Summary
Den här artikeln beskriver en metod för att omvandla en billig kommersiell 3D-skrivare till en bakteriell 3D-skrivare som kan under lätta utskrift av mönstrade bio filmer. Alla nödvändiga aspekter av beredningen av bioprinter och bio-Ink beskrivs, liksom verifieringsmetoder för att bedöma bildandet av bio filmer.
Abstract
Bio filmer är aggregat av bakterier inbäddade i en egenproducerad rumsligt mönstrad extracellulär matris. Bakterier inom en biofilm utvecklar förstärkt antibiotika resistens, som utgör potentiella hälso faror, men kan också vara fördelaktigt för miljö tillämpningar såsom rening av dricks vatten. Den fortsatta utvecklingen av anti-bakteriell terapi och biofilm-inspirerade tillämpningar kommer att kräva utveckling av reproducerbara, engineerable metoder för biofilm skapande. Nyligen har en ny metod för biofilm beredning med hjälp av en modifierad tredimensionell (3D) skrivare med en bakteriell bläck har utvecklats. Denna artikel beskriver de steg som krävs för att bygga denna effektiva, billig 3D-bioprinter som erbjuder flera applikationer i bakteriellt inducerad material bearbetning. Protokollet inleds med en anpassad kommersiell 3D-skrivare där extrudern har ersatts med en bio-bläck dispenser ansluten till en spruta pump system som möjliggör en kontrollerbar, kontinuerligt flöde av bio-bläck. För att utveckla en bio-Ink lämplig för biofilm utskrift, konstruerade Escherichia coli bakterier avbröts i en lösning av alginat, så att de stelnar i kontakt med en yta som innehåller kalcium. Införandet av en inducerare kemikalie inom det tryck substrat driver uttryck för biofilm proteiner inom tryckt bio-Ink. Denna metod möjliggör 3D-utskrifter av olika rumsliga mönster som består av diskreta lager av tryckta bio filmer. Sådana rumsligt kontrollerad bio filmer kan fungera som modell system och kan hitta applikationer inom flera områden som har en omfattande inverkan på samhället, inklusive antibiotika resistens förebyggande eller dricks vatten rening, bland annat.
Introduction
Det finns för närvarande ett ökande behov av att utveckla miljö vänliga, hållbara lösningar för produktion av rumsligt mönstrade material, på grund av det växande antalet marknader för sådant material1. Denna artikel presenterar en enkel, ekonomisk metod för produktion av sådana material och erbjuder därför ett stort spektrum av framtida tillämpningar. Den metod som presenteras här tillåter tredimensionell (3D) tryckning av rumsligt mönstrade strukturer med hjälp av en bio-bläck som innehåller levande bakterier. Bakterier förblir livskraftiga inom de tryckta strukturerna i över en vecka, vilket gör det möjligt för bakterierna att utföra naturliga eller konstruerade metaboliska aktiviteter. Tryckta bakterier kan därmed producera och sätta in önskade komponenter inom den tryckta strukturen, till exempel skapa en funktionell tvär bunden biofilm2.
Traditionella metoder för produktion av avancerade material innebär höga energi kostnader (t. ex. höga temperaturer och/eller tryck) och kan producera stora mängder kemiskt avfall, ofta giftiga ämnen som kräver kostnads omfattande användning3 ,4. Däremot kan flera bakterie arter producera material som är lätt att kunna tillämpas i olika branscher. Dessa material inkluderar polymerer såsom polyhydroxialkanoater (PHA)5 eller poly (glykolid-co-lactide) (pgla)6, bakteriell cellulosa7, bakterie betong material8, biomimetiska kompositer9, amyloid-baserade lim10, eller biobaserade elektriska brytare11, bland annat. Dessutom, bakterie produktion av värdefulla material sker typiskt vid nära omgivnings temperaturer och tryck och i vatten miljöer, utan att kräva eller producera giftiga föreningar. Medan producera material med bakterier har visats i litteraturen och vissa industriella tillämpningar har redan dykt upp12,13, en pålitlig metod för rumsliga mönstningar av sådana material är fortfarande en utmaning.
Denna artikel visar en rättfram metod för att omvandla en billig kommersiell 3D-skrivare i en 3D-bakteriell skrivare. Protokollet visar hur man förbereder en bio-bläck som innehåller och upprätthålla levande bakterier, samt hur man förbereder substrat på vilka 3D-utskrift kan utföras. Denna metod är lämplig att använda med en mängd olika naturliga och konstruerade bakterie stammar kunna producera material. Dessa bakterier kan vara rumsligt fördelade inom en 3D-tryckt struktur och fortfarande fortsätta sin metaboliska aktivitet, vilket kommer att resultera i en rumslig fördelning av de önskade materialen som produceras av bakterierna.
Denna tryck metod möjliggör additiv tillverkning av bio filmer, aggregat av bakterier omgivna av en egenproducerad extracellulär matris. Bio filmer är heterogena 3D-nätverk där proteiner, polymerer, bakterie celler, syre och näringsämnen är alla rumsligt strukturerade14. Även i form av en bio film, bakterier uppvisar en ökad antibiotika resistens och strukturell robusthet, vilket gör dem svåra att utrota från ytor inklusive medicinska katetrar och implantat. Nyckeln till biofilm egenskaper, och även den största utmaningen för biofilm forskning, verkar vara heterogenitet av bio filmer15,16,17. Produktion av rumsligt kontrollerad modell bio filmer är av särskilt intresse eftersom det skulle göra det möjligt att antingen reproducera eller trimma den rumsliga mönster av biofilm komponenter, medhjälp förståelsen av den stabila deposition av bio filmer på praktiskt taget alla ytor i Natur.
Denna artikel presenterar en metod för produktion av bio filmer med hjälp av 3D-tryckta vävnadsinväxt som innehåller konstruerade E. coli -bakterier som producerar biofilm proteiner i närvaro av en inducerare, samt metoder för verifiering av biofilm formation2 . De stora extracellulära matrix komponenterna i dessa bio filmer är curli amyloid fibrer18 som innehåller Självmonterade csga proteiner. När konstruerade E. coli bakterier induceras för att uttrycka csga proteiner, bildar de en stabil modell biofilm som skyddar cellerna mot att tvättas bort av tryck ytan. En sådan 3D tryckt biofilm kan rumsligt kontrol leras och kan fungera som ett användbart forsknings verktyg för utredning av multiskala biofilm struktur-funktion mekanik eller materiomik19. Dessa skräddarsydda bio filmer kommer att under lätta förståelsen av principerna för Biofilm bildning och deras mekaniska egenskaper, vilket möjliggör ytterligare forskning om mekanismerna för antibiotika resistens bland andra tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. omvandling av en kommersiell 3D-skrivare till en 3D-bioprinter
- Ta bort extrudern och värmare av en kommersiell 3D-skrivare (tabell över material) från skrivarens RAM, och dra ur ledningar styra dessa element från huvud kretskortet (figur 1a). Eftersom sensorn som styr skrivarens drift temperatur måste fungera för att kunna kommunicera med skrivar programmet, tar du bort från utskrifts programmet den algoritm som fördröjer utskriften tills drift temperaturen har nåtts.
- Anslut en pipettspets (200 μL-spets) via kisel slangen (innerdiametern 1 mm) till en 5 mL spruta i en sprutpump. Montera pipettspetsen på 3D-skrivarens extruderhuvud som ersättning för den ursprungliga extrudern (figur 1b).
- Om mer än en typ av bio-Ink kommer att användas, montera ytterligare rör system (s) och pipettspetsen (s) till skrivaren.
2. substrat förberedelse för 3D-utskrifter
- Tillsätt 4 mL 5 M CaCl2 lösning till 400 ml 1% w/v agar upplöst i Luria-Bertani BULJONG (lb) medium, kompletterat med lämpliga antibiotika och inducerare (här 34 μg/ml kloramfenikol och 0,5% rhamnos).
- Fördela 20 mL LB-agar lösning i varje 150 mm x 15 mm petriskål. Torka 30 min i rums temperatur med locket halvöppet.
Obs: protokollet kan pausas här genom att lagra dessa tryck substrat vid 4 ° c i upp till flera dagar.
3. förberedelse av bio bläck
- Bered en natriumalginatlösning (3% w/v) och Värm till Kok punkten tre gånger för att sterilisera lösningen. Förvaras vid 4 ° c tills det används.
- Grow e. coli MG1655 Pro Δcsga ompR234 (E. coli δcsga) bakterier som transporterar plasmider pSB1C3-grönt fluorescerande protein (GFP) (konstitutiv GFP-uttryck)2 eller PSB1C3-GFP-CSGA (konstitutiv GFP-uttryck, Rhamnose-inducerbara csga uttryck) över natten vid 37 ° c med skakning vid 250 rpm i 50 mL LB-medium innehåll ande 34 μg/mL kloramfenikol och 0,5% rhamnos.
- Centrifugera cell kulturen i 5 min vid 3 220 x g för att pelleten bakterierna. Ta bort supernatanten.
- Återsuspendera bakterie pelleten i 10 mL LB-medium och tillsätt 10 mL natriumalginat (3% vikt/volym).
4.3D-utskrift process
- Installera och öppna program varan för 3D-utskrifter (material tabell) på en dator. Anslut 3D-skrivaren till datorn. Flytta Skriv huvudet till dess start position genom att klicka på hem knappen för X-, Y-och Z-axlarna.
- För varje utskrift placerar du ett för berett tryck substrat på en viss plats på utskrifts sängen.
- Kalibrera höjden på Skriv huvudet i Z-axeln.
- Höj Skriv huvudet till en höjd av 22 mm under manuell kontroll, så att det inte kommer att kollidera med kanten av petriskål när du flyttar till önskad position. Placera Skriv huvudets överkant på plattan och flytta den nedåt tills pipettspetsen kommer i kontakt med utskrifts ytan. Tilldela Z-axelns position som Z1 (utskrifts ytans höjd).
- Höj Skriv huvudet och flytta det utanför plåt området med manuell kontroll i X-, Y-och Z-axlarna. Om arbets avståndet mellan Skriv huvudet och plattytan definieras som Z2 anger du Z1 + Z2 i utskrifts programmet som Z-värde vid utskrift.
- Program mera ut formen genom en egenutvecklad punkt-för-punkt-koordinerade metod enligt önskad bana.
- Om den önskade banan är en rak linje, ange bara start-och punkter. Inklusive ytterligare punkter på böjda linjer kommer att resultera i jämnare kurvor. Flytta Skriv huvudet manuellt till varje punkt sekventiellt och registrera koordinaterna för dessa punkter i ordning. Ange alla dessa koordinater samt Skriv huvudets rörliga hastighet för varje tryckt segment i G-kodredigeraren.
- Både före och efter utskrift lyfter du Skriv huvudet till ett avstånd som är högre än plattans kant (20 mm) och förflyttar dig direkt från plattområdet. Spara detta program som en G-kodfil och ladda direkt för användning i efterföljande utskrifter, medan ommätning av Z-axelns höjd för varje nytt tryck substrat.
Obs: se tabell 1 för ett exempel på G-kod för utskrift av en fyrkant. - Ladda den förprogrammerade G-kodfilen. Öppna G-kod redigeraren i program varan och program i kommandona för att skriva ut önskad form. På varje kommando rad kan positionen för skriv huvudet ändras i X-, Y-och/eller Z-axeln. Mata in Z-värdet under alla utskrifts steg som Z1 + Z2 (höjd på utskrifts ytan + arbets avstånd).
Obs: den rörliga hastigheten är också justerbar; 9 000 mm/min är ett lämpligt värde för typiska utskrifts hastigheter. - Fyll på det flytande bio-bläcket i sprutan (-arna) och montera dem i sprutpumpen (-arna) i 3D-bioprintern.
- Skriv ut bio bläcket på utskrifts underlaget genom att klicka på knappen Skriv ut .
- Under utskriften kontrollerar du skrivar huvudets rörelse helt och hållet med program varan. Starta sprutpumpen manuellt innan Skriv huvudet kommer i kontakt med tryck ytan.
Obs: samordningen av sprutpumpen och skrivaren är empiriskt bestämd beroende på extrudering hastighet, den hastighet med vilken Skriv huvudet flyttas till den första utskrifts punkten, och den ursprungliga positionen av Skriv huvudet. Om den första Skriv huvudets position är 20 mm, med en hastighet på 9 000 mm/min och en extrudering hastighet på 0,1 mL/h, starta sprutpumpen omedelbart efter att utskriften har påbörjats. Om extrudering hastigheten ändras från 0,1 mL/h till 0,3 mL/h, vänta sedan 2 − 3 s för att starta sprutpumpen när utskriften är igång. - Stoppa sprutpumpen så snart Skriv huvudet anländer till den sista punkten av utskriften. Stoppa sprutpumpen innan Skriv huvudet lyfter upp i slutet av tryck processen, annars överskott bio-bläck kommer att släppa på tryck substrat och minska utskrifts upplösningen.
- För byggandet av 3D-strukturer, kontrol lera alla rörelser av Skriv huvudet i G-kod redaktör. Skriv in utskrifts höjden för det första skiktet. Öka Z-värdet i G-koden med 0,2 millimeter för det andra skiktet för att öka utskrifts höjden. Därefter, öka Z-värdet med 0,1 millimeter när du flyttar till ett högre lager. Flytta inte plattan under utskrifts processen.
- För att mäta bredden och höjden på den tryckta Hydrogelen, Använd en stållinjal placerad under eller vid sidan av provet.
5. odling och testning av biofilm produktionens effektivitet genom E. coli
- Inkubera de tryckta proverna vid rums temperatur i 3 − 6 dagar för att möjliggöra produktion av bio film komponenter (curli fibrer). Bild plattorna med en kamera eller fluorescerande skanner.
- För att lösa upp alginatmatrisen, tillsätt 20 mL 0,5 natriumcitratlösning (pH = 7 justerad med NaOH) till tryck substrat och inkubera i 2 timmar med 30 rpm skakning vid rums temperatur. Kassera vätskan och bilden plattorna igen för att jämföra med bilderna av plattorna innan citrat behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det första steget för framgångs rika 3D-utskrifter av bio filmer är att omvandla en kommersiell 3D-skrivare till en bioprinter. Denna omvandling uppnås genom att ta bort extrudern och värmare av skrivaren, avsedd för utskrift med en polymer bläck, och ersätta dessa med komponenter som lämpar sig för utskrift av bio-bläck som innehåller levande bakterier (figur 1a). Extrudern ersätts med en pipettspets (eller tips, om flera bio-bläck kommer att användas i tryck processen) knutna till ett slang system anslutet till en sprutpump (figur 1b). Den lyckade omvandlingen av tryckeriet till en bioprinter kan bedömas baserat på förmågan att överföra önskade bio-Ink (s) från sprutpumpen genom slang systemet och pipettspetsen (s) på en tryck yta utan att läcka eller värma bio-Ink. Om slangen utbuktningar på grund av flödet av bio-bläck under utskrift, kan det ersättas med slang med tjockare väggar. Det bör noteras att denna tryck teknik bör kunna arbeta med alla typer av kommersiella 3D-skrivare för vilka slangar kan fästas på Skriv huvudet.
Den 3D bioprinter kan skapa bakterier-Encapsulating vävnadsinväxt i en mängd olika tvådimensionella (2D) och 3D-former (figur 2). Kalcium joner i tryck substrat inducerar stelning (kelering av kalcium joner med alginat karboxylgrupper) av bio-bläck vid utskrift, omvandla flytande bio-bläck i en solid hydrogel. Upplösningen av biopsin kommer att bero på extrudering hastighet, storleken på pipettspetsen, hastigheten på Skriv huvudet, volymen och koncentrationen av CaCl2 lösning tillsätts agarlösningen, planhet av tryck ytan, och viskositeten hos bio-bläcket som används. Koncentrationen av CaCl2 lösning har ett stort inflytande på hydrogel skärpa. Fyra olika koncentrationer av CaCl2 (0,1 m, 0,2 m, 1 m och 5 m) provtogs, och endast 5 m CaCl2 lösning resulterade i hydrogel som inte blev suddig efter tryckning. Därför valdes 5 M som optimal koncentration av CaCl2 lösning.
I en tidigare version av detta protokoll applicerades CaCl2 -lösningen på ytan av agarplattan i stället för att blandas in i agarlösningen innan agarplattan hälldes. När du använder den här versionen har volymen av CaCl2 -lösningen ett kritiskt inflytande över utskrifts kvalitet och upplösning. Vid användning av en petriskål med en 150 x 15 mm, med en volym kalciumkloridlösning av mer än 100 μL (eller 30 μL för en 90-mm petriskål), resulterar det i för mycket vätska kvar på tryck ytan. Denna vätska kan spridas ojämnt när plattan flyttas, vilket kan ändra arbets avståndet och orsaka blockering av pipettspetsen. För mycket volym CaCl2 kan också orsaka tryckta vävnadsinväxt att flyta och glida över lösningen, ändra form och position av den tryckta hydrogel. Om volymen av kalcium klo RID lösning är för liten, vissa regioner av plattan får inte ta emot CaCl2 lösning och kommer att ha dålig hydrogel stelning. I detta förbättrade protokoll resulterade en tillsats av CaCl2 -lösningen direkt i agarlösningen innan agarplattan hälls i betydligt mindre fuktighet på tryck substratets yta jämfört med den ytapplicerade metoden, vilket resulterade i dramatiskt förbättrad utskrifts upplösning.
Extrudering hastighet och skriv huvudets rörelse är beroende av varandra och kan stämmas på ett samordnat sätt att ändra utskrifts upplösningen. Till exempel, om skrivaren drivs med extrudering hastighet mellan 0,1 ml/h och 0,5 ml/h med en konstant Skriv huvudets rörelse hastighet på 300 mm/min, diametern på den tryckta hydrogel ökar med ökningen av extrudering hastighet2,20. Vid extrudering hastigheter över 0,5 mL/h, ytterkanterna av de tryckta linjerna av hydrogel förändring från raka, parallella linjer till vågiga linjer, och linje bredden ökar också. Skriv huvudets hastighet påverkar också utskrifts upplösningen. Med en konstant extrudering hastighet på 0,3 mL/h, öka hastigheten på Skriv huvudet från 300 mm/min till 500 mm/min resulterar i bredden av den tryckta hydrogel blir smalare, minskar från 1,8 mm till 0,9 mm. Om Skriv huvudets rörelse hastighet är över 500 mm/min, kommer gel linjen lätt att bli diskontinuerlig. För en 200 μL pipettspets och bio bläcket som används i den aktuella studien anses flera kombinationer av utskrifts upplösningen vara optimala (tabell 2). Vid pumpnings hastighet 0,3 mL/h, skriv huvudets rörelse hastighet 500 mm/min, och arbets avstånd 0,2 mm, är tryckt hydrogel producerad med en bredd av ca 0,9 mm.
En avgörande prestation av den bakteriella 3D-utskriftsmetoden är dess förmåga att skapa konstruerade bio filmer. För att skapa en konstruerad och rumsligt kontrollerad bio film, bör bakterierna inte bara överleva 3D-utskriftsprocessen, men bör också producera biofilm komponenter samtidigt kvar i det tryckta mönstret. De konstruerade e. coli -bakterier som används i detta protokoll, e. coli δcsga -bakterier som bär PLASMID pSB1C3-GFP-csga, möjliggör kontrollerbara uttryck av curli-proteiner. Användningen av en csga-knockoutstam säkerställer att csga-protein endast uttrycks när det induceras från en Plasmid med rhamnos. Bakterierna exporterar de inducerade CsgA-proteinsubenheterna, som sedan själv monterar21 på csgb-proteiner på bakteriens yttre membran22 för att forma curli-fibrer. Dessa amyloid-liknande fibrer är de viktigaste proteinhaltiga komponenterna i biofilm extracellulär matris: ett anslutet nätverk av proteiner och polymerer där bakterierna är inbäddade. Den tryckta alginatmatrisen av 3D-Printing bio-Ink ger fysisk support och struktur till bakterierna under curliproduktionen. Användningen av konstitutiv GFP-uttryck möjliggör visualisering och kvantifiering av tryckta celler via fluorescensavbildning.
För att bedöma om bildandet av biofilm var framgångs rik Upplös tes alginatmatrisen med natriumcitratlösning, och formen på det tryckta bio bläcket bedömdes efter citratbehandlingen (figur 3). När det gäller bio-Ink utan inducerbara curli produktion Plasmid, den tryckta mönstret var helt upplöst efter natriumcitrat behandling, vilket innebär att inget biofilm curli nätverk hade bildats (figur 3a, B). När det gäller bakterier som innehåller den inducerbara curli-produktionplasmid Upplös tes gelen inte efter natriumcitratbehandling (figur 3c, D). Detta resultat tyder på att de tryckta bakterierna kunde bilda ett curli nätverk tillräckligt omfattande för att stabilisera det tryckta mönstret av bakterier2.
För att konstruera flerskiktade strukturer skrevs ytterligare lager ut (figur 4) genom att justera utskrifts höjden och skriv ut banan i G-kodredigeraren. Genom att öka antalet tryckta lager i ett prov fick bredden och höjden på de tryckta strukturerna öka stegvis (figur 5)2,20, men även 5-lagers tryckta strukturer kunde skapas med en upplösning millimeter till sub-millimeter. När E. coli konstruerad för att inducibly producera curli proteiner trycktes i flera lager strukturer, inte natriumcitrat behandling inte lösa upp proverna, medan flera skikt strukturer som innehåller icke-curli-producerande E. coli var löses i natriumcitratlösning (figur 6). Detta experiment visar att konstruerade bio filmer kan skapas i flera lager, tredimensionella tryckta strukturer, samt i enskikts tryckta strukturer.
Figur 1: bilder som visar omvandlingen av en kommersiell 3D-skrivare till en 3D-bioprinter. (A) komponenterna i 3D-bioprintern efter omvandling från en kommersiell 3D-skrivare. B) den bio-Ink extrudern som bildas av ett slang system som fästs på en pipettspets. Ytterligare utskrifts tips kan läggas till i det andra Skriv huvudets hål eller genom att lägga till ytterligare hål i Skriv huvudet, för att skriva ut flera typer av bio-Ink. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på 3D-biopsköljade mönster som innehåller E. coli pSB1C3-GFP-csga. Dessa bilder togs två dagar efter utskriften. Denna utskrifts upplösning erhölls med pumphastighet 0,3 mL/h, skriv huvudets rörelse hastighet 300 mm/min, och arbets avstånd 0,2 mm. G-koderna för att skriva ut dessa former kan hittas i tilläggsfilerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: en metod för att kontrol lera om biofilm komponenter har producerats av E. coli -bakterier i ett tryckt mönster. När tryckt E. coli innehöll en Plasmid som inte kodar för curli induktion, det tryckta mönstret var helt upplöst av natriumcitrat behandling (a och B). När E. coli innehåller en Plasmid-kodning inducerbara curli proteiner användes, var den tryckta biofilm resistent mot natriumcitrat behandling (C och D). Programmerings processen och förklaringar av G-koden för utskrift av detta kvadratiska mönster finns i tabell 1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: toppvy (a) och sidovy (B) för tryckta strukturer i flera lager innehåll ande E. coli pSB1C3-GFP-csga. Detta prov trycktes med pumpnings hastighet 0,3 mL/h, skriv huvudets rörelse hastighet 200 mm/min, och arbets avstånd 0,2 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: linjens bredd och höjd på tryckta vävnadsinväxt som innehåller olika antal tryckta lager. Mätningarna utfördes på prov som trycktes med pumpnings hastighet 0,3 mL/h, skriv huvudets rörelse hastighet 500 mm/min, och arbets avstånd 0,2 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: en metod för att kontrol lera om biofilm komponenter har producerats av E. coli -bakterier i flerlagertryckta strukturer. Engineered E. coli trycktes i 1-, 3-, eller 5-lagers vävnadsinväxt och inkuberades i 6 dagar. När den tryckta E. coli innehöll en Plasmid som inte kodar för curli-induktion Upplös tes det tryckta mönstret fullständigt genom natriumcitratbehandling (a och B). När den tryckta E. coli innehöll en Plasmid-kodning inducerbara curli proteiner, den tryckta biofilm var resistenta mot natriumcitrat behandling (C och D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| G-kod kommandon | Uppgifter |
| G1 Z20 F9000 | Lyft Z-axeln till en höjd av 20 mm med en 9 000 mm/min rörelse hastighet. |
| G1 X95 Y65 F9000 | Flytta till start punkten för den första raden med en rörelse hastighet på 9 000 mm/min. |
| G1 Z6 F9000 | Flytta nedåt i Z-riktningen till en korrekt (här Z = 6 mm) utskrifts avstånd. |
| G1 X95 Y105 F300 | punkt för den första raden och start punkten för den andra raden. |
| G1 X135 Y105 | punkt på den andra raden och start punkten för den tredje raden. |
| G1 X135 Y65 | punkt för den tredje raden och start punkten för den fjärde raden. |
| G1 X95 Y65 | punkt för den fjärde raden och start punkten för den första raden; en kvadrat bildas. |
| G1 Z20 F9000 | Lyft Z-axeln till en höjd av 20 mm vid 9 000 mm/min. |
| G1 X55 Y40 F9000 | Flytta till en koordinat (55, 40) utanför petriskål sortimentet. |
Tabell 1: programmerings process och förklaringar av G-kod för att skriva ut en fyrkant.
| Extrudering hastighet (mL/h) | Skriv huvudets rörelse hastighet (mm/min) | Gel bredd (mm) |
| 0,1 | 100 | 1,6 ± 0,1 |
| 0,1 | 200 | 1,1 ± 0,1 |
| 0,1 | 300 | 1,0 ± 0,1 |
| 0,3 | 300 | 1,8 ± 0,1 |
| 0,3 | 400 | 1,2 ± 0,1 |
| 0,3 | 500 | 0,9 ± 0,1 |
| 0,5 | 200 | 2,2 ± 0,2 |
| 0,5 | 1 200 | 1,2 ± 0,2 |
| 0,7 | 200 | 2,8 ± 0,1 |
| 0,7 | 1 200 | 1,3 ± 0,1 |
Tabell 2: optimala utskrifts parametrar för vävnadsinväxt med hög upplösning. Fem punkter mättes för varje tillstånd. Medelvärdet och standard avvikelsen visas i tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som presenteras här för 3D-utskrifter av konstruerade bio filmer har två kritiska steg. Först är förberedelserna av agartryckytan, som är den mest kritiska faktorn för att producera en specifik utskrifts upplösning. Det är viktigt att se till att tryck ytan är platt och att pipettspetsen på Skriv huvudet är placerad på rätt höjd från ytan. Om ytan inte är platt kommer arbets sträckan att ändras under utskrifts processen. Om arbets avståndet är mindre än 0,1 mm kan CaCl2 -lösningen komma in i pipettspetsen och orsaka hydrogelbildning, vilket leder till att pipettspetsen blir igensatt. Om arbets sträckan är mer än 0,3 mm kan gelen inte tryckas kontinuerligt. Det optimala arbets avståndet i denna studie är 0,2 mm. bra metoder för att förbereda plana agar tryck ytor är att använda större diameter petriskål (150-mm-diameter petriskålare snarare än en 90-mm-diameter platta), placera plattorna på ett plant bord, häll agar lösning med snabb och jämn hastighet, och Undvik att flytta agarplattan under dess stelning.
Det andra kritiska steget är valet av önskade utskrifts parametrar inklusive pumpning hastighet, viskositet bio-bläck används och skriv huvudets hastighet, som avgör den resulterande upplösningen. För att välja dessa parametrar på ett effektivt sätt, kan användaren prova flera extrema värden för skriv huvudets hastighet med en konstant extrudering hastighet, notera bredden på den tryckta hydrogel för varje uppsättning villkor. Upprepa sedan experimentet med 4 andra extrudering priser. Ta sedan de fem kombinationerna som gav bäst utskrifts upplösning för programmet och variera både utskrifts parametrarna (pumpning och skriv huvudets hastigheter) i mindre och mindre steg tills önskad upplösning erhålls.
De tryckta linjens tjocklek påverkar de tryckta bakteriernas förmåga att bilda stabila bio filmer. Under optimala tryck förhållanden (pumpnings hastighet 0,3 mL/h, skriv huvudets hastighet 300 mm/min, och arbets avstånd 0,2 mm), kommer tryckta linjer av bio-Ink producera stabila bio filmer efter 3-6 dagar inkubation vid rums temperatur. Om linjerna blir tjockare, till exempel genom att öka pump hastigheten, kan de mellersta regionerna i varje linje inte induceras tillräckligt för att producera citrat-stabila bio filmer.
Vid utskrift av en multi-layer bio-Ink hydrogel, är varje tryckt lager stelnat vid kontakt med kalcium joner som sprids till det tidigare tryckta lagret. Eftersom ca2 + koncentrationen i tryck underlaget är hög, kan ca2 + joner snabbt sprida sig genom de lägre lagren. Därför kan de övre lagren skrivas ut direkt efter att de föregående lagren har skrivits ut, helt enkelt genom att justera utskrifts höjden i G-kodredigeraren. Dessutom bör utskrifts avståndet för det övre skiktet begränsas till endast 0,1 − 0,2 mm högre än utskrifts avståndet för det föregående skiktet. Om det tillagda utskrifts avståndet är mindre än 0,1 mm, kommer spetsen att dra över det första skiktet och minska upplösningen på den tryckta Hydrogelen. Om det tillagda utskrifts avståndet är större än 0,2 mm, kommer bio-bläcket att bilda vätske droppar under extrudering, vilket gör att den tryckta Hydrogelen blir diskontinuerlig.
Den nuvarande biopsköljningsmetoden möjliggör produktion av reproducerbara, rumsligt styrda bio filmer, lämpliga för användning i studiet av biofilm mekaniska egenskaper eller biologisk resistens hos biofilm bakterier till olika faktorer, inklusive antibiotika, tensider etc. Den här funktionen säkerställer en direkt användbarhet av den föreslagna metoden. Utvecklingen av högre precision gör-det-själv (DIY) bioprinters kommer sannolikt att vara möjligt genom att bibehålla utskriften arbets avstånd men sänka pumpnings hastigheten och den rörliga hastigheten på Skriv huvudet, eller genom att provtagning olika extruder geometrier och biologiska bläck kemiska sammansättningar. Med framtida förbättringar av utskrifts upplösningen kan ytterligare program aktive ras, till exempel vävnads teknik eller läkemedels leverans. Den 3D bioprinting metod som beskrivs här bör också kunna utvidgas till att skriva ut ytterligare typer av bakterier som är biokompatibla med vår alginat-baserade bio-bläck. Det nuvarande protokollet ger tillräcklig sterilitet genom att upprepade gånger koka bio-bläck under beredning, med hjälp av sterila sprutor och tryck tips, och använda antibiotika i både bio-bläck och tryck plattan. Framtida experiment med vildtyps-bakterier kan kräva ytterligare steriliserings åtgärder såsom att byta ut eller desinficera slang systemet mellan utskrifter.
Till författarnas bästa kunskap är den presenterade metoden (ursprungligen utvecklad i Lehner et al.20) det första publicerade exemplet på en additiv tillverknings stil för 3D-utskrifter av bakterier. I den första delen av detta protokoll beskrivs denna allmänna metod i detalj för 3D-utskrifter av bakterier, som tillämpas på produktion av konstruerade bio filmer2. Flera framtida tillämpningar av 3D-tryckta bio filmer är möjliga med denna metod. I naturen har flera bakteriella system utvecklats som skapar olika typer av bio filmer, som i denna artikel ett enda system utforskades. Flera andra system kan enkelt undersökas genom att skapa 3D-tryckta bio filmer med andra bakterie system, såsom Bacillus subtilis eller Acetobacter xylinum. Alternativa metoder23,24 har också utvecklats för rumslig mönning av bakterier med hög upplösning med hjälp av optiska signaler. Dessa metoder kräver dyrare, komplicerad utrustning för att uppnå dem i jämförelse med denna skrivare, och är endast lämpliga för mönning av genetiskt modifierade bakterier.
Förmågan att rumsligt mönster 3D-tryckta bio filmer med denna metod kan möjliggöra skapandet av konstruerade bio filmer som återger den rumsliga heterogenitet av naturliga bio filmer25. På grund av den mycket detaljerade arrangemang av protein och polymerfibrer inom en biofilm, bakterier i en biofilm tillstånd uppnå en mycket högre motstånds kraft mot kemiska och fysikaliska stimuli, såsom en ökad resistens mot antibiotika jämfört med samma bakterier i ett planktoniskt tillstånd. Dessutom, bakterier inom en biofilm visar en ökad motstånds kraft mot vätske flödet, vilket gör underhåll och sterilitet av implanterbara medicintekniska produkter mycket svårare26. Tryckta bio filmer som försöker återge de specifika rumsliga distributionerna av bio film komponenter är kraftfulla verktyg för att studera de mekanismer genom vilka bakterier inom en biofilm uppnår resistens fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett AOARD-bidrag (nr. FA2386-18-1-4059), den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO/OCW) som en del av Frontiers of Nanoscience program, och avancerade material NWO-NSFC program (nr 729.001.016). Författarna erkänner laboratorie hjälp av Ramon van der Valk och Roland Kieffer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
