Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso
Summary
Aqui, fornecemos um método para analisar o comportamento dos axônios crescentes em matrizes 3D, imitando seu desenvolvimento natural.
Abstract
Este protocolo usa o tipo natural mim colagénio para gerar o hidrogel tridimensional (3-D) para monitorar e analisar o crescimento axonal. O protocolo está centrado na cultura de pequenos pedaços de cérebros de roedores embrionários ou precoces no interior de um hidrogel 3-D formado pelo colágeno do tipo I derivado do tendão da cauda de rato com porosidade específica. Peças de tecido são cultivadas dentro do hidrogel e confrontados com fragmentos cerebrais específicos ou agregados celulares geneticamente modificados para produzir e secretar moléculas adequadas para a criação de um gradiente dentro da matriz porosa. As etapas deste protocolo são simples e reprodutíveis mas incluem etapas críticas a ser consideradas com cuidado durante seu desenvolvimento. Além disso, o comportamento de axônios crescentes pode ser monitorado e analisado diretamente usando um microscópio de fase-contraste ou um microscópio de fluorescência mono/multifóton após a fixação por métodos Immunocytochemical.
Introduction
Axônios neuronais, terminando em cones de crescimento axonal, migram longas distâncias através da matriz extracelular (ECM) do embrião sobre caminhos específicos para atingir seus alvos adequados. O cone de crescimento é a porção distal do AXON e é especializado para sentir o ambiente físico e molecular da célula1,2. Do ponto de vista molecular, os cones de crescimento são guiados por pelo menos quatro mecanismos moleculares diferentes: atração de contato, quimioatração, repulsão de contato e chemorepulsion desencadeada por diferentes pistas de orientação axonal3,4 , 5. º , 6. os processos mediados por contato podem ser parcialmente monitorados em culturas bidimensionais (2D) em substratos micropadronizados (por exemplo, com listras7,8 ou manchas9 contendo as moléculas). No entanto, axônios podem navegar para o seu alvo de forma não-diffusiva, sentindo várias moléculas atraentes e repulsivas de células guidepost no ambiente4,5,10. Aqui, nós descrevemos um método fácil da cultura 3-D para verific se uma molécula secretado induz efeitos chemorepulsive ou chemoattractive em axônios tornando-se.
Os primeiros estudos objetivaram determinar os efeitos das pistas de orientação AXON utilizadas culturas explantes em matrizes tridimensionais (3-D) para gerar gradientes simulando in vivo as condições11,12. Essa abordagem, juntamente com experimentos in vivo, permitiu a identificação de quatro grandes famílias de pistas de orientação: netrins, fendas, semaphorinas e ephrins4,5,6. Essas pistas moleculares e outros fatores13 são integrados pelos crescentes axônios, desencadeando a dinâmica dos complexos de adesão e as forças mecânicas transacionadoras através do citoesqueleto14,15,16. Para gerar gradientes moleculares em culturas 3-D para navegação axonal, pesquisadores pioneiros usaram substratos de coágulo plasmático17, que também foi utilizado para preparações organotípicas de fatia18. No entanto, em 1958, foi relatado um novo protocolo para a geração de hidrogéis de colágeno 3-D para estudar com os dispositivos da Maximow19, uma plataforma de cultura, utilizada em vários estudos adequados para observações microscópicas20. Outro estudo pioneiro relatou o gel de colágeno como uma ferramenta para incorporar fibroblastos humanos para estudar a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos em processos de cicatrização de feridas21. Paralelamente, Lumsden e Davies aplicaram colágeno da derme bovina para analisar o efeito putativo do fator de crescimento do nervo (NGF) na orientação das fibras nervosas sensoriais22. Com o desenvolvimento de novas plataformas de cultura (por exemplo, placas multipoços) por diferentes empresas e laboratórios, as culturas colágenas foram adaptadas a esses novos dispositivos6,23,24,25 ,26. Paralelamente, um extrato de material de ECM derivado da linhagem de células tumorais de Engelbreth-Holm-Swarm foi disponibilizado comercialmente para ampliar esses estudos27.
Recentemente, vários protocolos foram desenvolvidos para gerar gradientes moleculares com papéis putativos na orientação do AXON usando hidrogéis 3-D (por exemplo, colágeno, fibrina, etc.) 28. Alternativamente, a molécula candidata pode ser imobilizada em diferentes concentrações em uma matriz porosa (por exemplo, NGF29) ou gerada pela cultura em uma pequena região dos agregados de células hidrogel 3-D secretando a molécula para gerar um radial gradiente4,23,24,25,26. A última possibilidade será explicada neste protocolo.
O procedimento apresentado aqui é um método fácil, rápido e altamente reprodutível baseado na análise do crescimento axonal em culturas 3-D do hidrogel do cérebro embrionário do rato. Em comparação com outros métodos, o protocolo é bem adequado para pesquisadores não treinados e pode ser totalmente desenvolvido após um treinamento curto (1-2 semanas). Neste protocolo, Nós isolamos primeiramente o colagénio das caudas adultas do rato para gerar mais matrizes 3-D em que os agregados genetically-modificados da pilha são cultivados na frente do tecido neuronal embrionário. Estes agregados de células formam gradientes químicos radiais de uma molécula candidata que provoca uma resposta para os axônios crescentes. Finalmente, a avaliação dos efeitos da molécula em axônios crescentes pode ser facilmente realizada usando uma microscopia de contraste de fase ou, alternativamente, métodos imunocitróxicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O crescimento de axônios em desenvolvimento é principalmente invasivo e inclui a degradação e a remodelação do ECM. Usando o procedimento aqui apresentado, os pesquisadores podem obter uma matriz 3-D homogênea formada pelo colágeno tipo I natural, em que os axônios (ou células) podem responder a um gradiente químico secretado por células geneticamente modificadas como eles fazem in vivo. Diferentes respostas axonais a gradientes de pistas atraentes ou inibitórias (proteínas, lipídios, etc.) podem ser facil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Tom Yohannan pelo Conselho editorial e M. segura-Feliu pela assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo programa CERCA e pela Comissão para universidades e pesquisa do departamento de inovação, universidades e empresa da Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Este trabalho foi financiado pelo Ministério espanhol de pesquisa, inovação e Universidade (MEICO) através de BFU2015-67777-R e e RTI2018-099773-B-100, a rede espanhola prion (PRIONET Spain AGL2017-90665-REDT), eo Instituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
References
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