Het doel van dit protocol is om een nieuwe borstkanker modellerings aanpak te beschrijven op basis van de intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in muizen borstklieren. Deze aanpak maakt zowel cel-type-en orgaan-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen op een tijdelijk gecontroleerde manier mogelijk.
Borstkanker is een heterogene ziekte, mogelijk als gevolg van complexe interacties tussen verschillende cellen van oorsprong en oncogene gebeurtenissen. Muismodellen zijn instrumentaal in het verkrijgen van inzicht in deze complexe processen. Hoewel er veel Muismodellen zijn ontwikkeld om bijdragen te bestuderen van verschillende oncogene voorvallen en cellen van oorsprong aan borst tumorigenese, zijn deze modellen vaak geen celtype of orgaan specifiek of kunnen ze de initiatie van borsttumor vorming niet induceren in een op een tijdelijk gecontroleerde manier. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van een nieuw type borstkanker Muismodellen op basis van de intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus (AD-CRE) in muis borstklieren (MGs). Als gevolg van de directe injectie van AD-CRE in de melk kanalen, deze aanpak is MG specifiek, zonder ongewenste kanker inductie in andere organen. De intraductale injectieprocedure kan worden uitgevoerd bij muizen in verschillende stadia van hun ontwikkeling van MG (dus, het maakt temporele controle van de inductie van kanker, vanaf ~ 3-4 weken leeftijd). De specificiteit van het celtype kan worden bereikt door verschillende cel-type-specifieke promoters te gebruiken om CRE-expressie in de adenovirale vector te stimuleren. We tonen aan dat luminal en basale borst cellen epitheel (MECs) nauw kunnen worden gericht op CRE/loxP-gebaseerde genetische manipulatie via een intraductale injectie van AD-CRE onder de controle van de keratine 8 of Keratin 5 promotor, respectievelijk. Door het opnemen van een voorwaardelijke CRE Reporter (bv, CRE/loxP-inducible Rosa26-YFP Reporter), laten we zien dat MECS gericht door AD-CRE, en tumorcellen afgeleid van hen, kan worden getraceerd door het volgen van de reporter-positieve cellen na intraductale injectie.
Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van een nieuwe borstkanker Modeling aanpak op basis van een intraductale injectie van AD-CRE in de muis MG. De CRE/loxP recombinatie-gebaseerde genetische benadering is op grote schaal gebruikt voor het modelleren van menselijke borstkanker bij muizen. De eerste generatie van CRE/loxP-gebaseerde borstkanker Muismodellen worden gegenereerd door het gebruik van CRE-uitdrukken transgene muizen onder controle van MEC-specifieke promoters (bijv. Mmtv-CRE voor Luminale MECS en een deel van de basale Mecs, WAP-CRE en Blg-CRE voor Luminale voor ouders en alveolaire Luminale Mecs, K14-CRE voor basaal en een deel van luminal MECS1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. Hoewel deze CRE-transgene lijnen ruimtelijke controle van CRE-expressie mogelijk maken (d.w.z. in verschillende deelverzamelingen van MECS), staan zij de temporele controle van CRE-expressie en CRE/loxp-gemedieerde genetische manipulatie echter niet toe. De tweede generatie van CRE/loxp-gebaseerde borstkanker Muismodellen maken gebruik van induceerbare cytochromen CRE activiteit/expressie benaderingen (bijvoorbeeld, gebruik van CRE-oestrogeen receptor fusie [creer], die kan alleen induceren CRE/loxp recombinatie bij toediening van Tamoxifen), en Als gevolg hiervan maken deze genetische hulpmiddelen zowel ruimtelijke als temporele controles mogelijk van de activering van oncogene gebeurtenissen in MECS (bijv. K8-creer-en K5-creer-gebaseerde modellen) 10,11,12 . In beide generaties borstkanker muizen modellen, als promotors gebruikt om CRE of CreER uitdrukking (bijvoorbeeld, Krt8, Krt5) ook actief in epitheelcellen van andere organen (dat wil zeggen, ze zijn cel-type-specifieke maar niet orgaan-specifieke) of een ledende uitdrukking hebben in andere celtypen dan epitheelcellen (bijv. Mmtv, die ledende activiteit heeft in beenmerg hematopoietische cellen), kunnen deze benaderingen leiden tot de ontwikkeling van ongewenste kanker (s) in ander orgaan (en). Als deze onverwachte kankers veroorzaken letaliteit in de aangetaste muizen, het oorspronkelijke doel van het modelleren van borstkanker in deze muizen kan worden verboden (bv, Mmtv-CRE-driven oncogene gebeurtenissen kunnen leiden tot hematopoietische maligniteiten en vroegtijdige dood van de muizen , als gevolg van lektigheid van de promotor Mmtv in hematopoietische cellen)4.
Hier rapporteren we een borstkanker modellerings benadering bij muizen die zowel celtype-als orgaan-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen op een temporeel gecontroleerde manier mogelijk maakt. Deze aanpak is gebaseerd op een intraductale injectie van AD-CRE in MGs voor muizen (en is dus orgaan-specifiek). CRE-expressie kan worden bestuurd door gebruik te maken van verschillende MEC subpopulation-specifieke promoters die zijn ingebed in de adenovirale vector (bijv. Krt8 voor Luminale Mecs, Krt5 voor basale Mecs, waardoor de specificiteit van het celtype wordt bereikt). Kanker inductie in MGs kan tijdelijk worden gecontroleerd door een injectie van AD-CRE in muizen op verschillende leeftijden, beginnend vanaf 3-4 weken leeftijd (puberale) tot het volwassen stadium.
Het succes van deze aanpak voor het induceren van borsttumoren van verschillende subpopulaties van MECs berust niet alleen op het kiezen van geschikte Cell-Type-specifieke promoters (om CRE-expressie te stimuleren), maar ook op de intraductale injectieprocedure zelf. Het idee achter deze aanpak is dat de geïnjecteerde AD-CRE virussen worden bewaard in de ductale boom, die een verborgen structuur met lumen, en daarom, alleen MECs worden blootgesteld aan de virussen en zijn geïnfecteerd door AD-CRE. Vanwege de geringe lu…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (NIH) Grant R01 CA222560 en door Department of Defense baanbrekende Award W81XWH-18-1-0037.
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |