Een nieuwe methode voor de bereiding van de monsters werd ontwikkeld zodat de cel- en weefseltransplantaties coculture op te sporen klein molecuul uitwisseling met behulp van spectrometrie van de massa van de beeldvorming.
Imaging massaspectrometrie (IMS) is routinematig toegepast op drie soorten monsters: weefselsecties, spheroïden en microbiële kolonies. Deze types van monster hebben zijn geanalyseerd met behulp van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) te visualiseren van de verdeling van eiwitten, lipiden en metabolieten in de biologische steekproef van belang. We hebben een nieuwe steekproef voorbereiding methode die de sterke punten van de drie vorige toepassingen aan te pakken een underexplored benadering combineert voor de identificatie van chemische communicatie bij kanker, door het zaaien van zoogdiercellen culturen in agarose in ontwikkeld coculture met gezonde weefsels gevolgd door uitdroging van het monster. Zoogdieren weefsels en cellen zijn cocultured in de nabijheid waardoor chemische communicatie via verspreiding tussen de weefsels en cellen. Op specifieke tijdstippen, wordt het monster agarose gebaseerde gedroogd op dezelfde wijze als microbiële kolonies IMS analyse voorbereid. Onze methode is ontwikkeld om de communicatie tussen hoogwaardige sereuze eierstokkanker afgeleid van de eileider, zoals deze met het ovarium tijdens metastase samenwerkt model. Optimalisatie van de bereiding van de monsters resulteerde in de identificatie van noradrenaline als een belangrijke chemische component in de eierstokken communicatie. Deze nieuw ontwikkelde methode kan worden toegepast op andere biologische systemen die een goed begrip van chemische communicatie tussen aangrenzende cellen of weefsels vereisen.
Imaging massaspectrometrie (IMS) is geoptimaliseerd voor het karakteriseren van de ruimtelijke spreiding van moleculaire kenmerken in drie veelgebruikte toepassingen: weefsel segmenten, spheroïden en microbiële kolonies1,2,3. Weefsel segmenten kunnen worden gebruikt om te evalueren van de lokalisatie van metabolieten in de context van biologische omstandigheden in een host, ofwel gerichte of een ongerichte binnen een specifieke waaier van de massa. Verschillen tussen moleculaire functies zijn echter de meest belangrijke en duidelijk wanneer een gezond weefsel wordt vergeleken met een zieke aandoening, bijvoorbeeld een tumor. Deze IMS-benadering is vooral aangepast aan opsporing van ziekte biomarkers, echter het verwerven van weefselmonsters in discrete stadia in de progressie van de ziekte (zoals tumor rangen) zich verzet tegen de identificatie van signalen die belangrijk voor de inleiding van zijn kunnen de ziekte. De uitwisseling van informatie door de ruimte is een alomtegenwoordige functie van veel biologische systemen, en weefsel segmenten kunnen niet vangen dit dynamische chemische estafette. Een techniek die kan visualiseren van chemische uitwisseling en verspreiding is IMS van microbiële kolonies geteeld op agar platen; kleine moleculen kunnen te verspreiden door en over de agar en via laser matrix-bijgewoonde (MALDI-TOF) desorptie/ionisatie massaspectrometrie4kunnen worden vastgelegd. Deze groei setup kan worden gebruikt voor het identificeren van moleculen uitgewisseld tussen discrete biologische entiteiten (kolonies) en gerichtheid van de metaboliet productie ook kunt bepalen. Het platform oorspronkelijk ontworpen voor microbiële kolonie groei werd aangepast aan het verkennen van het primaire metabolisme van weefsel explantaten gegroeid met zoogdiercellen en IMS werd gebruikt voor het evalueren van de dynamische chemische uitwisseling in een in vitro zoogdieren systeem.
In de afgelopen jaren, duidelijk geworden dat hoogwaardige sereuze eierstokkanker (HGSOC) vaak in de eileider epitheel (VTE ontspringt) en klik vervolgens metastasizes naar het vruchtbeginsel tijdens de vroege ziekte ontwikkeling5,6, 7 , 8. de reden dat tumorigene FTE verspreiding naar de eierstok cellen, waar grote tumoren uiteindelijk vormen en verder metastaseren, is nog onduidelijk. Eerder onderzoek heeft zich gericht op de rol van ovariële eiwitten in primaire metastase aan de eierstokken; echter, onlangs is gebleken dat de overgang van een gezonde naar een tumorigene weefsel in massale verstoring van cellulaire metabolisme resulteert en verandert van de productie van kleine molecules9,10,11. Dus veronderstelde we dat kleine moleculen die worden uitgewisseld tussen de FTE en de eierstok medeverantwoordelijk voor primaire metastase van HGSOC kunnen worden.
Met onze nieuw ontwikkelde IMS-procedure, hebben wij vastgesteld dat coculture van tumorigene FTE en gezonde eierstokweefsel de productie van noradrenaline uit de eierstok induceert. Andere celtypes of normale FTE cellen deed dit effect echter niet uitlokken. Een buitengewone voordeel van deze methode is dat de moleculaire productie en een uitwisseling van signalen waarmee echte moleculen kunnen worden gevisualiseerd, dus zelfs in een coculture is het mogelijk om de bron van een signaal te bepalen. Dit is een voordeel ten opzichte van de analyse van monsters van gehomogeniseerde, waar alle ruimtelijke informatie verloren gaat. In ons modelsysteem konden we duidelijk de productie van noradrenaline toewijzen in de eierstok. Noradrenaline is gekoppeld aan de metastase en chemoresistance van ovariële kanker, en onze opsporing van dit molecuul heeft gevalideerd, dat de nieuwe IMS-methode biologisch relevante moleculen12,13, ontdekken kan 14. deze validatie laat ons voorstellen dat deze nieuwe toepassing van IMS bijzonder nuttig zijn kan om onderzoeksgroepen die probeert om te identificeren van kleine molecules in coculture omgevingen en om te begrijpen van de vroege gebeurtenissen die van invloed zijn Celtransformatie en metastase. Het algemene doel van deze methode is het ophelderen van de identiteit en de ruimtelijke spreiding van de kleine moleculen tijdens uitwisseling tussen weefsels en organen, vertegenwoordigd door in vitro 3D celculturen of ex vivo weefsel.
Er is een groeiend lichaam van bewijsmateriaal dat noradrenaline de rol in HGSOC12,17,18 impliceert, en deze techniek meer mechanistische informatie heeft bijgedragen. Met ten minste acht biologische omstandigheden aanwezig op dezelfde dia, kan de methode goed zijn voor biologische besturingselementen zoals gen, evenals cel specificiteit en controles van de media in een enkele IMS uitvoeren. Terwijl de methode is geoptimaliseerd…
The authors have nothing to disclose.
Financiering werd verstrekt door het Consortium Chicago biomedische met steun van de fondsen van de Searle op The Chicago Gemeenschap Trust (C-076) (L.M.S.); Universiteit van Illinois te Chicago opstarten middelen (L.M.S.); Subsidie 543296 van de ovariële kanker onderzoek Fonds Alliantie (M.D.); en UG3 ES029073 (J.E.B.) en door het National Center for Advancing translationeel Sciences, National Institute of Health, door middel van subsidie UL1TR002003 (JEB & LMS).
15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |