Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو وصف نهج جديد لنمذجة سرطان الثدي يستند إلى الحقن داخل القنوات من فيروس الغدة الدرقية الذي يعبر عن Cre في الغدد الثديية للماوس. ويسمح هذا النهج بالتلاعب بالأحداث المسببة للإصابة بالخلايا والأعضاء على حد سواء بطريقة متحكم فيها زمنياً.
Abstract
سرطان الثدي هو مرض غير متجانس، ربما بسبب التفاعلات المعقدة بين خلايا مختلفة من الأصول والأحداث الأورام. نماذج الماوس مفيدة في الحصول على رؤى في هذه العمليات المعقدة. على الرغم من أن العديد من نماذج الماوس قد وضعت لدراسة مساهمات مختلف الأحداث الأورام وخلايا المنشأ لورم الثدي، وهذه النماذج في كثير من الأحيان ليست من نوع الخلية أو عضو محدد أو لا يمكن أن تحفز على بدء التناسل الورم يُمْمَرَك في طريقة تسيطر عليها زمنيا. هنا نقوم بوصف بروتوكول لتوليد نوع جديد من نماذج الماوس سرطان الثدي على أساس الحقن داخل القناة من Cre-التعبير عن الفيروس الغدي (Ad-Cre) في الغدد الثديية الماوس (MGs). بسبب الحقن المباشر من Ad-Cre في القنوات الثديية، وهذا النهج هو MG محددة، دون أي تحريض السرطان غير المرغوب فيها في الأجهزة الأخرى. يمكن إجراء إجراء الحقن داخل القناة في الفئران في مراحل مختلفة من تطور MG (وبالتالي، فإنه يسمح السيطرة الزمنية للتحريض على السرطان، بدءا من ~ 3-4 أسابيع من العمر). يمكن تحقيق خصوصية من نوع الخلية باستخدام مروجين مختلفين من نوع الخلية لدفع تعبير Cre في متجه الأيدينوفيروسي. نُظهر أن الخلايا الظهارية الثديية اللامنية والقاعية (MECs) يمكن استهدافها بإحكام للتلاعب الوراثي القائم على الكِي/اللوكسبي عن طريق حقن داخل القناة من Ad-Cre تحت سيطرة مروج الكيراتين 8 أو كيراتين 5، على التوالي. من خلال دمج مراسل Cre مشروط (على سبيل المثال، Cre/loxP-inducible Rosa26-YFP مراسل)، نبين أن MECs المستهدفة من قبل Ad-Cre، والخلايا السرطانية المشتقة منها، يمكن تتبعها باتباع الخلايا الإيجابية للمراسل بعد الحقن داخل القنوات.
Introduction
الهدف العام لهذه الطريقة هو تطوير نهج جديد لنمذجة سرطان الثدي على أساس حقن داخل القناة من Ad-Cre في MG الماوس. وقد استخدم النهج الوراثي القائم على إعادة التركيب/اللوكسبي على نطاق واسع لنمذجة سرطان الثدي البشري في الفئران. يتم إنشاء الجيل الأول من نماذج الماوس سرطان الثدي القائم على Cre/loxP باستخدام الفئران المعدلة وراثيا ً التي تعبر عن Cre تحت سيطرة المروجين الخاصين بـ MEC (على سبيل المثال، MMTV-Cre لـ MECs الإنارة وجزء من الـ MECs القاعدية وWap-Cre و Blg-Cre للذرية الإنارة وMECs القطيفة، K14-Cre للبازلا وجزء من MECs الإنارة1،2،3،4،5)6، 7 , 8 , 9- ومع ذلك، ففي حين أن هذه الخطوط المعدلة وراثيا التي تعمل في مجال الكر تمكن من التحكم المكاني في التعبير عن الكري (أي في مجموعات فرعية مختلفة من الشركات الصغيرة والمتوسطة)، فإنها لا تسمح بالتحكم الزمني في التعبير عن الكري والتلاعب الجيني بوساطة من الكري/لوكسب. الجيل الثاني من نماذج الماوس سرطان الثدي القائم على Cre/loxP استخدام نهج النشاط/التعبير Cre اللاإمتزاج (على سبيل المثال، استخدام مستقبلات Cre-Estrogen الانصهار [CreER]، والتي يمكن أن تحفز فقط Cre / loxP إعادة تركيب عند إعطاء تاموكسيفين)، و ونتيجة لذلك، تسمح هذه الأدوات الوراثية بكل من الضوابط المكانية والزمنية لتنشيط الأحداث المسببة للسرطان في البلدان المتوسطة الدخل (مثل K8-CreER- وK5-CreERالنماذج القائمة)10و11و12 . في كلا الجيلين من نماذج الماوس سرطان الثدي، كما المروجين تستخدم لدفع التعبير كري أو كرير (على سبيل المثال، Krt8، Krt5)قد تكون نشطة أيضا في الخلايا الظهارية من الأجهزة الأخرى (أي أنها من نوع الخلية ولكن ليس محددة للأعضاء) أو يكون التعبير راشح في أنواع الخلايا غير الخلايا الظهارية (على سبيل المثال، MMTV، التي لديها نشاط راشح في خلايا المكونة للدم نخاع العظام)، وهذه النهج قد يؤدي إلى تطوير السرطان غير المرغوب فيه (ق) في جهاز (أعضاء) أخرى). إذا كانت هذه السرطانات غير المتوقعة تسبب فتكاً في الفئران المصابة، فقد يكون الغرض الأصلي من نمذجة سرطان الثدي في هذه الفئران محظوراً (على سبيل المثال، قد تؤدي الأحداث الأنكسينية التي يقودها MMTV-Creإلى الأورام الخبيثة المكونة للدم والوفاة المبكرة للفئران ، بسبب تسرب المروج MMTV في خلايا المكونة للدم)4.
هنا نبلغ عن نهج نمذجة سرطان الثدي في الفئران التي تسمح على حد سواء من نوع الخلية والجهاز التلاعب محددة من الأحداث oncogenic بطريقة تسيطر عليها زمنيا. ويستند هذا النهج على حقن داخل القنوات من Ad-Cre في MGs الماوس (وبالتالي، هو عضو محدد). يمكن التحكم في التعبير الكري باستخدام مروجين مختلفين خاصين بالسكان من نوع MEC مُدمجين في ناقل الأندينوفيروسي (على سبيل المثال، Krt8 للبلدان المتوسطة الدخل الإنارة، Krt5 لـ MECs القاعدية، وبالتالي تحقيق خصوصية من نوع الخلية). يمكن التحكم في الحث على السرطان في MGs زمنيا عن طريق حقن Ad-Cre في الفئران في أعمار مختلفة، بدءا من 3-4 أسابيع من العمر (البلوغ) إلى مرحلة الكبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لمستشفى بريغام ومستشفى النساء على جميع الأساليب الموصوفة هنا.
1. توليد وصيانة الفئران المفلفة
- الحصول على الضربة القاضية المشروطة ذات الصلة بسرطان الثدي (على سبيل المثال، Trp53tm1Brn [يشار إليها باسم Trp53L/L]، Brca1tm1Aash [Brca1L/L])أو خطوط الماوس المشروطة التي تدق في (على سبيل المثال، Gt(ROSA) 26Sortm1 (Pik3ca * H1047R) Egan) من مختبر جاكسون (JAX) أو نماذج الماوس NCI من اتحاد السرطان البشري (MMHCC) مستودع. وبالإضافة إلى ذلك، ولتسهيل مطاردة الشركات المتوسطة الدخل التي تخضع لإعادة التركيب بوساطة من الكري، يمكن أيضا الحصول على خط مراسل Cre مشروط من JAX (على سبيل المثال، GT(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [يشار إليها باسم R26Y]).
- تولد Trp53L / L الفئران homozygous مع R26Y الفئران مراسل homozygous أو مع الفئران homozygous تحمل alleles مراسل R26Y وأي إضافية floxed بالضربة القاضية المشروطة أو طرق في alleles لمختلف نماذج الماوس، للحصول على الهالة F1 الذكور والإناث ذرية.
- Intercross heterozygous F1 الذكور والإناث الفئران للحصول على F2 الفئران الإناث المركبة التي هي homozygous لكل أليل (كما الفئران التجريبية)، وكذلك R26Y-فقط الإناث المتجانسة (كما الفئران السيطرة). الفئران النمط الجيني F2 استناداً إلى التمهيديات PCR وظروف ركوب الدراجات المذكورة أدناه، عن طريق إعداد اثنين من ردود الفعل القياسية 20 μL PCR (باستخدام طاقة 5X ماستر ميكس) في اثنين من أنابيب PCR مختلفة، واحد مع التمهيديات R26Y والآخر مع Trp53L التمهيديات. استخدام الفئران الكبار (عادة حوالي 2-4 أشهر من العمر) لجميع تربية.
- لR26Y،أداء PCR في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم في 94 درجة مئوية لمدة 30 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لمدة 35 دورات، تليها 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، والحفاظ على 14 درجة مئوية. استخدام التمهيديات (ط) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT؛ '2' R26YFP-2: لجنة التنسيق الإدارية للجنة التنسيق الإدارية '3' R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
ملاحظة: يشير نطاق PCR واحد من 250 نقطة أساس إلى متجانس R26Y، وشريط PCR واحد من 500 نقطة أساس يشير إلى نوع بري (WT)، وشريطين PCR(R26Y:250 bp، WT: 500 bp) يشير إلى heterozygote R26Y (الشكل1A).
لTrp53L، وأداء PCR في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم في 94 درجة مئوية لمدة 30 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لمدة 35 دورات، تليها 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، والحفاظ على 14 درجة مئوية. استخدام التمهيديات (ط) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G؛ '2' p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
ملاحظة: يشير نطاق PCR واحد من 370 نقطة أساس إلى متجانس Trp53L/L، وشريط PCR واحد من 288 نقطة أساس يشير إلى Trp53+/+ WT، وشريطين PCR (WT: 288 bp، Trp53L:370 bp) يشير إلى Trp53L /+ هيتيرازيغوت(الشكل 1B).
- لR26Y،أداء PCR في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم في 94 درجة مئوية لمدة 30 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لمدة 35 دورات، تليها 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، والحفاظ على 14 درجة مئوية. استخدام التمهيديات (ط) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT؛ '2' R26YFP-2: لجنة التنسيق الإدارية للجنة التنسيق الإدارية '3' R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
2. التحضير قبل الجراحة
- الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل يوم واحد من الجراحة.
- إعداد 0.1٪ بروموفينول الأزرق في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) وتخزينها في 4 درجة مئوية. تخفيف Ad-Cre التي سيتم استخدامها للحقن داخل القناة في DMEM المتوسطة مع 0.01 M CaCl2 وبروموفينول الأزرق بنسبة 1:10 (أي خليط الحقن).
ملاحظة: تم الحصول على Ad-Cre المستخدمة هنا من جامعة آيوا الفيروسية ناقلات الأساسية, مع titer الفيروسية الأسهم من ~ 1010-1011 pfu/mL. - تخدير الفأرة الأنثوية (جيل F2 كما هو موضح في الخطوة 1.2، العمر تتراوح بين 3-4 أسابيع من العمر إلى الكبار) باستخدام غرفة isoflurane وتطبيق مرهم العين. خلال الإجراء، يُدّس الفأر باستمرار من خلال ضمان استنشاقه 1%-2.5% من الإيسوفيلوران في الأكسجين. تحقق من عمق التخدير كل 15 دقيقة على الأقل عن طريق إجراء قرصة اصبع القدم. مراقبة بعناية الماوس لأي تغيير في معدل الجهاز التنفسي، وضبط مستوى isoflurane وفقا لذلك، إذا لزم الأمر.
- حقن ميلوكسيكام كما التسكين تحت الجلد بجرعة 5 ملغ / كغ، قبل العملية الجراحية.
- فضح موقع الحلمة الجراحية عن طريق تطبيق عدة قطرات من كريم إزالة الشعر. إزالة كريم المفرط والشعر فضفاضة باستخدام المناشف الورقية الناعمة.
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في منطقة منفصلة عن المكان الذي سيتم إجراء الجراحة. لا ينصح الحلاقة من أجل تجنب الأضرار التي لحقت الحلمات. توخي الحذر لإزالة عامل إزالة الشعر الكيميائي في الوقت المناسب. ترك العامل على لفترة طويلة جدا قد يؤدي إلى حرق الكيميائية على الجلد - تطهير الموقع الجراحي مع يودوفور أولا، تليها الكحول 70٪، وتنتهي مع التطبيق النهائي من اليود فرك. القيام بذلك في حركة دائرية من وسط منطقة العمل نحو محيط باستخدام اسفنجة الشاش أو القطن يميل قضيب. كرر دورة 3x-4x.
3. حقن داخل القناة
- استخدام تقنيات العقيم في جميع أنحاء العملية الجراحية.
- جعل موقع شق على الجلد على طول ~ 1 سم بين اثنينمن MGs الأربية الرابعة (الشكل 2). افصل رفرف الجلد بعناية (مع MG) عن العبية الجدارية وذلك لتصور شجرة القناة الثديية.
- عقد بعناية الحلمة مع ملقط صانع الساعات وإزالة الحلمة الخارجية دون قطع أي جلد قريب، وذلك باستخدام مقص تشريح الدقيقة.
- قم بتحميل حوالي 3-5 ميكرولتر من خليط حقن Ad-Cre في حقنة هاملتون 25 ميكرولتر مع إبرة محور معدنية 33 G مثبتة. تقدير حجم خليط الحقن في الحقنة على أساس الصبغة الزرقاء المدرجة في الخليط.
ملاحظة: استخدم حجمًا أصغر (على سبيل المثال، 3 ميكرولتر) عند الحقن في الـ MGs من الإناث البالغات من العمر 3-4 أسابيع وكمية أكبر (على سبيل المثال، 10 ميكرولتر) عند الحقن في الـ MGs للإناث المرضعات. - عقد بلطف حافة رفرف الجلد مع ملاقط منحنية غرامة وحقن خليط حقن Ad-Cre ببطء في الحلمة، وفي الوقت نفسه رصد انتشار الصبغة الزرقاء في شجرة القناة الثديية. الحفاظ على معدل الحقن منخفضة قدر الإمكان لتجنب الأضرار التي لحقت التجويف القناة.
ملاحظة: السائل المحقون (كما يتضح من الصبغة الزرقاء بروموفينول المدرجة) تنتشر في جميع أنحاء شجرة القناة بأكملها دون تسرب إلى مقصورة سترومال يشير إلى حقن داخل القناة ناجحة. - سحب الإبرة بلطف من الحلمة لتجنب أي تسرب للسائل المحقون.
- فحص الجانب القاصي (أي بعيدا عن الحلمة) من MG أو المنطقة المحيطة بها من الحلمة عن طريق الحقن. لاحظ أن صبغة زرقاء تورم (أي، صبغ ة تنتشر في ستروما القريبة) يشير إلى حقن وسادة الدهون الثديية بدلا من حقن داخل القناة ناجحة.
- أغلق الجروح الجراحية (من الخطوة 3.2) في الجلد مع مقاطع الجرح.
4. الرعاية بعد العملية الجراحية
- إزالة الماوس من التخدير ووضعها على وسادة التدفئة داخل قفص نظيف للانتعاش.
- إدارة ميلوكسيكام تحت الجلد في 5 ملغ / كغ مرة أخرى، 24 ساعة بعد الجراحة.
- مراقبة الظروف العامة للحيواني والبحث عن علامات العدوى في موقع الشق لمدة 5 أيام.
- تتم إزالة مقاطع الجروح ~ 7-10 أيام بعد الجراحة.
5. رصد تطور الورم الثديي
- رصد الفئران حقن مرتين أسبوعيا عن طريق الجس لأي علامة على تطور الورم الثديي.
- بمجرد أن يصبح الورم محسوسًا، قم بمراقبة الماوس يوميًا وقياس حجم الورم حتى يصل إلى نقطة النهاية التجريبية، كما يحددها الحجم (على سبيل المثال، الوصول إلى 10%-15% من وزن جسم الماوس) أو الحالة (مثل القرحة أو النخر) للورم، أو من قبل الحالة الصحية العامة للماوس (على سبيل المثال، غيبوبة، احتضار).
- قتل الفأر عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون، متبوعاً بطريقة ثانوية (مثل خلع عنق الرحم).
- عزل أنسجة الورم الثديي وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي، أو الفلورة المناعية، أو تحديد سمات التعبير (على سبيل المثال، عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي [RNAseq] أو microarray)، كما هو موضح سابقا12.
- إجراء تحليل مقياس التدفق عن طريق التجصيّب للخلايا السالبة النسبية (لين-: سلبي لعلامات النسب CD45 [علامة الكريات البيض]، CD31 [علامة الخلية البطانية]، وTER119 [علامة كريات الدم الحمراء])، وتحليل الخلايا في الورم على أساس ها تعبير YFP و CD24 و CD29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد في الشكل 1نتائج الأنماط الجينية التمثيلية لـ R26Y وTrp53 L.
على الرغم من أن جميع الـ 10 MGs يمكن أن تخضع، من حيث المبدأ، لإجراء الحقن داخل القنوات، عملياً، يتمعادة اختيار اثنين من الـ MGs الأربية الرابعة للحقن، وذلك بسبب سهولة إمكانية الوصول إليها وأحجام أكبر من MG (الشكل 2). خلال الجراحة، من المهم الحفاظ على منطقة عمل مطهرة وغير مرتب ةوإجراء العملية باستخدام أدوات معقمة (الشكل 3). أثناء الحقن داخل القناة، يساعد إدراج صبغة زرقاء (على سبيل المثال، بروموفينول أزرق) في خليط الحقن على تصور حقنAd-Cre بنجاح في شجرة القناة بأكملها (الشكل 4). أصغر الفئران الإناث التي حقن داخل القنوات (مع حجم أصغر من خليط الحقن) يمكن أن يؤديها بنجاح هي تلك التي في ~ 3 أسابيع من العمر (الشكل4A)،على الرغم من أن لمعظم التجارب التعريفي الورم الثديي، والفئران الإناث البالغة الشابة (على سبيل المثال، شهرين من العمر) تستخدم عادة (الشكل4B). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن يتم الحقن داخل القناة (مع حجم أكبر من خليط الحقن) في الفئران الإناث خلال مرحلة مبكرة / منتصف الحمل لاستهداف الخلايا السنخية (الشكل4C).
في تجربتنا، في الفئران مع مراسل R26Y وTrp53L / L (مع أو بدون أي آليل مشروطة إضافية)، واضطراب إعادة تركيبة Cre بوساطة الأليلات خروج المغلوب الشرطي Trp53 (وأي إضافية الأليليس بالضربة القاضية المشروطة، إذا ما استخدمت) وفي الوقت نفسه، تحولت على مراسل YFP (من allele R26Y، وكذلك من أي إضافية مشروطة ضرب في آليل، إذا ما استخدمت). لاستهداف مجموعات فرعية مختلفة من MEC للتحريض على الورم الثديي، تم استخدام فيروسات Ad-Cre تحتسيطرة مختلف المروجين الخاصين بمجموعة أقسام النك (الشكل 5). على سبيل المثال، تم استخدام Ad-Cre تحت سيطرة كيراتين 8(Krt8)المروج(Ad-K8-Cre)لاستهداف MECs الإنارة. في السابق، أبلغنا عن استخدام Ad-Cre تحت سيطرة كيراتين 14(Krt14)المروج(Ad-K14-Cre)لاستهداف الشركات الصغيرة والمتوسطة القاعدية13. ومع ذلك، كما أبلغنا، حقن داخل القنوات من Ad-K14-Cre ليس فقط تستهدف الشركات الصغيرة والمتوسطة القاعدية ولكن أيضا جزء من MECs الإنارة13. اختبرنا مؤخرا آخر Ad-Cre تحت سيطرة كيراتين 5(Krt5)المروج(Ad-K5-Cre)14 ووجدت أنه يمكن أن تستهدف أكثر إحكاما النسب القاعدية، مما يؤدي إلى وضع علامات وراثية من MECs القاعدية فقط (الشكل5). النسب المئوية النموذجية للشركات متعددة المعدات التي تحمل علامة YFP من حقن Ad-K8-Cre أو Ad-K5-Cre هي حوالي 0.1%-1%.
لTrp53L /L; R26Y الفئران الإناث تحت الخلفية الوراثية FVB، والحقن داخل القنوات من Ad-K8-Cre، الذي يستهدف MECs الإنارة ، أدى إلى تطوير الأورام الثديية بعد عدة أشهر من الحقن (الشكل6A). الفئران ذات الخلفية الوراثية المختلفة (على سبيل المثال، C57/B6) قد تظهر زمن وصول أطول من تطوير الأورام الثديية بعد الحقن. بسبب إدراج مراسل R26Y الشرطي، وعادة ما تم وضع علامة على الخلايا الظهارية الورم من قبل YFP ويمكن الكشف عن طريق قياس التدفق (الشكل6B) ؛ ويمكن إثراؤها عن طريق فرز تدفق YFP+ الخلايا لمزيد من التحليل.
الشكل 1: النتائج الجينية التمثيلية لـ PCR للآليل R26Y وTrp53L. WT = من النوع البري؛ الإنسان = الهوموزجوت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي للحقن داخل القنوات من فيروس Ad-Cre في MG. (أ) موقع شق في خط الوسط بين اثنين من MGs الرابعة. (ب) حقن داخل القناة من Ad-Cre مع صبغة زرقاء (للحصول على تصور أفضل) في واحدة من الـ MGs الرابعة. (C) إغلاق الشق في الجلد بواسطة مقاطع الجرح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نظرة عامة على الإعداد العقيم لجراحة القوارض. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصور حقن داخل القناة ناجحة في الشجرة المائية الثديية بأكملها. (أ) مثال على الحقن داخل القناة من 3 ميكرولتر من خليط الحقن (مع الأزرق بروموفينول) في MG من فأرالإناث 3 أسابيع من العمر. (ب) حقن داخل القناة من 5 ميكرولتر من خليط الحقن في MG من فأرالإناث الكبار الشباب. (ج) حقن داخل القناة من 10 ميكرولتر من خليط الحقن في MG من فأرالإناث في وقت مبكر / منتصف الحمل. (د) مثال على حقن وسادة الدهون الثديية بدلا ً من حقن داخل القناة بنجاح. حقن داخل القناة من 5 ميكرولتر من خليط الحقن في MG من فأرالإناث الكبار الشباب. (أ) منطقة الجلد المحيطة بالحلمة المحقونة؛ (ب) الجانب الآخر من رفرف الجلد الذي يظهر وسادة الدهون الثديية؛ دائرة صفراء يشير صبغ منتشرة في وسادة الدهون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: قطع مخططة تمثيلية للتحليل السيمتري للخلايا التي تحمل علامة YFP عند الحقن داخل القناة. YFP+ السكان من MGs من الإناث العذراء R26Y 3 أيام بعد حقن داخل القناة من Ad-K8-Cre (اليسار، حقن في titer من 7 × 109 pfu/mL) أو Ad-K5-Cre (يمين، حقن في titer من 7.86 × 109 pfu/ mL) الفيروسات. وتستند المؤامرات على تحليل CD24 وCD29 تلطيخ في النسب السلبية (لين-أي سلبية لCD45، CD31، وTER119 التعبير) YFP+ الخلايا. لو = لين-CD24 CD24عاليةCD29منخفضة بوابة MEC الإنارة; [با] = [لين]-[كد24]منخفضة[كد29]عال [بسل] [مك] بوابة; وتستند استراتيجية التجشّز للبلدان المتوسطة الدخل والقاعدية على شاكلتون وآخرون15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تطور الورم في Trp53L/L; R26Y الإناث الفئران حقن داخل القناة مع Ad-K8-Cre. (أ) فأر ممثل واحد يظهر نمو الورم (الأسهم) بعد عدة أشهر من الحقن مع Ad-K8-Cre. (ب) حوالي 8.8٪ من الخلايا الحية (على أساس تلطيخ DAPI) من ورم تمثيلي كانت إيجابية للتعبير YFP، استنادا إلى تحليل تدفق قياس الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نجاح هذا النهج لتحفيز الأورام الثديية من التجمعات السكانية المختلفة من MECs يعتمد ليس فقط على اختيار المروجين مناسبة من نوع الخلية (لدفع التعبير كري) ولكن أيضا على إجراء الحقن داخل القناة نفسها. والفكرة الكامنة وراء هذا النهج هي أن فيروسات Ad-Cre المحقونة يتم الاحتفاظ بها في شجرة القنوات، وهي بنية مخفية مع التجويف، وبالتالي، فإن الشركات المتوسطة الدخل فقط تتعرض للفيروسات وتصاب بالعدوى من قبل Ad-Cre. بسبب مساحة التجويف المحدودة داخل القنوات الثديية، من المهم فقط حقن كمية صغيرة من خليط الحقن إلى كل MG (أي، ~ 3-5 ميكرولتر). كما ينبغي تعديل حجم الحقن على أساس عمر الفئران (أي، ينبغي استخدام حجم أصغر عندما يتم حقنه في الفئران التي تتراوح أعمارهم بين 3 و4 أسابيع). عندما يكون حجم السائل المحقون مفرطاً بسبب الضغط الناجم عن الحقن ومساحة التجويف القنواتي المحدودة، قد يتم "دفع" السائل من خلال الطبقات الظهارية إلى ستروما، مما يؤدي إلى عدوى فيروسية غير مرغوب فيها في الخلايا السترومالية.
وبما أن خصوصية نوع الخلية يحققها المروج المستخدم في ناقل الأندينوفيروسي لدفع تعبير كري، فإن الحد من هذا النهج هو احتمال عدم وجود مروج مناسب لاستهداف تعبير Cre إلى مجموعة فرعية محددة من التجمعات السكانية في الشرق الأوسط. أبلغنا سابقا عن استخدام عموم الإنارة Ad-K8-Cre فيروس لاستهداف MECs الإنارة12،13 واستخدام فيروس Ad-Wap-Cre لاستهداف الذرية النفيلية5. في هذه الدراسة، أظهرنا استخدام فيروس Ad-K5-Cre لاستهدافالشركات المتوسطة والإلكترونية القاعدية (الشكل 5). ما زلنا نفتقر إلى القدرة على استخدام هذا النهج لاستهداف التجمعات السكانية المنخفضة MEC الإيجابية لمستقبلات الإستروجين. يمكن أن يستوعب ناقل الأينيوفيروسي الذي استخدمناه هنا إدراج ًا يصل إلى 8 كيلوبايت. وبالتالي، لتطوير MEC مجموعة فرعية محددة Ad-Cre، يمكن للمروّج المستخدم لدفع التعبير Cre أن يكون أقل من 7 كيلوبايت فقط. عمليا، جزء المروج كبيرة، حتى لو كان أقل من 7 كيلو بايت في الحجم، قد يكون من الصعب استنساخ subclone. من أجل احتواء ناقلات الأيدنوفية، على الرغم من أن المروج المقتطعة قد تستخدم، فإنه قد لا يلخص بأمانة نمط التعبير من جينها المقابلة عندما تكون تحت سيطرة المروج المحلي الكامل.
المراسل الشرطي R26Y المدرجة في نموذج الماوس هنا وفرت وسيلة لوضع علامة على خلايا المنشأ وتتبع تطورها إلى الخلايا السرطانية. وتجدر الإشارة إلى أن النسبة المئوية للخلايا السرطانية التي تحمل علامة YFP في الورم الناتج تبدو منخفضة إلى حد ما (الشكل6B). هذا استطاع كنت واجبة إلى إمكانية أنّ, [إين دّيأيشن تو] ال [يفب]-يعلم ورم خلايا ظهاريّة, تضمّن الورم أيضا كثير [إيمّون سلّ] و [سترومل] خلايا, أيّ شكّل الجزء كبيرة من الورم كتلة.
بالمقارنة مع نماذج الماوس الأخرى من سرطان الثدي، وهذا النهج يؤدي إلى بدء الورم الثديي من عدد صغير من MECs فقط (على سبيل المثال، MECs الإنارة عند حقن Ad-K8-Cre)، في كثير من الأحيان على مستوى clonal12. كما أن بدء الأورام البشرية من المرجح أن يكون clonal، وهذا النهج يلخص هذا الجانب من تطور السرطان البشري أكثر إخلاصا. وبالإضافة إلى ذلك، حتى عندما يتم تعطيل p53 في عدد قليل فقط من MECs، وفقدان p53 يؤدي إلى توسعها clonal، مما يؤدي إلى إنتاج مجموعة أكبر من MECs المتحولة؛ وهذا من شأنه أن يسمح بمزيد من التطور الكلوني من البلدان المتوسطة الدخل التي تعاني من نقص في المجالات الـ 53 (عند اكتساب طفرات جسدية إضافية)12. كما TP53 هو الجين الأكثر شيوعا في سرطان الثدي البشري16 وكما الطفرة TP53 هو حدث في وقت مبكر في تكوين أورام الثدي البشري17،18، من خلال الجمع بين نموذج الماوس Trp53 floxed مع الماوس نماذج لأحداث أخرى oncogenic، يمكننا دراسة كيفية هذه الأحداث oncogenic التعاون مع فقدان P53 وكيف أنها تسهم معا في تطوير الورم الثديي من أصل خلوي محدد. وبالإضافة إلى ذلك، وبما أن هناك حاجة إلى تربية أقل لوضع الأليلات المتعددة معا، فإن هذا النهج من شأنه أن يقلل من تكلفة التكاثر والوقت، مما من شأنه أن يسهل دراسات نمذجة سرطان الثدي على نطاق أوسع، في فترة أقصر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة R01 CA222560 ووزارة الدفاع جائزة اختراق W81XWH-18-1-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
