Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel
Summary
Hier bieden wij een methode voor het analyseren van het gedrag van de groeiende axonen in 3D-matrices, het nabootsen van hun natuurlijke ontwikkeling.
Abstract
Dit protocol maakt gebruik van natuurlijke type I collageen te genereren drie-dimensionale (3-D) hydrogel voor het toezicht op en het analyseren van de axonale groei. Het protocol is gecentreerd op kweken kleine stukjes van de embryonale of vroege postnatale knaagdieren hersenen in een 3-D hydrogel gevormd door de rat staart pees-afgeleide type I collageen met specifieke porositeit. Weefsel stukken worden gekweekt in de hydrogel en geconfronteerd met specifieke hersen fragmenten of genetisch gemodificeerde cel aggregaten te produceren en afscheiden moleculen geschikt voor het creëren van een gradiënt in de poreuze matrix. De stappen van dit protocol zijn eenvoudig en reproduceerbaar, maar omvatten kritische stappen om zorgvuldig te worden overwogen tijdens de ontwikkeling ervan. Bovendien kan het gedrag van de groeiende axonen direct worden gecontroleerd en geanalyseerd met behulp van een phase-contrast Microscoop of mono/multi foton fluorescentiemicroscoop na fixatie door immunocytochemische methoden.
Introduction
Neuronale axonen, eindigend in axonale groei kegels, migreren lange afstanden door de extracellulaire matrix (ECM) van het embryo over specifieke wegen om hun juiste doelen te bereiken. De groei kegel is het distale gedeelte van Axon en het is gespecialiseerd om het fysieke en moleculaire milieu van cel te voelen1,2. Vanuit moleculair oogpunt, worden de groei kegels geleid door minstens vier verschillende moleculaire mechanismen: de aantrekkelijkheid van het contact, chemoattraction, de weerzin van het contact, en chemorepulsion veroorzaakt door verschillende axonale begeleidings cues3,4 , 5 , 6. contact-gemedieerde processen kunnen gedeeltelijk worden bewaakt in twee-dimensionale (2D) culturen op micro-patroon substraten (bijv. met strepen7,8 of spots9 met de moleculen). Nochtans, kunnen axons aan hun doel in een niet-Diffusive manier navigeren door verscheidene aantrekkelijke en weerzinwekkende molecules van guidepost cellen in het milieu4,5,10te ontdekken. Hier beschrijven we een eenvoudige methode van 3-D cultuur om te controleren of een afgescheiden molecuul induceert chemorepulsive of chemoattractive effecten op de ontwikkeling van axonen.
De vroegste studies gericht op het bepalen van de effecten van Axon begeleiding cues gebruikt explant culturen in drie-dimensionale (3-D) matrices te genereren gradiënten simuleren in vivo voorwaarden11,12. Deze aanpak, samen met in vivo experimenten, toegestaan voor de identificatie van vier grote families van oriëntatie cues: netrinse, spleten, semaphorins, en Ephrins4,5,6. Deze moleculaire cues en andere factoren13 zijn geïntegreerd door de groeiende axonen, triggering de dynamiek van adhesie complexen en transducing mechanische krachten via de cytoskelet14,15,16. Voor het genereren van moleculaire gradiënten in 3-D culturen voor axonale navigatie, baanbrekende onderzoekers gebruikt plasma stolsel substraten17, die ook werd gebruikt voor organotypic slice preparaten18. Nochtans, in 1958, werd een nieuw protocol om 3-D collageen hydrogels te produceren gerapporteerd voor het bestuderen met Maximow ´ s apparaten19, een cultuur platform, dat in verscheidene studies geschikt voor microscopische observaties20wordt gebruikt. Een andere pionier studie rapporteerde collageen gel als hulpmiddel om menselijke fibroblasten in te bedden voor het bestuderen van de differentiatie van fibroblasten in myofibroblasten in wond helende processen21. Parallel, Lumsden en Davies paste collageen van de boviene dermis toe om het vermeende effect van de factor van de zenuwgroei (NGF) op het begeleiden van sensorische zenuwvezels te analyseren22. Met de ontwikkeling van nieuwe cultuur platforms (b.v., multi-well platen) door verschillende bedrijven en laboratoria, werden de collageen culturen aangepast aan deze nieuwe apparaten6,23,24,25 ,26. Parallel, werd een uittreksel van ECM materiaal dat uit de Engelbreth-Holm-zwerm tumor cel lijn wordt afgeleid gemaakt commercieel beschikbaar om deze studies uit te breiden27.
Onlangs, zijn verscheidene protocollen ontwikkeld om moleculaire gradiënten met vermeende rollen in axon begeleiding te produceren gebruikend 3-D hydrogels (b.v., collageen, fibrine, enz.) 28. als alternatief kan de kandidaat-molecuul worden gemobiliseerd op verschillende concentratie in een poreuze matrix (BIJV. NGF29) of gegenereerd door kweken in een klein gebied van de 3-D hydrogel cel aggregaten afscheiden van het molecuul om een radiale genereren gradiënt4,23,24,25,26. De laatste mogelijkheid zal worden toegelicht in dit protocol.
De hier gepresenteerde procedure is een eenvoudige, snelle en zeer reproduceerbare methode gebaseerd op de analyse van de axonale groei in 3-D hydrogel culturen van de embryonale muis hersenen. In vergelijking met andere methoden, is het protocol zeer geschikt voor niet-opgeleide onderzoekers en kan volledig worden ontwikkeld na een korte opleiding (1-2 weken). In dit protocol, isoleren we eerst collageen van volwassen rat staarten om verder te genereren 3-D matrices waarin genetisch gemodificeerde cel aggregaten worden gekweekt in de voorkant van de embryonale neuronale weefsel. Deze cel aggregaten vorm radiale chemische gradiënten van een kandidaat-molecuul dat een reactie voor de groeiende axonen ontlokt. Ten slotte kan de evaluatie van de effecten van het molecuul op de groeiende axonen gemakkelijk worden uitgevoerd met behulp van een fasecontrast microscopie of, alternatief, immunocytochemische methoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De groei van het ontwikkelen van axonen is hoofdzakelijk invasief en omvat ECM degradatie en het remodelleren. Met behulp van de hier gepresenteerde procedure, kunnen onderzoekers verkrijgen van een homogene 3-D matrix gevormd door de natuurlijke type I collageen waarin axonen (of cellen) kan reageren op een chemische gradiënt afgescheiden door genetisch gemodificeerde cellen zoals ze doen in vivo. Verschillende axonale reacties op gradiënten van aantrekkelijke of remmende cues (eiwitten, lipiden, enz.) kan gemakkelijk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Tom Padt voor de redactionele advies en M. Segura-Feliu voor de technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door het CERCA-programma en door de Commissie voor universiteiten en onderzoek van het departement innovatie, universiteiten en ondernemingen van de Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Dit werk werd gefinancierd door het Spaanse ministerie van onderzoek, innovatie en Universiteit (MEICO) door middel van BFU2015-67777-R en en RTI2018-099773-B-100, de Spaanse-netwerk (PRIONET Spanje AGL2017-90665-REDT), en het Instituut Carlos III, CIBERNED ( WRIKKEN-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
References
- Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l’homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the ‘Bornstein legacy’: from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
