Summary
試料調製法は、イメージング質量分析法による低分子交換を検出する細胞・組織の培養を対応するために開発されました。
Abstract
イメージング質量分析 (IMS) が 3 種類の試料に日常的に適用されています: 微生物コロニー、回転楕円体、ティッシュ セクション。これらのサンプルのタイプは興味の生物的サンプルの蛋白質、脂質、および代謝物質の分布を可視化するマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析 (MALDI-TOF MS) を使って解析しました。エコイノベーション アプローチでアガロースに哺乳類の細胞培養を播くことによって、がんの化学交信を識別するために対処するため 3 つの以前のアプリケーションの長所を組み合わせて、新規サンプル調製法を開発しました。サンプルの乾燥が続く健康な組織培養します。哺乳類の組織や細胞は、組織と細胞の拡散を介して化学通信を許可する近接遊走が。特定の時点でアガロース ベースのサンプル、微生物コロニー IMS 分析の準備と同じ方法で乾燥させます。それは転移中に操作すると、卵巣に卵管から派生したハイグレード漿液性卵巣癌間の通信をモデル化する手法が開発されました。サンプル調製の最適化は、卵巣の微小環境の主要成分としてノルエピネフリンの特定につながった。新たに開発したこのメソッドは、隣接する細胞や組織間の化学コミュニケーションの理解を必要とする他の生物学的システムに適用できます。
Introduction
3 つの広く使われているアプリケーションの分子機能の空間分布を特徴付けるために最適化されているイメージング質量分析 (IMS): 組織スライス、回転楕円体、および微生物コロニー1,2,3。切片は、ホスト、ターゲットまたは関連性の低い特定の質量範囲内で生物学的条件のコンテキストにおける代謝物の局在の評価に使用できます。ただし、分子の機能の違いは最も重要かつ明らかな病的状態、たとえば、腫瘍に比較すると健康な組織。この IMS アプローチは特に疾患バイオ マーカーの検出、ただしの開始のために重要なことができる信号の識別ができなくなります (腫瘍グレード) などの病気の進行の各ステージで組織サンプルを取得、病気。空間を介して情報の交換は多くの生物学的システム、ユビキタス機能と組織スライスは、このダイナミックな化学リレーをキャプチャできません。化学交換と拡散を可視化することができる 1 つの方法は寒天プレート上に成長した微生物のコロニーの IMS小さな分子は寒天とを通じて拡散することができる、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI TOF) 質量分析法4経由で取り込むことができます。この成長のセットアップは、離散生物学的実体 (植民地) 間で交換される分子を識別するために使用することができ、代謝産物生産の方向性を決定することも。微生物コロニー成長用に設計されたプラットフォームは哺乳類セルの成長組織移植片の一次代謝を探索に適応され、IMS は in vitro 哺乳類システムの動的の化学交換の評価に使用されました。
ハイグレード漿液性卵巣癌 (HGSOC) が卵管上皮 (FTE) に由来する多くの場合、早期疾患開発5,6,中に卵巣に転移し明らかになった過去数年間で7,8. FTE の幹細胞、最終的に大きな腫瘍を形成、さらに転移、卵巣への普及であることの理由は不明です。前の研究は主に転移、卵巣卵巣の役割に焦点を当ててください。しかし、それが健康から発癌性の組織への移行が細胞代謝の大規模な破壊の結果し、変更する小分子9,10,11の生産実証最近されています。したがって、我々 の仮説、FTE と卵巣の間で交換される低分子化合物 HGSOC の主な転移に部分的に責任があります。
私たちの新しく開発された IMS プロシージャを使用して、幹の FTE と健康な卵巣組織の培養が卵巣からノルエピネフリンの生産を誘導することを決定しました。ただし、他の細胞の種類や細胞の FTE はないこの効果を引き出します。この方法の特別な利点、分子の生産および実際の分子を表す信号の交換を視覚化できる、共に、シグナルの原因を特定することが可能です。これは空間のすべての情報が失われる均質化試料の分析上の優位性です。モデル体制で明らかに卵巣にノルエピネフリンの生産を割り当てることができました。ノルエピネフリンは転移と卵巣癌の抗癌剤にリンクされており、IMS 方式が生体関連分子12,13,を発見することがこの分子の検出機能の検証が14. この検証は、私たち IMS のこの新しいアプリケーションは特に細胞形質転換に影響を及ぼす早期のイベントを理解して培養環境で小さい分子を識別するためにしようとしているグループの研究に役に立つことを提案することができます・転移。このメソッドの全体的な目標は組織や臓器、3 D 細胞培養体外または前のヴィヴォ組織によって表される間の交換の間に小さな分子の空間分布とアイデンティティを明らかにします。
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Protocol
すべての動物の手続きケアと実験動物の使用のための国民の健康ガイドライン機関に従って、イリノイ大学シカゴ校制度上の動物の使用とケア (IACUC) 委員会によって承認されました。
1. 試薬の調製
- マウス卵管上皮 (萌) 細胞 10% 牛胎児血清を添加したアルファ最小必須培地 (アルファ MEM) メディアで加湿のインキュベーターで 5% CO2と 37 ° c (FBS)、2 mM L-グルタミン、10 mg/mL インスリン、トランスフェリン、セレン (ITS) を維持します。、1.8 ng/mL 上皮成長因子 (EGF)、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、1 mg/mL ゲンタマイシン 18.2 ng/mL エストラジ オール-17 β。セルごとに 3-4 日を渡すと、同じ日に十分なセルがあることを確認、マウスが犠牲に。
- 2% の agarose を準備するには、低融点アガロースの 1 g を 50 mL の蒸留水を混合します。クールに、オートクレーブ、アガロースを許可して、因数 (1 mL) 2 ml 管 (材料表参照) agarose が固化する前に。アガロースは、-20 ° C で無期限に格納できます。
- 1 x ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) メディアの少なくとも 2 mL を準備します。
- MALDI-TOF MS のマトリックスの準備 5 mg/mL を 10 mL の 1:1 α-シアノ-4-hyroxycinnamic 酸 (CHCA): ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) (材料表参照) 90: 10 ACN:H2O + 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA)。マトリックスを溶解するまでのソリューションの超音波照射します。
2. マウスのコロニーおよび卵巣除去
- 住宅の標準的なプロシージャを使用して CD 1 マウスの繁殖ペアを維持します。分娩の日、近くの子犬時代が知られているのでで、マウスを毎日チェックします。
- NIH のガイドラインあたりの CO2吸入で 16-18 日齢で子犬を安楽死させます。配信 CO2 (100%)流れ率 10% – 20% の 1 分あたりのボリュームを商工会議所、呼吸が停止していた後 2 分間続けます。頚部転位して安楽死を確認します。
- 70% のエタノールの沈没によってすべての手術用機器を消毒します。1 x ペニシリン-ストレプトマイシンを 37 ° C でリーボビッツの L-15 メディアをウォーム アップします。
- 領域を消毒し、毛の混入を最小限に抑えるための 70% のエタノールと腹部の表面を湿らせます。把握は腹壁を覆っている皮膚を使用して鈍い鉗子と使用外科はさみ、大きな V 字カット皮膚と腹壁を通して臓器の内部を公開します。
- 内臓を鉗子を使用する側に移動します。個別に微細鉗子でそれぞれの子宮角をつかむし、少し持ち上げてください。
- 卵巣、腎臓のすぐ下の子宮角の終わりにあるを探します。外科はさみを使用して、結合組織の無料の卵巣を解剖します。その後、卵巣のホーンを半分にカットします。
- 卵巣、卵管および約 1 つ移動に予め温めておいたリーボビッツの L-15 メディアにそれぞれの子宮角の半分。
- 解剖顕微鏡下卵管やブルサ、任意の脂肪組織から解放、周囲滑液包からそれぞれの卵巣を慎重に移動します。リーボビッツの L-15 メディアの新しい皿にそれぞれの卵巣を移動します。
- 軸それぞれの卵巣は半分にカットします。卵巣部分 (今呼ばれる植) agarose のめっきまで 37 ° C で保管をしてください。
3. 設定と共培養系の伊藤扱われるスライドをインキュベート
-
分割されていない共培養系
- 70 ° C のホット プレート上でアガロースをゆがみ。
- インジウム酸化スズ (伊藤) の上に 8 もディバイダーを配置-扱われたスライド (図 1 a)。スライド接着におけるエイズの仕切り部分をゴム底が漏洩しないまたは井戸間混合ように agarose めっき中に連続下向きの圧力を適用することを確認します。
- 15 mL コニカル管、遠心分離機 (800 rpm で 5 分) の細胞を収集し、50 k に 1 x DMEM メディアで 150 μ L あたりの細胞を再懸濁します。異なるセル密度が最適の場合は、このステップで、細胞懸濁液は 2 x (例えば、300 μ L、この段階での細胞密度の 50,000 セルの最終濃度は 150 μ L の 50,000 セル) の最終の密度が必要なを確認します。
- 細胞培養をメッキする前に追加卵巣植よく (図 1 b) の中心に。
- めっき前に個々 の 2 mL 管各細胞の培養にアガロースを追加します。各ウェルの細胞懸濁液 200 μ L、200 μ L 2 mL 管で液化 agarose を組み合わせます。たとえば、4 つの井戸を組み合わせて細胞懸濁液を 800 μ l 添加し、800 μ L 2% の agarose の。いくつかの混合物が残されるが、ピペッティング時に空気の泡を回避必要以上少しを作るします。
- すぐにその細胞の培養をメッキする前に個々 の細胞培養にアガロースを追加します。Agarose が 1 分未満でクールなプレートすぐに用意されます。
- すぐに各ウェル (図 1) に細胞・ アガロース培養混合物の 300 μ L を追加します。図 1は、各メッキ卵巣と 3 つのセルの条件と 1 つのメディアの状態を示しています。
- 加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でスライドを孵化させなさい。
-
分割共培養系。
- 薄く、滑らかなプラスチック (図 2 a) から仕切りをカットします。
注: この実験は、平らで薄いので滅菌使い捨てメディア洗面器の側面を使用します。それらはちょうどよく (~ 13 mm) の斜辺にぴったり収まる幅をカットします。 - 70 ° C のホット プレート上でアガロースをゆがみ。
- 伊藤治療スライド (図 2 b) の上に 8 も区切りを配置します。スライド接着におけるエイズの仕切り部分をゴム底が漏洩しないまたは井戸間混合ように agarose めっき中に連続下向きの圧力を適用することを確認します。
- 15 mL コニカル管、遠心分離機 (800 rpm で 5 分) の細胞を収集し、50 k に 1 x DMEM メディアで 150 μ L あたりの細胞を再懸濁します。異なるセル密度が最適な場合、この段階で細胞懸濁液は必要に応じて最終密度 x 2 を確認してください (例えば 300 μ L で 50,000 セルの最終的な集中、この段階で細胞密度は、150 μ L の 50,000 のセル)。
- 井戸 (図 2) にプラスチックの仕切りを斜めに挿入します。
- めっき直前時に各セル中断の 1 つにアガロースを追加します。各ウェルの細胞懸濁液を 100 μ l 添加し、2 mL 管で液化 agarose の 100 μ L を組み合わせます。たとえば、4 つの井戸を組み合わせて細胞培養の 400 μ L と 2% の agarose の 400 μ L。いくつかの細胞・ アガロース培養混合物が残されるが、ピペッティング時に空気の泡を回避必要以上少しを作るします。
- すぐにその細胞の培養をメッキする前に個々 の細胞培養にアガロースを追加します。Agarose が 1 分未満でクールなプレートすぐに用意されます。
- 分周器の 1 つの側面の細胞・ アガロース培養混合物の 150 μ L をプレートします。クールし (約 1 分) を固めるし、分周器 (図 2 D) を削除する agarose を許可します。
- 卵巣植を井戸の空の半分の中央に配置します。場所 150 μ L メディア ・ アガロース培養混合上卵巣とよく (図 2 e) の正しい側にのみ。
- 加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でスライドを孵化させなさい。
- 薄く、滑らかなプラスチック (図 2 a) から仕切りをカットします。
4. スライドを乾燥と MALDI-TOF MS の準備
- 4 日後 (または任意の最寄りの時点) アガロース プラグとスライド (図 1) から商工会議所の区分線を削除します。平らなヘラで商工会議所から agarose の側面を注意深く取り外し、軽く引いてチャンバー、上向き移動任意のアガロース プラグに触らない。彼らが移動を行う場合そっと移動してようにして彼らが互いを触れていません。
- 約 4 時間、回転 90 ° 毎の h の 37 ° C のオーブンでスライドを配置します。
注:スライドの回転は、サンプル全体をとおして均等な熱分布を確保することが重要です。 - 一度乾燥し、オーブン (図 1E) からスライドを削除します。
- 次のパラメーターで (図 1 階)、噴霧器を使用してマトリックス ソリューションを適用: 温度 30 ° C、流量を = = 0.2 mL/分、パス数 = 8、方向 = CC とノズルの距離 = 40 mm。
注: マトリックス スプレーの代わりに芸術的なエアブラシは液体マトリックスを適用する使用できます。スプレー、同じマトリックス ソリューションを使用できますが、約倍のソリューションが必要です。それが垂直にハングアップするので、クランプのスライド、スライドをスプレー 90 ° の角度から離れておよそ 1 フィートから (ホフマン15から適合) 行列までレイヤーが表示されます。 - Calibrant の 1 μ L を追加 (ターゲットのリン赤 < 500 Da、ペプチドの混合物 (材料表参照) ターゲットの < 5,000 Da) スライド上の明確なスポットに。マトリックスと混合するリン赤は必要ありませんが、ペプチド混合物イオン化を支援するためにマトリックスとの 1:1 混合物が必要です。Calibrant 乾燥するを待ちます。
- X を描くスライドの各コーナーで永久的なマーカーを使用して、カメラまたはスキャナーを使用して、1,200 dpi の光学イメージを取る。
5. イメージング質量分析データ集録
- IMS データ解析ソフトウェアに新しいシーケンスを開く (材料の表を参照してください)。目的の空間解像度、少なくとも 50 μ m にラスターの幅を設定します。
- スライドの画像は、光を解析ソフトウェアにアップロードし、設定 3 の交差を使用してポイントを教える、X の各隅に描画します。
- 集録ソフトウェアの投射のための関心領域を指定し、それに応じて名前を付けます。
- データ集録ソフトウェアを使用して計測器を校正 (材料表参照) 5 ppm の誤差範囲内で。
- 最適化されたメソッドを保存し、実行を開始します。この実験は、次のパラメーターを最適化: 極性正、検出器を = = リフレクトロン、レーザーのサイズ = 2、レーザー出力 = 50%、反射モード検出器ゲイン = 3 x。
6. 処理 IMS データ
- 統計ソフトウェアにインポート *.mis ファイル (材料の表を参照してください) 重要性の分析のため。
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Representative Results
フラット乾燥サンプルで最適な乾燥の伊藤スライドになりますアガロースとスライド (図 3) の空間的な分離を維持する agarose 部分の表面にしわを最小限に抑えています。図 3 aは、図 3 bは、避けるべきであるしわを示しています一方、最適な乾燥を示しています。この最適化は、相対湿度に基づく監視オーブンでスライドの正確な時間は異なることができます注意してください必要があります。しわ少し高さに影響を与えるが、IMS の質量精度の信号のため、わずかなしわは、データの品質を影響しません。したがって、最終的にはわずかなしわを持つアガロース MALDI-TOF MS 経由で分析できます。スライドを完全に乾燥する必要があります。 またはこれは MALDI-TOF 質量分析計の高真空中での試料の爆発を引き起こす可能性があります。
アガロースは別として他の基板を動作可能性がありますが、しばしば乾燥または広がる伊藤スライドと空間情報の損失の結果も商工会議所の除去時に構造完全性を維持しません。たとえば、我々 は以前、基板としてのコラーゲンをテストしているこの結果拡散と空間情報よくチャンバーだったときの損失は削除 (データは示されていない)。使用組織をことで分割でない場合井戸の中心または半分の三角形の中心にそれが分割されている場合、IMS データの取得は、エッジ効果で汚染されていません。図 4は、ひどく置かれた組織 (パネル B) と最適配置組織 (パネル) の例を示します。図 4 b組織に agarose の端にある、エッジ効果から大量の疑似信号をイメージを作成、可能性があります信号を分泌することを見逃す可能性があります、組織を取り巻くアガロースをイメージするユーザーを許可しません中に分析。組織は、図 4 aに示すよう、可能な限りセンターに近いする必要があります。
一連の実験決定孵化、6 ウェル プレートおよび 24 ウェル プレートと比べて最高の容器を 8 よく部屋にいたので 8 よくチャンバー、細胞に最低限摂動他の大きい部屋を必要とするのに対しアガロースは次の孵化16伊藤またはステンレス スチール スライドに転送するスラブします。チャンバー スライドのいくつかのブランドから 8 もチャンバーを使用できますが、簡単な紹介や分割の井戸のプラスティックの取り外しを容易井戸の粘着性のゴム底と平行側面が付いています。6 ウェル プレートに多くの材料を必要な状況に直面してこのような大規模な領域を乾燥.井戸でメニスカス効果が明らかになったので、24 ウェル チャンバーも乾燥中に問題を抱えて、したがって、プラグが有意に高いエッジを持つ乾燥します。8 よくチャンバーは、井戸の中心に直接 agarose をメッキし、アガロース プラグを転送する必要はありませんは、メニスカスの影響で行われません。さらに、テストする単一の実験の制御 8 条件 8 よくチャンバーを使用できます。実験によっては、(1) 卵巣外植片またはセル、セルのみ、井戸 (2) や (3) 卵巣植だけで井戸と井戸などのコントロールを含めることが重要があります。(正確なメディア、アガロースの濃度、マトリックス量等) のサンプル準備は実行によって少しずつ異なります、ので状況は同じスライド上取得する際に比較する必要があります。
さらに実験と判断インキュベーション MALDI 鋼板セルの目視状態および位置スライドできるのでと比較されたときに最適なプラットフォームを ito スライドにしました。例えば、ITO スライドを使用して、検証できる細胞に正常な形態があるし、彼らは前にアガロースと次の乾燥16全体均一な分布を維持します。スライドはまた必要に応じて蛍光細胞の混入のましょう。さらに、乾燥前に商工会議所の除去は、アガロース プラグの全体を維持するために必要です。スライドは乾燥した場合 8 よくチャンバー付着、プラスチック アガロース プラグを離れて引っ張るし、プラグの大きな亀裂の結果します。図 5は、乾燥前に商工会議所が削除されていないときに直面した問題を示しています。
細胞集団の分析、空間分解能は少なくとも 50 μ m を組織や細胞の相互作用の小さいサイズのキャプチャを開始することが重要です。溶射の行列と 5 ミクロンの分解能を達成するために不可能だが、これは同等の結果を生成しながら質量分析データを収集するために全体の時間を長きます。空間分解能は MALDI-TOF 質量分析計でレーザーを集中する能力に依存しています。
全体的にみて、最高共に交換した小分子を検出するには、このスライド セットアップを最適化しています。したがって、データ分析の中にしか存在しないまたは興味の生物学的条件を表すアガロース プラグより大幅豊富分子の機能を求めています。7 つの他のコントロールとスライドの条件を含めるためのオプションが存在するため、視覚的に、IMS データ用統計解析ソフトウェアによるこの実現できます。私たちの dereplication プロセスの空間的関連性の高い大衆の検出は、我々 は直交高分解能質量と断片化データを取得できるように、広範なです。我々 は dereplication、最初のステップは、データベース、哺乳類の代謝物など人間メタボローム データベース (検体) を質量の公称値の検索です。データベースの分子のほとんどは、スペクトルの実験データと比較するための多くのテクニックをカバーのかなりの数をあります。公称質量があると推定される身元として潜在的な候補分子は、一度よくフラグメンテーション、UV のプロファイル、および候補構造と標準保持時間などの物理的なデータを比較することが可能です。
たとえば、卵巣組織を培養した発癌性の FTE 細胞の共培養におけるノルエピネフリンの同定は、この IMS メソッドがこのシステム16から関連する小分子を検出できることを検証してきました。図 6は、1 つが分割されていない部屋のプロトコルに従うことによって期待されるデータの種類を示す IMS 実行の感度を示しています。図 7は、同様に副室のセットアップのための代表的なデータを示します。
図 1: 非分割共のサンプル準備のためのワークフロー 。(A) 重要 8 よくチャンバー ito スライドの導電性の側に。(B) 場所は、培養条件のための井戸の中心で卵巣を半減しました。(C) 井戸に直接アガロース/細胞懸濁液の追加 300 μ L。空気の泡がない卵巣が井戸の中心に残っていることを確認します。Pipetted アガロースは、卵巣を妨げられる場合そっと agarose を冷却する前に、それを中心にピペット チップを使用します。(D) インキュベーションの 4 日後 (またはそうでなければ時間を最適化) 8 もチャンバーをスライドから削除します。アガロースは、商工会議所にアタッチしたまま場合、そっとへらを使用して商工会議所からアガロース プラグを外し、スライド上を移動します。簡単に移動するようになりますので、agarose はスライドに付着しません。スライドの各コーナーで 'X' を描く、写真を撮る。(E) スライド回転 90 ° 毎時間 4 h の 37 ° C のオーブンで乾燥させます。アガロースは、完全に乾燥する必要があり、フラット スライドにうそをつく必要があります。(F) 適用スライドするスプレーやエアブラシで任意の行列。マトリックス レイヤーを表示するか黄色として。1,200 dpi のスキャナーでスライドをスキャンし、calibrants または MALDI-TOF 質量分析のための基準を追加します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 分割共のサンプル準備のためのワークフロー。(A) カット メディア盆地 (~ 13 mm) からタブし、側面がまっすぐであることを確認します。(B) 添付 8 よくチャンバー ito スライドの導電性の側に。(C) 井戸に仕切りを斜めに挿入します。分周器の 1 つの側面に agarose の追加 150 μ L (D) 細胞培養は、クールに、アガロースを許可して、区分線を削除します。(E) 追加卵巣メディアと agarose のサスペンションの 150 μ L で空も半分とカバーの中心に。この図は、Zink ら 201816から許可を得て再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: アガロース プラグでしわ。しわは、スライドが長すぎるためオーブンに残っている場合、アガロース プラグで形成できます。これは MALDI-TOF 質量分析からサンプルをされなくなりますが、データの品質に影響を与える可能性があります。(A) 最適な乾燥したスライドの画像です。周囲の卵巣組織 agarose のすべては、完全に平らでしわ、十分な領域を提供する IMS の分析のための無料です。(B) サンプル全体をとおしてしわ agarose が付いて悪い乾燥したスライドのイメージ。この図は、Zink ら 201816から許可を得て再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 組織の位置決め。乾燥サンプルで組織の位置はデータ集録のため非常に重要です。(A) 分けられた部屋の乾燥アガロース プラグが 1 つの中心に卵巣を表示だけでなく、イメージングに最適な半。(B) 卵巣は孵化や乾燥に集中しない副室のアガロース プラグを乾燥します。卵巣の組織は、アガロース プラグの周囲に乾燥し、分析できません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 乾燥チャンバー スライドです。商工会議所除去する前にオーブンでスライドを設定すると、アガロース プラグはより強く自分自身よりもプラスチックに付着し、熱で離れてプルを開始します。これは、結果スライド自体に深刻な亀裂、アガロースや付着が少ない。この大規模な亀裂は、IMS の解析に向いていません。トップ: スライド 8 ウェルを納めた 2 h 乾燥付着後。すべてのアガロース プラグが 2 つ 8 よくチャンバーへの接着のためセンターを介してひびの入った。下: スライド 8 も商工会議所の取り外しの後。1 つだけのアガロース プラグは、スライドに残った。この図は、Zink ら 201816から許可を得て再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: ユニークな信号検出します。8 条件を比較すると、1 つの単一条件に固有の信号を検出することが可能です。(A) 乾燥したスライド イメージを使用して MALDI-TOF 質量分析計のイメージ領域を教えます。ここで 50 μ m (B) A 代表的な画像は、同じスライド上のすべての 8 対 1 つの条件で亢進/z は m信号の IMS の卵巣組織の周りの小さな領域を選択しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 副室セットアップから代表的なデータです。卵巣組織の白の通りです。M/z 112 がよく含んでいる卵巣の半分から分泌されます。IMS は、50 μ m で行われました。この図は、Zink ら 201816から許可を得て再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
HGSOC12,17,18, ノルエピネフリンの役割を関係づける証拠の成長するボディがあるし、この手法は、多くの情報を貢献しています。同じスライド上に存在、少なくとも 8 生物学的条件、メソッドの実行する単一の IMS のメディア コントロールと同様、遺伝子および細胞の特異性など生物学的コントロールのアカウントことができます。メソッドの最適化を評価する HGSOC、任意のセルの主要な転移のモデルで小さな分子を交換やさまざまな生物学的質問と病気の状態を分析する agarose で配置することができます組織型を置き換えることができます。
プロトコルの最も重要な手順の 1 つはティッシュまたは細胞のタイプが互いに近くには、アガロース プラグの中心に存在を確保することです。もう一つの重要な考慮事項は、スライド全体の乾燥時間の最適化です。このメソッドは、簡単に乾燥する、スモール サイズが少し乾燥合併症の結果、卵巣のティッシュを使用して最適化されました。しかし、他の組織は、脂肪のような異なる組成乾燥の非常に異なるプロファイルとためより広範な乾燥の最適化が必要があります。乾燥は、生物学的サンプルに最適化されています後、残りのワークフローは最小限の変更だけを要求するべき。
質量スペクトルの取得中には、多くのプロジェクトが小分子以外の化合物のグループの分析を要求するそうです。集録およびマトリックスの選択用 IMS パラメーターしたがって、適合させるべきそれぞれのターゲットの最高のデータを生成するがわかっている場合。また、我々 はのみ 50: 50 CHCA:DHB 行列と肯定的なモードでデータ集録を行ったが、負のモードの実験は、行列の異なるタイプを好むことがありますより大きい分子が別のマトリックスにもより簡単に検出されます。メソッドは、ターゲットを絞った検索の関連性の低いアプローチの広い質量範囲または狭い質量範囲で使用できます。上記の議論の方法の場合小分子焦点 agarose 細胞・組織の代表者との間で交換された分子を検出することでしたので興味の対象であった。Agarose によって動きを阻害するサイズや構造面での制限を主張することはできません、私たちの目的は私達のマトリックスの決定と MALDI-TOF MS パラメーターは目標達成のために最適化した小分子を検出するだった。今後の実験計画に開発されている弊社独自の習得方法で見落としているタンパク質と脂質をターゲットします。
化合物クラス検出の制限、に加えてこのメソッドではセル アガロース、互換性があることと、組織サンプル (使用される場合) 8 ウェル室に合うように適応も必要があります。特定の組織は大きい井戸に合わせることができる少ない生物学的条件は選択した組織が後乾燥4未満 100 に 200 μ m の均一な高さになるまで乾燥できることが重要だが比較のため必要な場合。複数の生物学的サンプルは、組織との通信の 1 つ以上のセルのタイプなど評価でした。サンプル準備はアガロースによる細胞培養の立体的な分離することができる、それはすることが可能割り当てる可視化m/z '観測拡散パターンに基づいて細胞文化のソースに。
IMS を使用して人間のサンプルやトランスジェニック マウス モデルから組織切片を研究する組織の複雑さを繰り返します。しかし、人間のサンプルは、病気の進行のようなことを勉強する能力を大幅に制限できる入手難。トランスジェニック マウス モデルからの組織は、明確に定義された時点で収集できます。しかし、マウスのモデルは、時間がかかり、高価な開発をすることができます。さらに、これらのモデルの両方の実際の組織の完全な複雑さは、特定の細胞や組織間のコミュニケーションを正確に評価することは困難ことができます。対照的に、ここで紹介した方法は、適応性の高いです。さまざまな組織や細胞は、通信の違いを検討する同じスライドに遊走することができます。たとえば、正常細胞または同じ組織から腫瘍細胞は、変換の違いを理解して同じスライドの培養することができます。時間コース研究が明らかに、細胞間シグナル伝達カスケードを小説や小分子阻害剤および/または RNAi 特定のシグナリング分子や代謝物の役割を調べるために組み込むことができます。これらの可能性はこの手法のさまざまなコンテキストでの細胞間コミュニケーションを勉強するために便利を作ると考えています。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
シカゴのコミュニティ信頼 (C-076) (L.M.S.); でサール資金からサポートとシカゴ医療コンソーシアムによって提供された資金イリノイ大学シカゴ スタートアップの資金 (L.M.S.);卵巣癌研究基金同盟 (医学博士); から 543296 を付与します。UG3 ES029073 (ジェブ) と進んで並進、国立衛生院、グラント UL1TR002003 を通じて (ジェブ ・ LMS) のための国立センター。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
