Summary

Génération d'hydrogels à base de collagène 3D pour analyser la croissance et le comportement axonal pendant le développement du système nerveux

Published: June 25, 2019
doi:

Summary

Ici, nous fournissons une méthode pour analyser le comportement des axones en croissance dans les matrices 3D, imitant leur développement naturel.

Abstract

Ce protocole utilise du collagène naturel de type I pour générer de l’hydrogel tridimensionnel (3-D) pour la surveillance et l’analyse de la croissance axonale. Le protocole est centré sur la culture de petits morceaux de cerveaux embryonnaires ou postnatals de rongeurs à l’intérieur d’un hydrogel 3D formé par le collagène de type I dérivé du tendon de queue de rat avec la porosité spécifique. Les morceaux de tissu sont cultivés à l’intérieur de l’hydrogel et confrontés à des fragments de cerveau spécifiques ou des agrégats de cellules génétiquement modifiés pour produire et sécrére des molécules appropriées pour créer un gradient à l’intérieur de la matrice poreuse. Les étapes de ce protocole sont simples et reproductibles, mais comprennent des étapes critiques à examiner attentivement au cours de son développement. En outre, le comportement des axones croissants peut être surveillé et analysé directement à l’aide d’un microscope de contraste de phase ou d’un microscope à fluorescence mono/multiphoton après fixation par des méthodes immunocytochimiques.

Introduction

Les axones neuronaux, se terminant par des cônes de croissance axonale, migrent sur de longues distances à travers la matrice extracellulaire (ECM) de l’embryon sur des voies spécifiques pour atteindre leurs cibles appropriées. Le cône de croissance est la partie distale de l’axone et il est spécialisé pour détecter l’environnement physique et moléculaire de la cellule1,2. D’un point de vue moléculaire, les cônes de croissance sont guidés par au moins quatre mécanismes moléculaires différents : attraction de contact, chimioattraction, répulsion de contact, et chemorepulsion déclenchée par différents indices de guidage axonal3,4 , 5 Annonces , 6. Les processus négociés par contact peuvent être partiellement surveillés dans des cultures bidimensionnelles (2D) sur des substrats micro-modèles (p. ex., avec des rayures7,8 ou des taches9 contenant les molécules). Cependant, les axones peuvent naviguer vers leur cible d’une manière non-diffusive en sentant plusieurs molécules attrayantes et répulsives des cellules de guidage dans l’environnement4,5,10. Ici, nous décrivons une méthode facile de culture 3-D pour vérifier si une molécule sécrétée induit des effets chémorepulsifs ou chimioattractive sur le développement des axones.

Les premières études visaient à déterminer les effets des indices de guidage d’axone utilisés explant cultures dans des matrices tridimensionnelles (3-D) pour générer des gradients simulant des conditions in vivo11,12. Cette approche, ainsi que des expériences in vivo, a permis d’identifier quatre grandes familles de repères d’orientation: Netrins, Slits, Semaphorins, et Ephrins4,5,6. Ces indices moléculaires et d’autres facteurs13 sont intégrés par les axones en croissance, déclenchant la dynamique des complexes d’adhérence et transduisant les forces mécaniques via le cytosquelette14,15,16. Pour générer des gradients moléculaires dans les cultures 3D pour la navigation axonale, les chercheurs pionniers ont utilisé des substrats de caillots plasmatiques17, qui a également été utilisé pour les préparations de tranches organotypiques18. Cependant, en 1958, un nouveau protocole pour générer des hydrogels de collagène 3D a été rapporté pour l’étude avec les dispositifs de Maximow19, une plate-forme de culture, utilisée dans plusieurs études appropriées pour les observations microscopiques20. Une autre étude pionnière a rapporté le gel de collagène comme outil pour intégrer des fibroblastes humains pour étudier la différenciation des fibroblastes dans les myofibroblastes dans les processus de guérison des plaies21. En parallèle, Lumsden et Davies ont appliqué du collagène du derme bovin pour analyser l’effet putatif du facteur de croissance nerveuse (NGF) sur le guidage des fibres nerveuses sensorielles22. Avec le développement de nouvelles plateformes culturelles (p. ex., plaques multi-puits) par différentes entreprises et laboratoires, les cultures de collagène ont été adaptées à ces nouveaux dispositifs6,23,24,25 ,26. En parallèle, un extrait de matériel d’ECM dérivé de la lignée cellulaire de tumeur d’Engelbreth-Holm-Swarm a été rendu disponible commercialement pour étendre ces études27.

Récemment, plusieurs protocoles ont été développés pour générer des gradients moléculaires avec des rôles putatifs dans le guidage des axones à l’aide d’hydrogels 3D (p. ex. collagène, fibrine, etc.) 28. Alternativement, la molécule candidate peut être immobilisée à une concentration différente dans une matrice poreuse (p. ex., NGF29) ou générée par la culture dans une petite région des agrégats de cellules hydrogel 3D sécrétant la molécule pour générer un rayonnement gradient4,23,24,25,26. La dernière possibilité sera expliquée dans ce protocole.

La procédure présentée ici est une méthode facile, rapide et hautement reproductible basée sur l’analyse de la croissance axonale dans les cultures d’hydrogel 3D du cerveau embryonnaire de souris. En comparaison avec d’autres méthodes, le protocole est bien adapté aux chercheurs non formés et peut être entièrement développé après une courte formation (1-2 semaines). Dans ce protocole, nous isolons d’abord le collagène des queues de rat adultes pour produire davantage de matrices 3D dans lesquelles les agrégats de cellules génétiquement modifiés sont cultivés devant le tissu neuronal embryonnaire. Ces agrégats cellulaires forment des gradients chimiques radiaux d’une molécule candidate qui provoque une réponse pour les axones en croissance. Enfin, l’évaluation des effets de la molécule sur les axones en croissance peut facilement être effectuée à l’aide d’une microscopie de contraste de phase ou, alternativement, de méthodes immunocytochimiques.

Protocol

Toutes les expériences animales ont été réalisées dans le cadre des lignes directrices et protocoles du Comité éthique pour l’expérimentation animale (CEEA) de l’Université de Barcelone, et le protocole pour l’utilisation des rongeurs dans cette étude a été examiné et approuvé par le CEEA de la l’Université de Barcelone (approbation de la CEEA #276/16 et 141/15). 1. Purification du collagène de queue de rat Recueillir les queues de rat Sprague-Dawley adultes (8-9 sema…

Representative Results

Ici, nous présentons une méthodologie largement accessible pour étudier la croissance axonale dans les cultures 3-D de collagène d’hydrogel du système nerveux embryonnaire de souris. À cette fin, nous avons isolé le collagène des queues de rat adultes pour produire des matrices 3D dans lesquelles nous avons cultivé des agrégats de cellules génétiquement modifiés exprimant Netrin-1 ou Sema3E confrontés au tissu neuronal embryonnaire (par exemple, région CA de l’hippocampe). Ces agrégats cellulaires ont for…

Discussion

La croissance des axones en développement est principalement invasive et comprend la dégradation et le remodelage de l’ECM. En utilisant la procédure présentée ici, les chercheurs peuvent obtenir une matrice 3D homogène formée par le collagène naturel de type I dans lequel les axones (ou cellules) peuvent répondre à un gradient chimique sécrété par des cellules génétiquement modifiées comme ils le font in vivo. Différentes réponses axonales aux gradients de repères attrayants ou inhibiteurs (protéines…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Tom Yohannan pour les conseils éditoriaux et M. Segura-Feliu pour l’assistance technique. Ces travaux ont été financés par le programme CERCA et par la Commission des universités et de la recherche du Département de l’innovation, des universités et de l’entreprise de la Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Ces travaux ont été financés par le Ministère espagnol de la recherche, de l’innovation et de l’université (MEICO) par l’intermédiaire de BFU2015-67777-R et RTI2018-099773-B-100, le Réseau Prion espagnol (Prionet Espagne AGL2017-90665-REDT), et l’Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

Materials

Material
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) Sigma D5905
Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)  Criffa-Credo, Lyon, France
Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) Vector Labs PK-4000
B27 serum-free supplement 50x  Invitrogen 17504-044
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit Pierce 23225
cDNA plasmid vectors
COS1 cell lines ATTC CRL-1570
D-(+)-Glucose Sigma 16325
D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium Sigma G8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium Invitrogen 41966-029
Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures Invitrogen 14200
Ethanol  merck 108543
Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) Sigma E5134
Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) Electron Microscopy Sciences (EMS) 17984-25
Gelatin powder  Sigma G1890
Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) Panreac 211008
Hank’s balanced salt solution  Invitrogen 24020083
Heat-inactivated foetal bovine serum  Invitrogen 10108-165
Heat-inactivated horse serum  Invitrogen 26050-088
Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) Sigma 316989
L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium Invitrogen 25030-024
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668-019
Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)  Criffa-Credo, Lyon, France
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Invitrogen 11012-044
Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) Biolegend 801201
N-2 supplement 100x  Invitrogen 17502-048
Neurobasal medium  Invitrogen 21103049
Paraformaldehyde Merck 1,040,051,000
Penicillin/streptomycin solution 100x  Invitrogen 15140-22
Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry Invitrogen AM9624
Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse  Vector Labs BA-2000
Serum-free medium (Opti-MEM) Invitrogen 11058-021
Sodium azide  Panreac 162712
Sodium bicarbonate solution 7.5%  Invitrogen 25080-094
Sterile culture grade H2O  Sigma W3500
TritonTM X-100  Sigma X100
Trizma base  Sigma T1503
Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) Invitrogen 25300-054
Equipment
1 large and 1 small curved scissors for dissection  Fine tools Instruments or similar
1.5-ml conical centrifuge tubes  Eppendorf or similar
15-ml conical centrifuge tubes  Corning or similar
2 haemostats   Fine tools Instruments or similar
2 small straight dissecting scissors Fine tools Instruments or similar
200-ml centrifuge tubes for centrifugation Nalgene or similar
200-ml sterile glass conical flasks
2-litre glass beaker
4- and 6-well culture plates  Nunc 176740 and 140675
Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. Gilson, Brand, Eppendorf or similar 
Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips  Gilson, Eppendorf or similar
Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor  Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) Eppendorf, Beckman Coulter or similar
Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma D9402
Dialysis tubing closures  Sigma Z37101-7
Disposable glass pipettes
Dissecting microscope with dark field optics  Olympus SZ51 or similar 
High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor
Laminar flow hood
Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes  Nunc  150679 , 150288 and 150318, respectively
Magnetic stirrer and magnetic spin bars IKA or similar
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering
One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps  Fine tools Instruments or similar
Razor blades for the tissue chopper
Scalpels (number 15 and 11)
Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces Fine tools Instruments or similar

References

  1. Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l’homme et chez les vertébrés. , (1894).
  2. Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
  3. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
  4. Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
  5. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  6. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
  7. Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
  8. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  9. von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
  10. Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
  11. Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
  12. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  13. Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
  14. Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
  15. Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
  16. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  17. Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
  18. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  19. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  20. Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
  21. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  22. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
  23. Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
  24. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  25. Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
  26. Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
  27. Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
  28. Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
  29. Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
  30. Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
  31. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  32. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
  33. Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
  34. Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
  35. Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
  36. Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the ‘Bornstein legacy’: from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).

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Cite This Article
Gil, V., Del Río, J. A. Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development. J. Vis. Exp. (148), e59481, doi:10.3791/59481 (2019).

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