Summary
Dit artikel beschrijft een methode voor het transformeren van een goedkope commerciële 3D-printer in een bacteriële 3D-printer die het afdrukken van gedessineerde biofilmen kan vergemakkelijken. Alle noodzakelijke aspecten van de voorbereiding van de bioprinter en bio-Ink worden beschreven, evenals verificatiemethoden om de vorming van biofilmen te beoordelen.
Abstract
Biofilms zijn aggregaten van bacteriën ingebed in een zelf geproduceerde ruimtelijk-patroon extracellulaire matrix. Bacteriën in een biofilm te ontwikkelen verbeterde antibioticaresistentie, die potentiële gevaren voor de gezondheid vormt, maar kan ook gunstig zijn voor milieu-toepassingen, zoals zuivering van drinkwater. De verdere ontwikkeling van anti-bacteriële therapeutische en biofilm-geïnspireerde toepassingen zal de ontwikkeling van reproduceerbare, ingenieurable methodes voor biofilm verwezenlijking vereisen. Onlangs is een nieuwe methode van biofilm voorbereiding met behulp van een aangepaste driedimensionale (3D) printer met een bacteriële inkt is ontwikkeld. Dit artikel beschrijft de stappen die nodig zijn om deze efficiënte, goedkope 3D bioprinter die meerdere toepassingen in bacteriële-geïnduceerde materiaal verwerking biedt te bouwen. Het protocol begint met een aangepaste commerciële 3D-printer waarin de extruder is vervangen door een bio-inkt dispenser aangesloten op een spuitpomp systeem waardoor een controleerbare, continue stroom van bio-inkt. Om een bio-inkt te ontwikkelen die geschikt is voor het drukken van biofilm, werden de gemanipuleerde bacteriën van Escherichia coli opgeschort in een oplossing van alginaat, zodat zij in contact met een oppervlakte stollen die calcium bevat. De opneming van een inductor chemisch product binnen het druk substraat drijft uitdrukking van biofilm proteïnen binnen de gedrukte bio-inkt. Deze methode maakt het mogelijk 3D-afdrukken van verschillende ruimtelijke patronen, bestaande uit discrete lagen van gedrukte biofilmen. Dergelijke ruimtelijk gecontroleerde biofilmen kunnen als modelsystemen dienen en kunnen toepassingen in veelvoudige gebieden vinden die een brede invloed op de maatschappij, met inbegrip van antibiotische weerstands preventie of drinkwaterreiniging, onder anderen hebben.
Introduction
Er is momenteel een toenemende behoefte aan milieuvriendelijke, duurzame oplossingen te ontwikkelen voor de productie van ruimtelijk gedessineerde materialen, als gevolg van het groeiende aantal markten voor dergelijke materialen1. Dit artikel stelt een eenvoudige, economische methode voor de productie van dergelijke materialen voor en biedt daarom een groot spectrum van toekomstige toepassingen aan. De hier gepresenteerde methode maakt het mogelijk driedimensionale (3D) afdrukken van ruimtelijke structuren met behulp van een bio-inkt met levende bacteriën. Bacteriën blijven levensvatbaar binnen de gedrukte structuren voor meer dan een week, waardoor de bacteriën om natuurlijke of engineered metabole activiteiten uit te voeren. Gedrukte bacteriën kunnen daardoor de gewenste componenten binnen de gedrukte structuur produceren en deponeren, bijvoorbeeld het creëren van een functionele cross-linked biofilm2.
Traditionele methoden voor de productie van geavanceerde materialen te betrekken hoge energie-uitgaven (bijv. hoge temperaturen en/of druk) en kan produceren grote hoeveelheden chemisch afval, vaak toxische stoffen die kosten-uitgebreid gebruik vereisen3 ,4. In tegenstelling, meerdere bacteriële soorten zijn in staat om materialen die gemakkelijk toepasbaar kunnen zijn in verschillende industrieën te produceren. Deze materialen omvatten polymeren zoals polyhydroxyalkanoaten (PHA)5 of poly (glycolide-co-lactide) (PGLA)6, bacteriële cellulose7, bacteriële concrete materialen8, Biomimetic composieten9, amyloid lijmen10, of Bio-based elektrische schakelingen11, onder anderen. Bovendien, bacteriële productie van waardevolle materialen meestal plaatsvindt op bijna-omgeving temperaturen en druk en in waterige omgevingen, zonder dat of het produceren van toxische verbindingen. Terwijl de productie van materialen met bacteriën is aangetoond in de literatuur en sommige industriële toepassingen zijn al naar voren gekomen12,13, een betrouwbare methode voor ruimtelijke patroon van dergelijke materialen blijft een uitdaging.
Dit artikel toont een rechttoe rechtaan methode van het omzetten van een goedkope commerciële 3D-printer in een 3D-bacteriële printer. Het protocol laat zien hoe u een bio-inkt voor te bereiden met en het behoud van de levende bacteriën, alsmede hoe substraten op waarop de 3D-druk kan worden uitgevoerd voor te bereiden. Deze methode is geschikt om te gebruiken met een verscheidenheid van natuurlijke en gemanipuleerde bacteriestammen in staat om materialen te produceren. Deze bacteriën kunnen ruimtelijk worden verdeeld binnen een 3D-gedrukte structuur en nog steeds hun metabole activiteit, die zal resulteren in een ruimtelijke verdeling van de gewenste materialen geproduceerd door de bacterie.
Deze drukmethode maakt additieve productie van biofilmen, aggregaten van bacteriën omgeven door een zelf geproduceerde extracellulaire matrix. Biofilms zijn heterogene 3D-netwerken waarin eiwitten, polymeren, bacteriële cellen, zuurstof en voedingsstoffen zijn allemaal ruimtelijk gestructureerd14. Terwijl in de vorm van een biofilm, bacteriën vertonen een verhoogde antibioticaresistentie en structurele robuustheid, waardoor ze moeilijk uit te roeien van oppervlakken, waaronder medische katheters en implantaten. De sleutel tot biofilm eigenschappen, en ook de grootste uitdaging voor biofilm onderzoek, lijkt de heterogeniteit van de biofilmen15,16,17. De productie van ruimtelijk gecontroleerde model biofilmen is van bijzonder belang omdat het de ruimtelijke patronen van biofilm componenten zou kunnen reproduceren of afstemmen, waardoor het begrip van de stabiele afzetting van biofilmen op vrijwel elk oppervlak in Aard.
Dit artikel presenteert een methode voor de productie van biofilmen met behulp van 3D-gedrukte hydrogels met gemanipuleerde E. coli bacteriën die biofilm eiwitten te produceren in de aanwezigheid van een inductor, alsmede de methoden van verificatie van de biofilm formatie2 . De belangrijkste extracellulaire matrix componenten van deze biofilmen zijn curli kuller amyloid vezels18 die zelf-geassembleerd CsgA eiwitten bevatten. Wanneer de ontworpen E. coli bacteriën worden bewogen om CsgA proteïnen uit te drukken, vormen zij een stabiel model biofilm dat de cellen tegen wordt weggespoeld van de drukoppervlakte beschermt. Een dergelijke 3D gedrukte biofilm kan ruimtelijk worden gecontroleerd en kan dienen als een nuttig onderzoek instrument voor het onderzoek van multischaalde biofilm structuur-functie mechanica of materiomics19. Deze op maat gemaakte biofilmen zullen het begrip van de principes van biofilm vorming en hun mechanische eigenschappen helpen, die verder onderzoek naar de mechanismen van antibiotische weerstand onder andere toepassingen toelaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. conversie van een commerciële 3D-printer in een 3D-bioprinter
- Verwijder de extruder en de kachel van een commerciële 3D-printer (delijst van materialen) van de printer frame, en haal de bedrading regelen van deze elementen van de belangrijkste printplaat (Figuur 1a). Aangezien de sensor die de operationele temperatuur van de printer controleert moet functioneel zijn om met de printersoftware te communiceren, uit de druk software het algoritme verwijderen dat vertragingen druk tot de operationele temperatuur wordt bereikt.
- Verbind een pipet uiteinde (200 µ L tip) via siliconen buizen (binnendiameter van 1 mm) tot een 5 mL spuit in een spuitpomp. Monteer de pipet tip op de 3D-printer extruder hoofd als een vervanging voor de originele extruder (Figuur 1b).
- Als er meer dan een type van bio-inkt zal worden gebruikt, monteren extra buizenstelsel (s) en pipet tip (s) op de printer.
2. ondergrond voorbereiding voor 3D printen
- Voeg 4 mL 5 M CaCl2 oplossing toe aan 400 ml van 1% w/v agar opgelost in Luria-Bertani Bouillon (lb) medium, aangevuld met passende antibiotica en inducerende (hier 34 µ g/ml chlooramfenicol en 0,5% rhamnose).
- Doseer 20 mL van de LB-agar oplossing in elke 150 mm x 15 mm Petri schaaltje. Droog 30 min bij kamertemperatuur met het deksel half open.
Opmerking: het protocol kan hier onderbroken worden door deze druk substraten op te slaan bij 4 °C gedurende maximaal enkele dagen.
3. bio-inkt voorbereiding
- Bereid een natrium alginaat oplossing (3% w/v), en verhit naar het kookpunt drie keer om de oplossing te steriliseren. Opslag bij 4 °C tot gebruikt.
- Grow e. coli MG1655 Pro ΔcsgA ompR234 (e. coli ΔcsgA) bacteriën die plasmiden pSB1C3-groene fluorescente proteïne (GFP) (constitutieve GFP uitdrukking)2 of pSB1C3-GFP-CsgA (constitutieve GFP uitdrukking, rhamnose-afleidbaar CsgA expressie) overnachting bij 37 °C met schudden bij 250 rpm in 50 mL van LB medium met 34 µ g/mL chlooramfenicol en 0,5% rhamnose.
- Centrifugeer de cel cultuur voor 5 min bij 3.220 x g om de bacteriën te korrelen. Verwijder de bovendrijvende.
- Re-Suspend de bacterie pellet in 10 mL LB medium en voeg 10 mL natrium alginaat (3% w/v).
4.3D drukproces
- Installeer en open de software voor 3D-afdrukken (delijst met materialen) op een computer. Sluit de 3D-printer aan op de computer. Verplaats de printkop naar de thuis positie door op de knop ' Startpagina ' te klikken voor de X-, Y-en Z-as.
- Plaats voor elke afdruk een voor bereide druk substraat op een bepaalde locatie op het afdruk bed.
- Kalibreer de hoogte van de printkop in de Z-as.
- Verhoog de printkop tot een hoogte van 22 mm onder handmatige controle, zodat het niet zal botsen met de rand van de petrischaal bij het verplaatsen naar de gewenste positie. Plaats de printkop overtop van de plaat en verplaats deze naar beneden tot de pipet-Tip contact met het afdruk oppervlak heeft. Wijs deze Z-as-positie toe als Z1 (de hoogte van het afdruk oppervlak).
- Verhoog de printkop en verplaats deze buiten het plaat gebied door handmatige bediening in de X-, Y-en Z-as. Als de werkafstand tussen de printkop en het plaatoppervlak wordt gedefinieerd als Z2, voert u Z1 + Z2 in het afdruk programma in als de Z-waarde tijdens het afdrukken.
- Programma de drukvorm door een zelf-ontwikkelde punt-voor-punt coördinaat-bepaalde methode volgens het gewenste traject.
- Als het gewenste traject een rechte lijn is, definieer dan alleen de begin-en eindpunten. Inclusief extra punten op gebogen lijnen zal resulteren in vloeiender bochten. Verplaats de printkop handmatig naar elk punt sequentieel, en noteer de coördinaten van deze punten in volgorde. Voer al deze coördinaten en de printkop bewegende snelheid voor elk gedrukt segment in de G-code-editor.
- Voor en na het afdrukken, til de printkop op een afstand hoger dan de plaat rand (20 mm), en beweeg direct uit de plaat regio. Sla dit programma op als een G-codebestand en laad het direct voor gebruik in volgende afdrukken, terwijl u de hoogte van de Z-as opnieuw meet voor elk nieuw substraat.
Opmerking: Zie tabel 1 voor een voorbeeld G-code voor het afdrukken van een vierkant. - Laad het voorgeprogrammeerde G-codebestand. Open de G-code editor in de software, en het programma in de commando's voor het afdrukken van de gewenste vorm. Op elke opdrachtregel kan de positie van de printkop worden gewijzigd in de X-, Y-en/of Z-as. Voer de Z-waarde tijdens alle druk stappen in als Z1 + Z2 (hoogte van drukoppervlak + werkafstand).
Opmerking: de bewegende snelheid is ook instelbaar; 9.000 mm/min is een geschikte waarde voor typische printsnelheden. - Laad de vloeibare bio-inkt in de spuit (en) en monteer ze in de spuitpomp (en) van de 3D bioprinter.
- Druk de bio-inkt af op het druk substraat door op de knop afdrukken te klikken.
- Tijdens het afdrukken, controle van de printkop beweging volledig door de software. De spuitpomp handmatig starten voordat de printkop in contact komt met het drukoppervlak.
Opmerking: de coördinatie van de spuitpomp en de printer wordt empirisch bepaald afhankelijk van de extrusie snelheid, de snelheid waarmee de printkop naar het eerste afdruk punt gaat en de beginpositie van de printkop. Als de oorspronkelijke printkop positie 20 mm bedraagt, met een printkop snelheid van 9.000 mm/min en een extrusie-snelheid van 0,1 mL/h, start u de spuitpomp onmiddellijk nadat het afdrukken is gestart. Als de extrusie snelheid wordt gewijzigd van 0,1 mL/h tot 0,3 mL/h, wacht dan 2 − 3 s om de spuitpomp te starten nadat het afdrukken is gestart. - Stop de spuitpomp zodra de printkop bij het laatste afdruk punt aankomt. Stop de spuitpomp voordat de printkop opheft aan het einde van het drukproces, anders overtollige bio-inkt zal dalen op de drukkerij substraat en vermindering van de afdrukresolutie.
- Voor de bouw van 3D-structuren, de controle van alle bewegingen van de printkop in de G-code-editor. Typ de afdruk hoogte van de eerste laag. Verhoog de Z-waarde in de G-code met 0,2 millimeter voor de tweede laag om de afdruk hoogte te verhogen. Daarna, Verhoog de Z-waarde met 0,1 millimeter wanneer het bewegen zich aan een hogere laag. Verplaats de plaat niet tijdens het drukproces.
- Voor het meten van de breedte en hoogte van de gedrukte hydrogel, gebruik een stalen liniaal geplaatst onder of naast het monster.
5. kweken en testen van de effectiviteit van de productie van biofilm door E. coli
- Incubeer de gedrukte monsters bij kamertemperatuur voor 3 − 6 dagen om de productie van biofilm componenten (curli kuller vezels) mogelijk te maken. Afbeelding van de platen met behulp van een camera of TL-scanner.
- Voor het oplossen van de alginaat matrix, Voeg 20 mL van 0,5 M natrium citraat oplossing (pH = 7 aangepast met NaOH) aan de druk substraten, en incubeer voor 2 uur met 30 rpm schudden bij kamertemperatuur. Gooi de vloeistof en het beeld van de platen weer te vergelijken met de beelden van de platen voor citraat behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste stap voor een succesvolle 3D-druk van biofilmen is het omzetten van een commerciële 3D-printer in een bioprinter. Deze conversie wordt bereikt door het verwijderen van de extruder en de kachel van de printer, ontworpen voor het afdrukken met een polymere inkt, en het vervangen van deze met componenten die geschikt zijn voor het afdrukken van bio-inkt met levende bacteriën (Figuur 1a). De extruder wordt vervangen door een pipet tip (of tips, als meerdere bio-inkten zullen worden gebruikt in het drukproces) aangesloten op een slangen systeem aangesloten op een spuitpomp (Figuur 1b). De succesvolle omzetting van de commerciële drukker in een bioprinter kan worden beoordeeld op basis van de mogelijkheid om de gewenste bio-inkt (s) van de spuitpomp via het slangen systeem en pipet tip (s) over te brengen op een drukoppervlak zonder het lekken of verwarmen van de Bio-inkt. Als de buis zwellingen als gevolg van de stroom van bio-inkt tijdens het afdrukken, kan worden vervangen door buizen met dikkere muren. Opgemerkt moet worden dat deze Druktechniek moet in staat zijn om te werken met elk type van commerciële 3D-printer waarvoor slang kan worden bevestigd aan de printkop.
De 3D bioprinter kan creëren bacteriën-inkapselen hydrogels in een verscheidenheid van twee-dimensionale (2D) en 3D-vormen (Figuur 2). De ionen van het calcium in het druk substraat veroorzaken verharding (chelatie van calciumionen met alginaat carboxyl groepen) van de bio-inkt bij het drukken, het omzetten van de vloeibare bio-inkt in een stevige hydrogel. De resolutie van het bioprinten zal afhangen van de extrusie snelheid, de grootte van de pipet tip, de snelheid van de printkop, het volume en de concentratie van CaCl2 oplossing toegevoegd aan de agar-oplossing, de vlakheid van het drukoppervlak, en de viscositeit van de gebruikte bio-inkt. De concentratie van CaCl2 oplossing heeft een grote invloed op de hydrogel scherpte. Vier verschillende concentraties van CaCl2 (0,1 m, 0,2 m, 1 m, en 5 m) werden bemonsterd, en slechts 5 m CaCl2 -oplossing resulteerde in hydrogel die niet vervagen na het afdrukken. Daarom werd 5 M gekozen als optimale concentratie van CaCl2 -oplossing.
In een vroegere versie van dit protocol, werd de CaCl2 oplossing toegepast op de oppervlakte van de agar-plaat eerder dan gemengd in de agar oplossing alvorens de agar-plaat te gieten. Bij gebruik van deze versie heeft het volume van de CaCl2 -oplossing een kritische invloed op de afdrukkwaliteit en-resolutie. Bij gebruik van een 150 x 15 mm petrischaal, de toepassing van een volume van calciumchloride-oplossing van meer dan 100 µ L (of 30 µ L voor een 90-mm petrischaaltje) resulteert in te veel vloeistof resterende op het drukoppervlak. Deze vloeistof kan ongelijk worden uitgespreid wanneer de plaat wordt bewogen, die de het werkafstand kan veranderen en verstopping van het pipet uiteinde veroorzaken. Te veel volume van CaCl2 kan ook leiden tot gedrukte hydrogels te zweven en glijden over de oplossing, het veranderen van de vorm en de positie van de gedrukte hydrogel. Als het volume van calciumchloride oplossing is te klein, sommige regio's van de plaat kan niet ontvangen CaCl2 oplossing en zal hebben slechte hydrogel stolling. In dit verbeterde protocol, het toevoegen van de CaCl2 -oplossing direct in de agar-oplossing voorafgaand aan het gieten van de agar-plaat resulteerde in aanzienlijk minder vocht op het oppervlak van het druk substraat ten opzichte van de oppervlakte-toegepaste methode, wat resulteert in sterk verbeterde afdrukresolutie.
De extrusie-snelheid en de printkop beweging zijn onderling afhankelijk en kunnen op een gecoördineerde manier worden afgestemd om de afdrukresolutie te wijzigen. Bijvoorbeeld, als de printer wordt bediend met een extrusie snelheid tussen 0,1 ml/h en 0,5 ml/h met een constante printkop beweging snelheid van 300 mm/min, de diameter van de gedrukte hydrogel stijgt met de toename van extrusie snelheid2,20. Bij extrusie snelheden van meer dan 0,5 mL/h, de buitenste randen van de gedrukte lijnen van hydrogel veranderen van rechte, parallelle lijnen naar golvende lijnen, en de lijnbreedte stijgt ook. De snelheid van de printkop heeft ook invloed op de afdrukresolutie. Met een constante extrusie snelheid van 0,3 mL/h, waardoor de snelheid van de printkop van 300 mm/min tot 500 mm/min resulteert in de breedte van de gedrukte hydrogel steeds smaller, afnemende van 1,8 mm tot 0,9 mm. Als de printkop bewegende snelheid is meer dan 500 mm/min, de gel lijn zal gemakkelijk worden discontinue. Voor een 200 µ L pipet Tip en de bio-inkt die in de huidige studie wordt gebruikt, worden verschillende combinaties van de afdrukresolutie als optimaal beschouwd (tabel 2). Bij het pompen snelheid 0,3 mL/h, printkop bewegingssnelheid 500 mm/min, en werkafstand 0,2 mm, gedrukte hydrogel wordt geproduceerd met een breedte van ongeveer 0,9 mm.
Een cruciale prestatie van de bacteriële 3D-drukmethode is de mogelijkheid om gemanipuleerde biofilmen te maken. Voor het maken van een ontworpen en ruimtelijk gecontroleerde biofilm, moet de bacterie niet alleen overleven de 3D-drukproces, maar moet ook produceren biofilm componenten, terwijl de resterende binnen de gedrukte patroon. De engineered e. coli bacteriën gebruikt in dit protocol, e. coli ΔcsgA bacteriën die de plasmide PSB1C3-GFP-CsgA, Enable controleerbare expressie van curli kuller eiwitten. Het gebruik van een csgA-Knockout spanning zorgt ervoor dat csgA proteïne slechts wordt uitgedrukt wanneer het van een plasmide met rhamnose wordt veroorzaakt. De bacteriën exporteren de geïnduceerde CsgA eiwit subeenheden, die vervolgens zelf-assembleren21 op CsgB eiwitten op de bacteriële buitenste membraan22 tot curli kuller vezels vorm. Deze amyloid-achtige vezels zijn de belangrijkste eiwitcomponenten van biofilm extracellulaire matrix: een aangesloten netwerk van eiwitten en polymeren waarin de bacteriën zijn ingebed. De gedrukte alginaat matrix van de 3D-Printing bio-inkt leent fysieke ondersteuning en structuur aan de bacterie tijdens het curli kuller productieproces. Het gebruik van constitutieve GFP expressie zorgt voor visualisatie en kwantificering van gedrukte cellen via fluorescentie Imaging.
Om te beoordelen of de vorming van biofilm succesvol was, werd de alginaat matrix opgelost met behulp van een natrium citraat oplossing, en de vorm van de gedrukte bio-inkt werd beoordeeld na de citraat behandeling (Figuur 3). In het geval van bio-inkt zonder afleidbaar curli kuller productie plasmide, werd het gedrukte patroon volledig opgelost na de behandeling van het natrium citraat, betekenend dat geen biofilm curli kuller netwerk had gevormd (Figuur 3a, B). In het geval van bacteriën die de afleidbaar curli kuller productie plasmide, werd de gel niet opgelost na natrium citraat behandeling (figuur 3c, D). Dit resultaat geeft aan dat de gedrukte bacteriën in staat waren om een curli kuller netwerk te vormen uitgebreid genoeg om het gedrukte patroon van bacteriën te stabiliseren2.
Om structuren met meerdere lagen te bouwen, werden extra lagen gedrukt (Figuur 4) door de afdruk hoogte en het afdruk traject in de G-code-editor aan te passen. Als u het aantal afgedrukte lagen in een steekproef verhoogt, worden de breedte en de hoogte van de afgedrukte structuren stapsgewijs verhoogd (Figuur 5)2,20, maar zelfs 5-laags gedrukte structuren kunnen worden gemaakt met een resolutie millimeters tot sub-millimeters. Toen e. coli ontworpen om inducibly produceren curli kuller eiwitten werden gedrukt in multi-layered structuren, natrium citraat behandeling niet oplossen van de monsters, terwijl multi-layer structuren met niet-curli kuller E. coli waren opgelost in natrium citraat oplossing (Figuur 6). Dit experiment toont aan dat gemanipuleerde biofilmen kunnen worden gemaakt in multi-layered, driedimensionale gedrukte structuren, evenals in single-layer gedrukte structuren.
Figuur 1: Foto's met de conversie van een commerciële 3D-printer in een 3D -bioprinter. (A) de componenten van de 3D-bioprinter na conversie van een commerciële 3D-printer. (B) de bio-inkt extruder gevormd door een slangen systeem bevestigd aan een pipet tip. Extra Print tips kunnen worden toegevoegd in de tweede printkop gat of door het toevoegen van extra gaten aan de printkop, voor gebruik in het afdrukken van meerdere soorten van bio-inkt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: voorbeelden van 3D-biogedrukte patronen met E. coli PSB1C3-GFP-CsgA. Deze beelden werden genomen twee dagen na het afdrukken. Deze druk resolutie werd verkregen met pomp snelheid 0,3 mL/h, printkop bewegingssnelheid 300 mm/min, en werkafstand 0,2 mm. De G-codes voor het afdrukken van deze vormen kunnen worden gevonden in de aanvullende bestanden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: een methode om te verifiëren of biofilm componenten zijn geproduceerd door E. coli bacteriën binnen een gedrukte patroon. Bij het afdrukken van E. coli bevatte een plasmide die niet coderen voor curli kuller inductie, het gedrukte patroon werd volledig opgelost door natrium citraat behandeling (a en B). Toen E. coli met een plasmide codering afleidbaar curli kuller eiwitten werd gebruikt, de gedrukte biofilm was resistent tegen natrium citraat behandeling (C en D). Het programmeringsproces en de uitleg van de G-code voor het afdrukken van dit vierkante patroon zijn opgenomen in tabel 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: bovenaanzicht (a) en zijaanzicht (B) van multi-layered gedrukte structuren die E. coli pSB1C3-GFP-CsgA. Dit monster werd bedrukt met pomp snelheid 0,3 mL/h, printkop bewegingssnelheid 200 mm/min, en werkafstand 0,2 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: de lijnbreedte en hoogte van gedrukte hydrogels met verschillende aantallen gedrukte lagen. De metingen werden uitgevoerd op monsters bedrukt met pomp snelheid 0,3 mL/h, printkop bewegingssnelheid 500 mm/min, en werkafstand 0,2 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: een methode om te verifiëren of biofilm componenten zijn geproduceerd door E. coli -bacteriën binnen Multi-Layer gedrukte structuren. Engineered E. coli werd gedrukt in 1-, 3-of 5-laags hydrogels en uitgebroed gedurende 6 dagen. Wanneer de gedrukte E. coli bevatte een plasmide die niet coderen voor curli kuller inductie, het gedrukte patroon werd volledig opgelost door natrium citraat behandeling (a en B). Wanneer de gedrukte E. coli bevatte een plasmide codering afleidbaar curli kuller eiwitten, de gedrukte biofilm was resistent tegen natrium citraat behandeling (C en D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| G-code commando's | Taken |
| G1 Z20 F9000 | Til de Z-as op een hoogte van 20 mm met een 9.000 mm/min bewegende snelheid. |
| G1 X95 Y65 F9000 | Ga naar het beginpunt van de eerste lijn met een 9.000 mm/min bewegende snelheid. |
| G1 ZARA F9000 | Verplaats naar beneden in de Z-richting naar een goede (hier Z = 6 mm) druk afstand. |
| G1 X95 Y105 F300 | Eindpunt van de eerste regel en het beginpunt van de tweede regel. |
| G1 X135 Y105 | Eindpunt van de tweede lijn en het uitgangspunt van de derde lijn. |
| G1 X135 Y65 | Eindpunt van de derde lijn en het uitgangspunt van de vierde lijn. |
| G1 X95 Y65 | Eindpunt van de vierde lijn en het uitgangspunt van de eerste lijn; Er wordt een vierkant gevormd. |
| G1 Z20 F9000 | Til de Z-as op tot een hoogte van 20 mm bij 9.000 mm/min. |
| G1 X55 Y40 F9000 | Ga naar een coördinaat (55, 40) buiten de Petri schaalbereik. |
Tabel 1: programmering proces en uitleg van G-code voor het afdrukken van een vierkant.
| Extrusie snelheid (mL/h) | Printkop bewegende snelheid (mm/min) | De breedte van het gel (mm) |
| 0,1 | 100 | 1,6 ± 0,1 |
| 0,1 | 200 | 1,1 ± 0,1 |
| 0,1 | 300 | 1,0 ± 0,1 |
| 0,3 | 300 | 1,8 ± 0,1 |
| 0,3 | 400 | 1,2 ± 0,1 |
| 0,3 | 500 | 0,9 ± 0,1 |
| 0,5 | 200 | 2,2 ± 0,2 |
| 0,5 | 1.200 | 1,2 ± 0,2 |
| 0,7 | 200 | 2,8 ± 0,1 |
| 0,7 | 1.200 | 1,3 ± 0,1 |
Tabel 2: de optimale druk parameters voor hydrogels met hoge resolutie. Vijf punten werden gemeten voor elke voorwaarde. De gemiddelde waarde en standaarddeviatie worden weergegeven in de tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier gepresenteerd voor 3D-afdrukken van gemanipuleerde biofilms heeft twee kritieke stappen. Eerst is de voorbereiding van de agar drukoppervlakte, die de meest kritieke factor aan het produceren van een specifieke druk resolutie is. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het drukoppervlak plat is en dat het pipet uiteinde op de printkop op de juiste hoogte van het oppervlak is geplaatst. Als de oppervlakte niet vlak is, zal de het werkafstand tijdens het drukproces veranderen. Als de werkafstand kleiner is dan 0,1 mm, kan de CaCl2 -oplossing binnen de pipet-Tip binnengaan en hydrogel vorming veroorzaken, waardoor de pipet-Tip verstopt raakt. Als de werkafstand meer dan 0,3 mm bedraagt, kan de gel niet continu worden afgedrukt. De optimale werkafstand in deze studie is 0,2 mm. goede benaderingen voor het bereiden van platte agar printen oppervlakken zijn met grotere diameter petrischalen (150 mm-diameter petrischaaltje in plaats van een 90-mm-diameter plaat) te gebruiken, plaats de platen op een platte tafel, giet de agar oplossing met snelle en zelfs snelheid, en Vermijd het bewegen van de agar-plaat tijdens zijn verharding.
De tweede kritieke stap is de selectie van de gewenste druk parameters, waaronder pomp snelheid, viscositeit van de gebruikte bio-inkt, en printkop snelheid, die de resulterende afdrukresolutie bepalen. Om deze parameters op een efficiënte manier te selecteren, kan de gebruiker verscheidene extreme waarden voor de snelheid van de printkop met een constant uitdrijvings tarief bemonsteren, wijzend op de breedte van de gedrukte hydrogel voor elke reeks voorwaarden. Herhaal dit experiment met 4 andere extrusie-tarieven. Daarna, neem de vijf combinaties die de beste druk resolutie voor de toepassing produceerden, en variëren beide druk parameters (het pompen en printkop snelheden) in kleinere en kleinere stappen tot de gewenste resolutie wordt verkregen.
De dikte van de gedrukte lijnen heeft een impact op het vermogen van de gedrukte gemanipuleerde bacteriën om stabiele biofilmen te vormen. Onder optimale drukomstandigheden (pomp snelheid 0,3 mL/h, printkop snelheid 300 mm/min, en werkafstand 0,2 mm), gedrukte lijnen van bio-inkt zal produceren stabiele biofilms na 3-6 dagen van incubatie bij kamertemperatuur. Als de lijnen worden dikker, zoals door het verhogen van de pomp snelheid, de middelste regio's van elke lijn kan niet voldoende worden geïnduceerd om citraat-stabiele biofilmen te produceren.
Bij het afdrukken van een multi-layer bio-Ink hydrogel, elke gedrukte laag is verhard op het contact met de calcium-ionen die zijn verspreid in de vorige gedrukte laag. Aangezien de CA2 + -concentratie in het afdruk substraat hoog is, kunnen CA2 + -ionen snel door de onderste lagen verspreiden. Daarom kunnen de bovenste lagen direct na het afdrukken van de vorige lagen worden afgedrukt, door simpelweg de afdruk hoogte in de G-code-editor aan te passen. Bovendien moet de afdruk afstand van de bovenste laag worden beperkt tot slechts 0,1 − 0,2 mm hoger dan de afdruk afstand van de vorige laag. Als de toegevoegde afdruk afstand kleiner is dan 0,1 mm, sleept de tip over de eerste laag en vermindert u de resolutie van de afgedrukte hydrogel. Als de toegevoegde druk afstand groter is dan 0,2 mm, zal de bio-inkt druppels vloeistof vormen tijdens extrusie, waardoor de gedrukte hydrogel te worden discontinue.
De huidige bioprint aanpak maakt de productie van reproduceerbare, ruimtelijk gecontroleerde biofilmen, geschikt voor gebruik in de studie van biofilm mechanische eigenschappen of biologische resistentie van biofilm bacteriën aan verschillende factoren, waaronder antibiotica, oppervlakteactieve stoffen, enz. Deze mogelijkheid zorgt voor een directe bruikbaarheid van de voorgestelde methode. De ontwikkeling van High-Precision doe-het-zelf (DIY) bioprinters zal waarschijnlijk mogelijk zijn door het handhaven van de drukwerk afstand, maar het verlagen van de pomp snelheid en de bewegende snelheid van de printkop, of door het bemonsteren van verschillende extruder geometrieën en Bio-inkt chemie. Met toekomstige verbeteringen aan de druk resolutie, kunnen de extra toepassingen zoals weefseltechniek of druglevering worden toegelaten. De 3D-bioprinting aanpak hier beschreven moet ook kunnen worden uitgebreid tot het afdrukken van extra soorten bacteriën soorten die biocompatibel zijn met onze alginaat-gebaseerde bio-Ink. Het huidige protocol biedt voldoende steriliteit door herhaaldelijk koken van de bio-inkt tijdens de voorbereiding, met behulp van steriele spuiten en printen tips, en gebruik te maken van antibiotica in zowel de bio-inkt en drukplaat. Toekomstige experimenten met behulp van wild-type bacteriën kunnen vereisen extra sterilisatie maatregelen, zoals het vervangen of ontsmetten van het slangen systeem tussen de prenten.
Om de auteurs ' beste kennis, de gepresenteerde methode (oorspronkelijk ontwikkeld in Lehner et al.20) is het eerste gepubliceerde voorbeeld van een additief fabricage stijl voor 3D-afdrukken van bacteriën. In het eerste deel van dit protocol, is deze algemene methode beschreven in detail voor de 3D-druk van bacteriën, die wordt toegepast op de productie van gemanipuleerde biofilms2. Meerdere toekomstige toepassingen van 3D-gedrukte biofilmen zijn mogelijk met behulp van deze methode. In de natuur, hebben meerdere bacteriële systemen geëvolueerd dat het creëren van verschillende soorten van biofilms, waarvan in dit artikel een enkel systeem werd verkend. Meerdere andere systemen kunnen gemakkelijk worden onderzocht door het creëren van 3D-gedrukte biofilms met andere bacteriële systemen, zoals Bacillus subtilis of Acetobacter xylinum. Alternatieve methoden23,24 zijn ook ontwikkeld voor ruimtelijke patronen van bacteriën met een hoge resolutie met behulp van optische signalen. Deze benaderingen vereisen duurdere, ingewikkelde apparatuur om ze te bereiken in vergelijking met deze printer, en zijn alleen geschikt voor het patroon van genetisch gemanipuleerde bacteriën.
De mogelijkheid om ruimtelijk patroon 3D-gedrukte biofilmen met deze methode kan zorgen voor de oprichting van gemanipuleerde biofilmen die de ruimtelijke heterogeniteit van natuurlijke biofilmen reproduceren25. Door de zeer gedetailleerde opstelling van eiwit en polymere vezels binnen een biofilm, bereiken bacteriën in een biofilm staat een veel hogere weerstand tegen chemische en fysieke prikkels, zoals een verhoogde resistentie tegen antibiotica in vergelijking met dezelfde bacteriën in een planktonische staat. Bovendien, bacteriën in een biofilm tonen een verhoogde weerstand tegen vloeistof stroom, waardoor het onderhoud en de steriliteit van implanteerbare medische apparaten veel moeilijker26. Gedrukte biofilmen die proberen de specifieke ruimtelijke distributies van biofilm componenten te reproduceren zijn krachtige hulpmiddelen voor het bestuderen van de mechanismen waarmee bacteriën in een biofilm resistentie fenotypen bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een AOARD toelage (nr. FA2386-18-1-4059), de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO/OCW) als onderdeel van de grenzen van het programma van de nanowetenschap, en het Advanced Materials NWO-NSFC programma (No. 729.001.016). De auteurs erkennen laboratorium hulp van Ramon van der Valk en Roland Kieffer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M.
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J.
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J.
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
