आंदोलन को पूरी तरह से सॉफ़्टवेयर द्वारा नियंत्रित करें । मुद्रण सतह के संपर्क में आने से पहले मैंयुअल रूप से सिरिंज पंप प्रारंभ करें ।
    नोट: सिरिंज पंप और प्रिंटर के समंवय का अनुभववाद से बाहर निकालना गति, जिस पर प्रिंसहेड पहले प्रिंट बिंदु पर ले जाता है, और प्रिंटरहैड की प्रारंभिक स्थिति के आधार पर निर्धारित किया गया है । यदि प्रारंभिक प्रिंटहेड स्थिति 20 एमएम है, तो ९,००० mm/min की प्रिंटहेड गति और ०.१ mL/h की एक्सट्रूज़न गति के साथ, मुद्रण प्रारंभ होने के तुरंत बाद सिरिंज पंप को प्रारंभ करें । यदि एक्सट्रूज़न की गति ०.१ mL/h से ०.३ mL/h को बदल दिया जाता है, तो प्रिंटिंग शुरू होने के बाद सिरिंज पंप को प्रारंभ करने के लिए 2 − 3 s प्रतीक्षा करें ।
  10. जैसे ही प्रिंटाहेड प्रिंटिंग के अंतिम बिंदु पर पहुंचता है, सिरिंज पम्प को बंद कर दीजिये । इस सिरिंज पंप को रोकने से पहले प्रिंटहेड मुद्रण प्रक्रिया के अंत में ऊपर लिफ्टों, अंयथा अतिरिक्त जैव स्याही मुद्रण सब्सट्रेट पर छोड़ देंगे और मुद्रण संकल्प को कम ।
  11. 3D संरचनाओं के निर्माण के लिए, G-कोड संपादक में प्रिंटाहेड के सभी आंदोलनों को नियंत्रित करें । प्रथम परत की मुद्रण ऊंचाई में लिखें । G-कोड में ०.२ मिलीमीटर मुद्रण ऊँचाई बढ़ाने के लिए दूसरी परत के लिए Z-मान बढ़ाएँ । इसके बाद, उच्च परत में जाने पर ०.१ मिलीमीटर तक जेड-वैल्यू बढ़ाएं । प्रिंटिंग प्रक्रिया के दौरान थाली को न हिले ।
  12. चौड़ाई और मुद्रित hydrogel की ऊंचाई को मापने के लिए, एक इस्पात शासक के नीचे या नमूना के बगल में रखा का उपयोग करें ।

5. बढ़ रही है और ई. कोलाई द्वारा biofilm उत्पादन की प्रभावशीलता का परीक्षण

  1. Biofilm घटकों के उत्पादन की अनुमति देने के लिए 3 − 6 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर मुद्रित नमूनों को क्यूबेट करें (कर्ली फाइबर) । छवि एक कैमरा या फ्लोरोसेंट स्कैनर का उपयोग कर प्लेटें ।
  2. Alginate मैट्रिक्स भंग करने के लिए, जोड़ने के 20 मिलीलीटर की ०.५ एम सोडियम साइट्रेट समाधान (पीएच = 7 NaOH के साथ समायोजित) मुद्रण substrates के लिए, और 30 के लिए सेने के साथ 3 घंटे के तापमान पर मिलाते हुए rpm । तरल और छवि प्लेटों फिर से साइट्रेट उपचार से पहले प्लेटों की छवियों के साथ तुलना करने के लिए फेंक दें ।

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Representative Results

Biofilms के सफल 3D मुद्रण के लिए पहला कदम एक bioprinter में एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर परिवर्तित है । इस रूपांतरण प्रिंटर के बाहर निकालना और हीटर, एक बहुलक स्याही के साथ मुद्रण के लिए डिजाइन को हटाने के द्वारा हासिल की है, और उपकरणों के साथ इन की जगह जैव-स्याही रहने वाले बैक्टीरिया से युक्त मुद्रण के लिए उपयुक्त (चित्र 1क) । Extruder एक पिपेट टिप (या टिप्स, अगर एकाधिक जैव स्याही मुद्रण प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जाएगा) एक सिरिंज पंप से जुड़े एक टयूबिंग प्रणाली से जुड़ी (चित्र 1b) से प्रतिस्थापित किया जाता है । एक बायोप्रिंटर में वाणिज्यिक प्रिंटर के सफल रूपांतरण की क्षमता के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है के लिए वांछित जैव स्याही (एस) के माध्यम से सिरिंज पंप से टयूबिंग प्रणाली और पिपेट टिप (ओं) के माध्यम से एक मुद्रण सतह पर लीक या हीटिंग के बिना जैव स्याही । यदि प्रिंटिंग के दौरान बायो-इंक के प्रवाह के कारण ट्यूबिंग bulges, यह मोटा दीवारों के साथ ट्यूबिंग द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस मुद्रण तकनीक के लिए व्यावसायिक 3D प्रिंटर के किसी भी प्रकार के साथ काम करने में सक्षम होना चाहिए, जिसके लिए ट्यूबिंग printhead से जुड़ा जा सकता है ।

3 डी बायोप्रिंटर दो आयामी (2 डी) और 3 डी आकार (चित्रा 2) की एक किस्म में बैक्टीरिया encapsulating hydrogels बना सकते हैं । मुद्रण सब्सट्रेट में कैल्शियम आयन पिंडन (alginate कार्बोक्सिल समूहों के साथ कैल्शियम आयनों की कीलन) मुद्रण पर जैव स्याही, एक ठोस hydrogel में तरल जैव स्याही बदलने के लिए प्रेरित करते हैं । बायोक्रिटिंग का रेजोल्यूशन एक्सट्रूज़न की गति, पिपेट टिप के साइज, प्रिंसटाड की गति, वॉल्यूम और कैसंट्रेशन ऑफ CaCl2 सॉल्यूशन को एगर सॉल्यूशन में मिलाया जाएगा, प्रिंटिंग सतह की फ्लैकनेस और चिपचिपापन बायो इंक का इस्तेमाल किया । CaCl2 समाधान की एकाग्रता हाइड्रोजेल sharpness पर एक बड़ा प्रभाव है. चार अलग सांद्रता CaCl2 (०.१ मीटर, ०.२ मीटर, 1 मीटर, और 5 मीटर) नमूने थे, और केवल 5 एम cacl2 समाधान के परिणामस्वरूप हाइड्रोजेल कि मुद्रण के बाद धुंधला नहीं हो गया. अतः 5 उ का चयन CaCl2 विलयन के इष्टतम सांद्रण के रूप में किया गया ।

इस प्रोटोकोल के पूर्ववर्ती संस्करण में एगार प्लेट को डालने से पहले ऐगार विलयन में मिश्रित करने के स्थान पर CaCl2 विलयन को आगार प्लेट की सतह पर लगाया गया था । इस संस्करण का उपयोग करते समय, CaCl2 समाधान की मात्रा मुद्रण गुणवत्ता और समाधान पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. एक १५० x 15 मिमी पेट्री डिश का उपयोग करते समय, मुद्रण सतह पर बहुत अधिक तरल शेष में परिणाम १०० से अधिक μL (या एक ९०-mm पेट्री डिश के लिए 30 μL) के कैल्शियम क्लोराइड समाधान की मात्रा लागू । यह तरल असमान फैल सकता है जब थाली ले जाया गया है, जो काम कर दूरी बदल सकते है और कारण पिपेट टिप रुकावट । CaCl2 की बहुत अधिक मात्रा भी मुद्रित hydrogels के समाधान के पार तैरने और स्लाइड करने के लिए, आकार और मुद्रित hydrogels की स्थिति को बदलने का कारण बन सकता है. कैल्शियम क्लोराइड समाधान की मात्रा बहुत छोटा है, तो थाली के कुछ क्षेत्रों cacl2 समाधान प्राप्त नहीं हो सकता है और गरीब हाइड्रोजेल solidification होगा. इस उंनत प्रोटोकॉल में, CaCl2 समाधान सीधे आगर समाधान में जोड़ने से पहले आगर थाली डालने का कार्य सतह पर लागू विधि, जिसके परिणामस्वरूप की तुलना में मुद्रण सब्सट्रेट की सतह पर काफी कम नमी के परिणामस्वरूप नाटकीय रूप से सुधार मुद्रण संकल्प ।

बहिर्वेधन गति और प्रिंटरहैड मूवमेंट अन्योन्याश्रित होते हैं और मुद्रण रिज़ॉल्यूशन में परिवर्तन करने के लिए समन्वित तरीके से ट्यून किए जा सकते हैं । उदाहरण के लिए, यदि प्रिंटर ०.१ ml/h और ०.५ ml/h के बीच एक्सट्रूज़न गति के साथ ३०० mm/min की लगातार प्रिंटहेड मूवमेंट गति के साथ प्रचालित होता है, तो एक्सट्रूज़न स्पीड2,20के बढ़ने से प्रिंटेड हाइड्रोजेल का व्यास बढ़ जाता है । ०.५ से अधिक बहिर्वेधन गति पर, हाइड्रोजेल की मुद्रित रेखाओं के बाहरी किनारों को सीधे, समानांतर रेखाओं से लहरदार रेखाओं में परिवर्तित कर दिया जाता है और रेखा की चौड़ाई भी बढ़ जाती है । प्रिंटाहेड के वेग का भी मुद्रण के संकल्प पर प्रभाव पड़ता है । ०.३ मिलीलीटर/एच की एक निरंतर बाहर निकालना गति के साथ, प्रिंटहेड की गति ३०० mm/min से ५०० mm/मिनट के परिणाम से प्रिंटेड हाइड्रोजेल की चौड़ाई में वृद्धि हो रही है जो संकरा होता जा रहा है, १.८ मिमी से ०.९ मिमी तक कम हो रहा है । यदि प्रिंटहेड गतिमान गति ५०० मिमी/मिनट से अधिक है, तो जेल लाइन आसानी से विच्छिन्न हो जाएगी । एक २०० μl पिपेट टिप और वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया जैव स्याही के लिए, मुद्रण संकल्प के कई संयोजनों इष्टतम (तालिका 2) माना जाता है । पंपिंग गति ०.३ एमएल/एच, प्रिंटहेड मूवमेंट स्पीड ५०० एमएम/मिनट और वर्किंग डिस्टेंस ०.२ एमएम, प्रिंटेड हाइड्रोजेल का उत्पादन लगभग ०.९ एमएम की चौड़ाई के साथ किया जाता है ।

बैक्टीरियल 3D प्रिंटिंग विधि की एक महत्वपूर्ण उपलब्धि के लिए इंजीनियर biofilms बनाने की क्षमता है । एक इंजीनियर और spatially नियंत्रित biofilm बनाने के लिए, बैक्टीरिया केवल 3 डी मुद्रण प्रक्रिया जीवित नहीं होना चाहिए, लेकिन यह भी biofilm घटकों का उत्पादन करना चाहिए, जबकि मुद्रित पैटर्न के भीतर शेष । इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त इंजीनियर ई. कोलाई बैक्टीरिया, ई. कोलाई δcsga प्लाज्मिड pSB1C3-जीएफपी-सीएसजीए ले जाने वाले जीवाणु, कर्ली प्रोटीन की नियंत्रणीय अभिव्यक्ति को सक्षम करते हैं । एक csga-नॉकआउट तनाव का उपयोग सुनिश्चित करता है कि csga प्रोटीन ही व्यक्त किया जाता है जब यह rhamnose के साथ एक प्लाज्मिड से प्रेरित है । यह जीवाणु प्रेरित CsgA प्रोटीन उपइकाइयों का निर्यात करते हैं, जो इसके बाद बैक्टीरिया की बाहरी झिल्ली पर सीएसजीबी प्रोटीन पर21 को कर्ली फाइबर बनाने के लिए स्वयं को इकट्ठा करते हैं । ये एमिलॉयड जैसे तंतु जैवफिल्म बाह्य मैट्रिक्स के प्रमुख प्रोटीनयुक् त घटक हैं: प्रोटीन और पॉलिमर का एक जुड़ा हुआ नेटवर्क जिसमें जीवाणु अंतर्निहित होते हैं । 3D-प्रिंटिंग बायो-इंक के मुद्रित alginate मैट्रिक्स कर्ली उत्पादन प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरिया को शारीरिक समर्थन और संरचना बख्शी है । संरचक जीएफपी अभिव्यक्ति का उपयोग फ्लोरोसेंस इमेजिंग के माध्यम से मुद्रित कक्षों के दृश्यावलोकन और मात्रा के लिए अनुमति देता है ।

Biofilm के गठन सफल रहा है या नहीं, यह पता लगाने के क्रम में, alginate मैट्रिक्स एक सोडियम साइट्रेट समाधान का उपयोग कर भंग कर दिया गया था, और साइट्रेट उपचार के बाद मुद्रित जैव स्याही के आकार का आकलन किया गया था (चित्रा 3). जैव-स्याही के मामले में बिना उद्योग कर्ली उत्पादन प्लाज्मिड, मुद्रित पैटर्न पूरी तरह से सोडियम साइट्रेट उपचार के बाद भंग कर दिया गया था, वाचक है कि कोई biofilm कर्ली नेटवर्क का गठन किया था (चित्रा 3a, B). Inducible कर्ली उत्पादन प्लाज्मिड युक्त बैक्टीरिया के मामले में, जेल सोडियम साइट्रेट उपचार के बाद भंग नहीं किया गया था (चित्रा 3c, D). यह परिणाम इंगित करता है कि मुद्रित बैक्टीरिया के लिए एक कर्ली पर्याप्त व्यापक बैक्टीरिया2के मुद्रित पैटर्न को स्थिर करने के लिए फार्म करने में सक्षम थे ।

बहुस्तरीय संरचनाओं के निर्माण के लिए, अतिरिक्त परतों को मुद्रित किया गया (चित्रा 4) जी कोड संपादक में प्रिंट ऊंचाई और प्रिंट प्रक्षेप पथ का समायोजन करके । एक नमूने में मुद्रित परतों की संख्या में वृद्धि के कारण चौड़ाई और मुद्रित संरचनाओं की ऊंचाई संवर्द्धित वृद्धि करने के लिए (चित्रा 5)2,20, लेकिन यहां तक कि 5 परत मुद्रित संरचनाओं एक संकल्प के साथ बनाया जा सकता है मिलीमीटर के उप-मिलीमीटर के लिए । जब ई. कोलाई को उत्पादित करने के लिए इंजीनियर ने कर्ली प्रोटीन को बहुस्तरीय संरचनाओं में मुद्रित किया गया तो सोडियम साइट्रेट उपचार ने नमूनों को भंग नहीं किया सोडियम साइट्रेट समाधान में भंग (चित्रा 6). यह प्रयोग दर्शाता है कि इंजीनियर biofilms बहुस्तरीय, तीन आयामी मुद्रित संरचनाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक परत मुद्रित संरचनाओं में बनाया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक 3 डी bioprinter में एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर के रूपांतरण दिखा तस्वीरें । (क) वाणिज्यिक 3d प्रिंटर से रूपांतरण के बाद 3d बायोरिइंटर के घटक । (ख) एक पिपेट टिप से जुड़ी एक टयूबिंग प्रणाली द्वारा गठित बायो-इंक extruder । एक से अधिक प्रकार की बायो-इंक का मुद्रण करने में उपयोग के लिए, अंय प्रिंटिग छिद्र में अतिरिक्त मुद्रण युक्तियां जोड़ी जा सकती है या प्रिंटाहैड में अतिरिक्त छिद्र जोड़कर । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:3d बायोप्रिंटेड पैटर्न के उदाहरण ई. कोलाई pSB1C3-gfp-csga युक्त । ये इमेज प्रिंटिंग के दो दिन बाद ली गई । इस मुद्रण संकल्प पंपिंग गति के साथ प्राप्त किया गया था ०.३ एमएल/एच, प्रिंटहेड आंदोलन गति ३०० mm ०.२/ इन आकृतियों को मुद्रित करने के लिए G-कोड्स पूरक फ़ाइलोंमें मिल सकता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: यह सत्यापित करने की विधि कि क्या ई. कोलाई बैक्टीरिया द्वारा एक मुद्रित पद्धति के भीतर biofilm घटकों का उत्पादन किया गया है । जब ई. कोलाई मुद्रित एक प्लाज्मिड कि कर्ली प्रेरण के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना नहीं था निहित, मुद्रित पैटर्न पूरी तरह से सोडियम साइट्रेट उपचार (ए और बी) द्वारा भंग कर दिया गया था । जब ई. कोलाई जिसमें एक प्लाज्मिड कूटलेखन इंडोसिबल कर्ली प्रोटीन का प्रयोग किया जाता था, तो मुद्रित जैव फिल्म सोडियम साइट्रेट उपचार (सी और डी) के लिए प्रतिरोधी थी । प्रोग्रामिंग प्रक्रिया और इस वर्ग पैटर्न मुद्रण के लिए जी कोड की व्याख्या 1 तालिकामें प्रदान की जाती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: शीर्ष दृश्य (A) और साइड व्यू (B) बहु-स्तरित मुद्रित संरचनाओं के ई. कोलाई pSB1C3-Gfp-csga युक्त । यह नमूना पंपिंग स्पीड ०.३ एमएल/एच, प्रिंटहेड मूवमेंट स्पीड २०० एमएम/न्यूनतम और वर्किंग डिस्टेंस ०.२ एमएम के साथ छपा था । कृपया इस आंकड़े का कोई बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: लाइन चौड़ाई और मुद्रित परतों की अलग संख्या युक्त प्रिंट hydrogels की ऊंचाई. माप पंपिंग गति ०.३ एमएल/एच, प्रिंटहेड मूवमेंट स्पीड ५०० एमएम/न्यूनतम और वर्किंग डिस्टेंस ०.२ एमएम के साथ छपे नमूनों पर किया गया । कृपया इस आंकड़े का कोई बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: यह सत्यापित करने की विधि कि क्या ई. कोलाई बैक्टीरिया द्वारा बहु-परत मुद्रित संरचनाओं के भीतर biofilm घटकों का उत्पादन किया गया है । इंजीनियर ई. कोलाई 1 में छपा था, 3, या 5 परत hydrogels और 6 दिनों के लिए इनक्यूबेटेड । जब मुद्रित ई. कोलाई में एक प्लाज्मिड निहित था जो कर्ली प्रेरण के लिए सांकेतिक नहीं था, तो सोडियम साइट्रेट ट्रीटमेंट (a और B) द्वारा मुद्रित पैटर्न को पूरी तरह से भंग कर दिया गया था । जब मुद्रित ई. कोलाई में एक प्लाज्मिड कूटलेखन इंडोसिबल कर्ली प्रोटीन निहित था, तो मुद्रित जैव फिल्म सोडियम साइट्रेट उपचार (सी और डी) के लिए प्रतिरोधी थी । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

जी कोड कमानों कार्य
G1 Z20 F9000 Z-अक्ष को एक ९,००० mm/min गतिमान गति के साथ 20 मिमी की ऊँचाई तक उठाएं ।
G1 X95 Y65 F9000 एक ९,००० mm/min गतिमान गति के साथ पहली पंक्ति के प्रारंभिक बिंदु पर जाएँ ।
G1 Z6 F9000 Z-दिशा में नीचे की ओर ले जाएं एक उचित (यहां Z = 6 मिमी) मुद्रण दूरी ।
G1 X95 Y105 F300 पहली पंक्ति का अंतिम बिंदु और दूसरी पंक्ति का प्रारंभिक बिंदु ।
G1 X135 Y105 दूसरी पंक्ति का अंतिम बिंदु और तीसरी पंक्ति का प्रारंभिक बिंदु ।
G1 X135 Y65 तीसरी पंक्ति का अंतिम बिंदु और चौथी पंक्ति का प्रारंभिक बिंदु ।
G1 X95 Y65 चौथी पंक्ति का अंतिम बिंदु और पहली पंक्ति का प्रारंभिक बिंदु; एक चौकोर बनता है ।
G1 Z20 F9000 Z-अक्ष को 20 मिमी की ऊंचाई पर ९,००० मिमी/मिनट पर उठाएं ।
G1 X55 Y40 F9000 पेट्री डिश रेंज के बाहर एक समंवय (५५, ४०) के लिए ले जाएं ।

तालिका 1: प्रोग्रामिंग प्रक्रिया और जी के स्पष्टीकरण एक वर्ग मुद्रण के लिए कोड ।

एक्सट्रूज़न स्पीड (एमएल/ प्रिंटहेड गतिमान गति (mm/min) जेल चौड़ाई (मिमी)
०.१ १०० १.६ ± ०.१
०.१ २०० १.१ ± ०.१
०.१ ३०० १.० ± ०.१
०.३ ३०० १.८ ± ०.१
०.३ ४०० १.२ ± ०.१
०.३ ५०० ०.९ ± ०.१
०.५ २०० २.२ ± ०.२
०.५ १,२०० १.२ ± ०.२
०.७ २०० २.८ ± ०.१
०.७ १,२०० १.३ ± ०.१

तालिका 2: उच्च संकल्प के साथ हाइड्रोजैल के लिए इष्टतम मुद्रण मापदंडों । प्रत्येक शर्त के लिए पांच अंक मापा गया । औसत मान और मानक विचलन तालिका में दिखाए जाते हैं ।

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Discussion

इंजीनियर बायोफिल्म्स के 3डी प्रिंटिंग के लिए यहां पेश किए गए प्रोटोकॉल में दो अहम कदम हैं । सबसे पहले आगार छपाई सतह की तैयारी है, जो एक विशिष्ट मुद्रण संकल्प के उत्पादन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक है । यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मुद्रण सतह सपाट है और प्रिंटहैड पर पिपेट टिप सतह से सही ऊंचाई पर स्थित है । अगर सतह सपाट नहीं है, तो प्रिंटिंग प्रक्रिया के दौरान काम करने की दूरी बदल जाएगी । यदि काम करने की दूरी ०.१ मिमी से कम है, तो CaCl2 समाधान पिपेट टिप के अंदर प्रवेश कर सकता है और हाइड्रोजेल गठन का कारण बनता है, जिससे पिपेट टिप को भरा जाता है । यदि काम करने की दूरी ०.३ मिमी से अधिक है, तो जेल लगातार मुद्रित नहीं किया जा सकता है । इस अध्ययन में इष्टतम काम दूरी ०.२ मिमी है । सपाट आगार मुद्रण सतहों की तैयारी के लिए अच्छा दृष्टिकोण बड़े व्यास पेट्री व्यंजन (१५०-mm-व्यास पेट्री डिश के बजाय एक ९०-मिमी व्यास प्लेट) का उपयोग करने के लिए कर रहे हैं, एक फ्लैट मेज पर प्लेटों जगह, आगर डालना तेजी से और भी गति के साथ समाधान है, और अपनी जम के दौरान आगर थाली ले जाने से बचें ।

दूसरा महत्वपूर्ण कदम पम्पिंग गति सहित वांछित प्रिंटिंग पैरामीटर का चयन, बायो-इंक का चिपचिपापन, और प्रिंटिग स्पीड, जो परिणामी प्रिंटिंग रिज़ॉल्यूशन निर्धारित करता है । इन पैरामीटर्स का कुशल तरीके से चयन करने के लिए, उपयोगकर्ता प्रत्येक सेट की शर्तों के लिए मुद्रित हाइड्रोजेल की चौड़ाई को देखते हुए, निरंतर बाहर निकालना दर के साथ प्रिंटहेड गति के लिए कई चरम मानों का नमूना ले सकता है । फिर, 4 अंय बाहर निकालना दरों के साथ इस प्रयोग दोहराएं । अगला, अनुप्रयोग के लिए श्रेष्ठ मुद्रण रिज़ॉल्यूशन का उत्पादन पाँच संयोजन ले, और इच्छित रिज़ॉल्यूशन प्राप्त होने तक छोटे और छोटे चरणों में मुद्रण पैरामीटर (पम्पिंग और प्रिंटाहेड गति) दोनों भिन्न हो ।

मुद्रित लाइनों की मोटाई स्थिर biofilms बनाने के लिए मुद्रित इंजीनियर बैक्टीरिया की क्षमता पर एक प्रभाव है । इष्टतम मुद्रण शर्तों (पम्पिंग स्पीड ०.३ एमएल/एच, प्रिंटहेड स्पीड ३०० एमएम/न्यूनतम, और कार्यशील दूरी ०.२ मिमी) के तहत, बायो-इंक की मुद्रित लाइनों से कमरे के तापमान पर ऊष्मायन के 3-6 दिनों के बाद स्थिर बायोफिल्म्स का उत्पादन होगा । यदि रेखाएं मोटी हो जाती हैं, जैसे पम्पिंग की गति को बढ़ाकर, तो प्रत्येक लाइन के मध्य क्षेत्रों को साइट्रेट-स्थिर biofilms का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त रूप से प्रेरित नहीं किया जा सकता है ।

जब एक बहु परत जैव स्याही hydrogel मुद्रण, प्रत्येक मुद्रित परत कैल्शियम आयनों है कि पिछले मुद्रित परत में विसित है संपर्क पर जम रहा है । के बाद से Ca2 + मुद्रण सब्सट्रेट में एकाग्रता उच्च है, ca2 + आयन तेजी से नीचे परतों के माध्यम से फैलाना कर सकते हैं. इसलिए, ऊपरी परतों मुद्रित किया जा सकता है तुरंत बाद पिछले परतों मुद्रित किया गया है, बस जी कोड संपादक में प्रिंट ऊंचाई का समायोजन करके । इसके अतिरिक्त, ऊपरी परत की छपाई की दूरी को पिछले परत की छपाई की दूरी से केवल 0.1 − 0.2 मिमी अधिक तक सीमित किया जाना चाहिए । यदि जोड़ा गया मुद्रण दूरी ०.१ मिमी से कम है, टिप पहली परत भर में खींचें और मुद्रित hydrogel के संकल्प को कम करेगा । यदि जोड़ा गया मुद्रण दूरी ०.२ मिमी से अधिक है, तो बायो-इंक बाहर निकालना के दौरान तरल की बूंदों के रूप में होगा, जिससे प्रिंटेड हाइड्रोजेल विच्छिन्न हो जाएगा ।

वर्तमान बायोक्रिटिंग प्रकिया, जैव फिल्म यांत्रिक गुणों या biofilms बैक्टीरिया के जैविक प्रतिरोध के अध्ययन में उपयोग के लिए उपयुक्त प्रतिलिपि बनाने योग्य, spatially-नियंत्रित इंजीनियर biofilms के उत्पादन में सक्षम बनाता है सहित विभिंन कारकों एंटीबायोटिक दवाओं, सर्फेक्टेंट, आदि इस क्षमता को प्रस्तावित विधि का एक सीधा प्रयोज्य सुनिश्चित करता है । उच्च परिशुद्धता के विकास-यह अपने आप (DIY) bioprinters की संभावना मुद्रण काम दूरी को बनाए रखने के द्वारा संभव हो जाएगा, लेकिन पंपिंग गति को कम करने और printhead की गति चलती है, या अलग extruder geometries नमूना द्वारा और जैव स्याही रसायन । मुद्रण समाधान के लिए भविष्य में सुधार के साथ, अतिरिक्त अनुप्रयोगों जैसे ऊतक इंजीनियरिंग या दवा वितरण सक्षम किया जा सकता है । यहां वर्णित 3 डी bioprinting दृष्टिकोण भी बैक्टीरिया प्रजातियों है कि हमारे alginate आधारित जैव स्याही के साथ biocompatible है के अतिरिक्त प्रकार के मुद्रण के लिए विस्तार किया जा करने में सक्षम होना चाहिए । वर्तमान प्रोटोकोल, जीवाणुरहित सीरिंज और प्रिंटिंग युक्तियों का उपयोग करके बायो-इंक को तैयार करने के दौरान बारबार उबालने, और बायो-इंक और प्रिंटिंग प्लेट में एंटीबायोटिक दवाओं का प्रयोग करके पर्याप्त बंध्यता प्रदान करता है । जंगली प्रकार के बैक्टीरिया का उपयोग करने वाले भविष्य के प्रयोगों को प्रिंट के बीच टयूबिंग प्रणाली को बदलने या कीटाणुविसंक्रमित करने जैसे अतिरिक्त नसबंदी उपायों की आवश्यकता हो सकती है ।

' लेखकों का सबसे अच्छा ज्ञान करने के लिए, प्रस्तुत विधि (मूलतः Lehner एट अल.20में विकसित) बैक्टीरिया के 3 डी मुद्रण के लिए एक additive विनिर्माण शैली के पहले प्रकाशित उदाहरण है । इस प्रोटोकोल के पहले भाग में बैक्टीरिया की 3डी प्रिंटिंग के लिए इस सामान्य विधि का विस्तार से वर्णन किया गया है, जो कि इंजीनियर बायोफिल्मस के उत्पादन में लगाया जाता है2। 3 डी-प्रिंटेड biofilms के कई भविष्य के अनुप्रयोगों के इस विधि का उपयोग संभव है । प्रकृति में, कई जीवाणु प्रणालियों विकसित किया है कि biofilms के विभिंन प्रकार बनाने के लिए, जिनमें से इस अनुच्छेद में एक ही प्रणाली का पता लगाया गया था । बैसिलस सबटिलियों या एसीटोबैक्टर जाइलिनमजैसे अन्य बैक्टीरियल सिस्टम के साथ 3डी प्रिंटेड बायोफिल्म्स बनाकर कई अन्य सिस्टम को आसानी से जांचा जा सकता है । ऑप्टिकल संकेतों का उपयोग करते हुए उच्च विभेदन पर जीवाणुओं के स्थानिक नमूनों के लिए वैकल्पिक पद्धतियां23,24 भी विकसित की गई हैं । इन तरीकों और अधिक महंगा है, जटिल उपकरण उंहें इस प्रिंटर की तुलना में प्राप्त करने की आवश्यकता है, और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर बैक्टीरिया के patterning के लिए ही उपयुक्त हैं ।

इस विधि के साथ स्थानिक रूप पैटर्न 3 डी-मुद्रित biofilms करने की क्षमता है कि प्राकृतिक biofilms की स्थानिक विषमता को पुन: पेश इंजीनियर biofilms के निर्माण के लिए अनुमति कर सकते है25। जैवफिल्म के भीतर प्रोटीन और पॉलीमेरिक रेशों की अत्यधिक विस्तृत व्यवस्था के कारण, एक जैवफिल्म अवस्था में जीवाणु रासायनिक और भौतिक उद्दीनों के प्रति बहुत अधिक प्रतिरोध प्राप्त करते हैं, जैसे कि उसी की तुलना में एंटीबायोटिक्स के प्रति प्रतिरोधक क्षमता में वृद्धि एक प्लैकटॉनिक अवस्था में बैक्टीरिया । इसके अलावा, एक biofilm के भीतर बैक्टीरिया द्रव प्रवाह के लिए एक वृद्धि की प्रतिरोध दिखाने के रखरखाव और implantable चिकित्सा उपकरणों की बंध्यता बहुत अधिक मुश्किल26बना । Biofilms घटकों के विशिष्ट स्थानिक वितरण को पुन: पेश करने का प्रयास है कि एक biofilms के भीतर बैक्टीरिया प्रतिरोध phenotypes प्राप्त करने के तंत्र का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को एक एकार्ड ग्रांट (सं.) द्वारा समर्थित किया गया था । FA2386-18-1-4059), नेनो विज्ञान कार्यक्रम के फ्रंटियर्स के भाग के रूप में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO/OCW), और उंनत सामग्री NWO-NSFC कार्यक्रम (No. 729.001.016) । लेखकों रेमन वान der Valk और रोलाण्ड Kieffer की प्रयोगशाला सहायता स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer CoLiDo 3D-P Kit
3D printing software CoLiDo Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar Sigma-Aldrich 05040
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C7902
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Chloramphenicol Sigma-Aldrich 3886.1
LB broth powder Sigma-Aldrich L3022
Orbital shaker VWR 89032-092 Model 3500
Petri dish VWR 25384-326 150 x 15 mm
Rhamnose Sigma-Aldrich 83650
Silicon tubing VWR  DENE 3100103/25
Syringe pump ProSense B.V.  NE-300
Sodium alginate Sigma-Aldrich W201502
Sodium citrate monobasic Sigma-Aldrich 71498
Sodium hydrooxide VWR 28244.295

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References

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