Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen neuen Ansatz zur Modellierung von Brustkrebs zu beschreiben, der auf der intraduktiven Injektion von Cre-expressing adenovirus in Maus-Mammary-Drüsen basiert. Dieser Ansatz ermöglicht sowohl eine zelltyp- als auch organspezifische Manipulation onkogener Ereignisse in zeitlich kontrollierter Weise.
Abstract
Brustkrebs ist eine heterogene Krankheit, möglicherweise aufgrund komplexer Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Ursprungszellen und onkogenen Ereignissen. Mausmodelle sind entscheidend, um Einblicke in diese komplexen Prozesse zu gewinnen. Obwohl viele Mausmodelle entwickelt wurden, um Beiträge verschiedener onkogener Ereignisse und Ursprungszellen zur Brusttumorigenese zu untersuchen, sind diese Modelle oft nicht zelltyp- oder organspezifisch oder können die Initiation einer Brusttumorigenese in einem zeitlich gesteuerte Art und Weise. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung einer neuen Art von Brustkrebsmausmodellen, die auf der intraduktiven Injektion des Cre-expressing adenovirus (Ad-Cre) in Maus-Mammary Drüsen (MGs) basieren. Durch die direkte Injektion von Ad-Cre in Brustkanäle ist dieser Ansatz MG-spezifisch, ohne unerwünschte Krebsinduktion in anderen Organen. Das intrauktale Injektionsverfahren kann bei Mäusen in verschiedenen Stadien ihrer MG-Entwicklung durchgeführt werden (daher ermöglicht es eine zeitliche Kontrolle der Krebsinduktion, beginnend mit einem Alter von 3-4 Wochen). Die Zelltyp-Spezifität kann erreicht werden, indem verschiedene zelltypspezifische Promotoren verwendet werden, um die Cre-Expression im adenoviralen Vektor zu fördern. Wir zeigen, dass luminale und basale Brustepithelzellen (MECs) durch eine intraduktive Injektion von Ad-Cre unter der Kontrolle des Keratin 8 bzw. Keratin 5-Promotors gezielt für die Cre/loxP-basierte genetische Manipulation eingesetzt werden können. Durch die Einbeziehung eines bedingten Cre-Reporters (z.B. Cre/loxP-inducible Rosa26-YFP-Reporter) zeigen wir, dass MECs, die von Ad-Cre ins Visier genommen werden, und von ihnen abgeleitete Tumorzellen nach der intraduktiven Injektion den Reporter-positiven Zellen folgen.
Introduction
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Modellierung von Brustkrebs auf der Grundlage einer intraduktiven Injektion von Ad-Cre in die Maus MG. Der Cre/loxP-Rekombinationsansatz wurde häufig verwendet, um menschlichen Brustkrebs bei Mäusen zu modellieren. Die erste Generation von Cre/loxP-basierten Brustkrebsmausmodellen wird durch verwendung von cre-exzessienten transgenen Mäusen unter der Kontrolle von MEC-spezifischen Promotoren (z. B. MMTV-Cre für luminale MECs und einen Teil der basalen MECs, Wap-Cre und Blg-Cre für luminale Vorläufer und alveolare Leuchtdichte MECs, K14-Cre für Basal und einen Teil der luminalen MECs1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. Während diese transgenen Cre-Linien zwar die räumliche Kontrolle des Cre-Expressions (d. h. in verschiedenen Teilmengen von MECs) ermöglichen, erlauben sie jedoch keine zeitliche Kontrolle der Cre-Expression und der Cre/loxP-vermittelten genetischen Manipulation. Die zweite Generation von Cre/loxP-basierten Brustkrebs-Mausmodellen nutzt induzierbare Cre-Aktivitäts-/Expressionsansätze (z. B. Verwendung von Cre-Östrogen-Rezeptor-Fusion [CreER], die nur eine Cre/LoxP-Rekombination bei Verabreichung von Tamoxifen induzieren kann), und Daher ermöglichen diese genetischen Werkzeuge sowohl räumliche als auch zeitliche Kontrollen der Aktivierung onkogener Ereignisse in MECs (z. B. K8-CreER-und K5-CreER-basierteModelle)10,11,12 . In beiden Generationen von Brustkrebsmausmodellen können als Promotoren, die zur Antrieb von Cre- oder CreER-Expression (z. B. Krt8, Krt5) verwendet werden, auch in Epithelzellen anderer Organe aktiv sein (d. h. sie sind zelltypspezifisch, aber nicht organspezifisch) oder haben eine undichte Expression in anderen Zelltypen als Epithelzellen (z. B. MMTV, die undichte Aktivität in hämatopoetischen Knochenmarkzellen hat), können diese Ansätze zur Entwicklung unerwünschter Krebserkrankungen in anderen Organen führen. Wenn diese unerwarteten Krebsarten bei den betroffenen Mäusen eine Letalität verursachen, kann der ursprüngliche Zweck der Modellierung von Brustkrebs bei diesen Mäusen verboten sein (z. B. MMTV-Cre-getriebeneonkogene Ereignisse können zu hämatopoetischen Malignitäten und einem frühen Tod der Mäuse führen. , aufgrund der Leckage des MMTV-Promotors in hämatopoetischen Zellen)4.
Hier berichten wir über einen Ansatz zur Brustkrebsmodellierung bei Mäusen, der sowohl zelltyp- als auch organspezifische Manipulationen onkogener Ereignisse in zeitlich kontrollierter Weise ermöglicht. Dieser Ansatz basiert auf einer intraduktiven Injektion von Ad-Cre in Maus-MGs (und ist somit organspezifisch). Die Cre-Expression kann durch die Verwendung verschiedener MEC-Subpopulations-spezifischer Promotoren gesteuert werden, die in den adenoviralen Vektor eingebettet sind (z. B. Krt8 für luminale MECs, Krt5 für Basal-MECs, wodurch eine zelltypische Spezifität erreicht wird). Die Krebsinduktion in MGs kann zeitlich durch eine Injektion von Ad-Cre in Mäuse in verschiedenen Altersstufen kontrolliert werden, beginnend mit 3-4 Wochen (Pubertät) bis zum Erwachsenenstadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Brigham and Women es Hospital genehmigt.
1. Erzeugung und Wartung von Floxed-Mäusen
- Erhalten Sie brustkrebsrelevante bedingte Knockouts (z. B. Trp53tm1Brn [trp53L/L], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) oder bedingte Einsteckmauslinien (z. B. Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)Egan) aus dem Jackson Laboratory (JAX) oder NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium (MMHCC). Um die Verfolgung von MECs zu erleichtern, die einer cre-vermittelten Rekombination unterzogen werden, kann auch eine bedingte Cre-Reporter-Leitung von JAX bezogen werden (z. B. Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [bezeichnet als R26Y]).
- Züchte Trp53L/L homozygote Mäuse mit R26Y homozygoten Reportermäusen oder mit homozygoten Mäusen, die die R26Y Reporterallele und alle zusätzlichen floxierten bedingten Knockout- oder Knock-in-Allele für verschiedene Mausmodelle, um heterozygote männliche und weibliche Nachkommen der F1 zu erhalten.
- Intercross heterozygote F1 männliche und weibliche Mäuse, um F2-Verbindung weibliche Mäuse zu erhalten, die homozygot für jedes Allel sind (als experimentelle Mäuse), sowie R26Y-nur homozygote Weibchen (als Kontrollmäuse). Genotyp F2-Mäuse auf Basis der unten aufgeführten PCR-Primer und Zyklusbedingungen, indem zwei Standard-PCR-Reaktionen von 20 l (mit Taq 5X Master Mix) in zwei verschiedenen PCR-Röhren, eine mit den R26Y-Primern und die andere mit dem Trp53L Primer. Verwenden Sie erwachsene Mäuse (in der Regel etwa 2–4 Monate alt) für alle Zucht.
- Für R26YpcR bei 94 °C für 3 min, dann bei 94 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 1 min für 35 Zyklen, gefolgt von 72 °C für 3 min und Aufrechterhaltung bei 14 °C. Primer (i) R26YFP-1 verwenden: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
HINWEIS: Ein einzelnes PCR-Band von 250 bp zeigt eine R26Y-Homozygote an, ein einzelnes PCR-Band von 500 bp einen Wildtyp (WT) und zwei PCR-Bänder (R26Y: 250 bp, WT: 500 bp) auf eine R26Y-Heterozygote (Abbildung 1A).
Für Trp53LpcR bei 94 °C für 3 min, dann bei 94 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 1 min für 35 Zyklen, gefolgt von 72 °C für 3 min und Aufrechterhaltung bei 14 °C. Primer (i) p53F2-10 1F verwenden: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) s53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
HINWEIS: Ein einzelnes PCR-Band von 370 bp zeigt ein Trp53 L/L-Homozygote an, ein einzelnes PCR-Band von 288 bp zeigt ein Trp53+/+ WT an, und zwei PCR-Bänder (WT: 288 bp, Trp53L: 370 bp) weisen auf ein Trp53L hin. /+ heterozygote (Abbildung 1B).
- Für R26YpcR bei 94 °C für 3 min, dann bei 94 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 1 min für 35 Zyklen, gefolgt von 72 °C für 3 min und Aufrechterhaltung bei 14 °C. Primer (i) R26YFP-1 verwenden: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
2. Präoperative Zubereitung
- Autoklavalle chirurgische Werkzeuge 1 Tag vor der Operation.
- 0,1% Bromphenolblau in phosphatgepufferter Salin (PBS) vorbereiten und bei 4 °C lagern. Verdünnen Sie den Ad-Cre, der für die intrauktale Injektion in DMEM-Medium mit 0,01 M CaCl2 und Bromphenolblau im Verhältnis 1:10 (d. h. der Injektionsmischung) verwendet wird.
HINWEIS: Der hier verwendete Ad-Cre wurde von der University of Iowa Viral Vector Core mit einem viralen Titer von 1010–1011 pfu/mL gewonnen. - Anästhetisieren Sie die weibliche Maus (F2-Generation wie in Schritt 1.2 beschrieben, Alter im Alter von 3–4 Wochen bis zum Erwachsenen) mit einer Isofluran-Kammer und wenden Sie Augensalbe. Während des Eingriffs befeuchten Sie die Maus kontinuierlich, indem Sie sicherstellen, dass sie 1%–2,5% Isofluran in Sauerstoff einatmet. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie mindestens alle 15 min, indem Sie eine Zehenklemme durchführen. Überwachen Sie die Maus sorgfältig auf jede Änderung der Atemfrequenz und passen Sie bei Bedarf den Isoflurangehalt entsprechend an.
- Injizieren Sie Meloxicam als Analgesie subkutan in einer Dosis von 5 mg/kg, vor dem chirurgischen Eingriff.
- Setzen Sie die Brustwarze chirurgische Nipsel durch die Anwendung mehrerer Tropfen Haarentfernung Creme; entfernen Sie übermäßige Creme und lockeres Haar mit weichen Papiertüchern.
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in einem Bereich durch, der von dem Ort, an dem die Operation durchgeführt werden soll, getrennt ist. Rasieren wird nicht empfohlen, um Schäden an den Brustwarzen zu vermeiden. Seien Sie vorsichtig, um chemische Enthaarungsmittel rechtzeitig zu entfernen. Das Mittel zu lange eingeschaltet zu lassen, kann zu einer chemischen Verbrennung der Haut führen - Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle zuerst mit Iodophoren, gefolgt von 70% Alkohol, und enden sie mit einer endgültigen Anwendung von Peeling-Iodophoren. Tun Sie dies in einer kreisförmigen Bewegung von der Mitte des Arbeitsbereichs in Richtung Peripherie mit einem Gazeschwamm oder Baumwoll-Applikator. Wiederholen Sie den Zyklus 3x–4x.
3. Intraduktive Injektion
- Verwenden Sie aseptische Techniken während des gesamten chirurgischen Eingriffs.
- Machen Sie eine Einschnittstelle auf der Haut mit einer Länge von 1 cm zwischen den beiden vierten Leisten-MGs (Abbildung 2). Trennen Sie die Hautklappe (mit dem MG) vorsichtig vom parietalen Peritoneum, um den brustduktalen Baum zu visualisieren.
- Halten Sie die Brustwarze vorsichtig mit der Zange des Uhrmachers fest und entfernen Sie die Außennippel, ohne die hautnahe Haut mit einer Mikro-Sektionsschere zu schneiden.
- Mit einer 33 G-Metallnabennadel in eine 25-L-Hamilton-Spritze mit 33 G-Metallnabennadel. Schätzen Sie das Volumen der Injektionsmischung in der Spritze auf der Grundlage des in der Mischung enthaltenen blauen Farbstoffs.
ANMERKUNG: Verwenden Sie bei der Injektion in MGs von 3–4 Wochen alten Weibchen ein kleineres Volumen (z. B. 3 l) und ein größeres Volumen (z. B. 10 l), wenn Sie mGs von laktierenden Weibchen injizieren. - Halten Sie vorsichtig den Rand der Hautklappe mit einer feinen gekrümmten Pinzette und injizieren Sie die Ad-Cre Injektionsmischung langsam in die Brustwarze, während sie die Ausbreitung von blauem Farbstoff in den Brustduktalbaum überwacht. Halten Sie die Injektionsrate so niedrig wie möglich, um Schäden am duktalen Lumen zu vermeiden.
HINWEIS: Injizierte Flüssigkeit (wie durch den mitgelieferten Bromphenolblaufarbstoff veranschaulicht), die sich über den gesamten duktalen Baum ausbreitet, ohne in das Stromfach zu gelangen, deutet auf eine erfolgreiche intrauktale Injektion hin. - Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus der Brustwarze, um ein Auslaufen der injizierten Flüssigkeit zu vermeiden.
- Untersuchen Sie die distale Seite (d. h. weg von der Brustwarze) des MG oder die Umgebung der injizierten Brustwarze. Beachten Sie, dass anschwellender blauer Farbstoff (d. h. Farbstoff, der in das nahe gelegene Stroma diffundiert) eher auf eine Brustfettpad-Injektion als auf eine erfolgreiche intrauktale Injektion hinweist.
- Schließen Sie die chirurgischen Wunden (ab Schritt 3.2) in der Haut mit Wundclips.
4. Postoperative Pflege
- Entfernen Sie die Maus von der Anästhesie und legen Sie sie auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig für die Erholung.
- Meloxicam subkutan bei 5 mg/kg wieder verabreichen, 24 h nach der Operation.
- Überwachen Sie die allgemeinen Bedingungen des Tieres und suchen Sie 5 Tage lang nach Anzeichen einer Infektion an der Einschnittstelle.
- Wundclips werden 7-10 Tage nach der Operation entfernt.
5. Überwachung der Entwicklung des Brusttumors
- Überwachen Sie die injizierten Mäuse zweimal wöchentlich durch Palpation auf Anzeichen einer Entwicklung des Brusttumors.
- Sobald der Tumor greifbar ist, überwachen Sie die Maus täglich und messen Sie die Tumorgröße, bis sie den experimentellen Endpunkt erreicht, wie durch die Größe (z. B. erreichen 10%–15% des Körpergewichts der Maus) oder Zustand (z. B. ulzeriert oder nekrotisch) des Tumors, oder durch die allgemeinzustand der Maus (z. B. Komatus, Moribund).
- Euthanisieren Sie die Maus durch Kohlendioxid-Erstickung, gefolgt von einer sekundären Methode (z. B. Zervixdislokation).
- Isolieren Sie die Brusttumorgewebe und analysieren Sie sie durch Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenz oder Expressionsprofilierung (z. B. durch RNA-Sequenzierung [RNAseq] oder Mikroarray), wie zuvor beschrieben12.
- Führen Sie eine zytometrische Flussanalyse durch Gating für Liniennegative Zellen (Lin-: negativ für Lineage-Marker CD45 [Leukozytenmarker], CD31 [endotheliale Zellmarker] und TER119 [Erythrozytenmarker]) durch und analysieren Sie die Zellen im Tumor anhand ihrer Expression von YFP, CD24 und CD29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repräsentative PCR-Genotypisierungsergebnisse für die R26Y- und Trp53 L-Allele sind in Abbildung 1dargestellt.
Obwohl grundsätzlich alle 10 MGs dem intraduktiven Injektionsverfahren unterzogen werden können, werden praktisch die beiden vierten Leisten-MGs aufgrund ihrer leichterenZugänglichkeit und größerer MG-Größen (Abbildung 2) zur Injektion ausgewählt. Während der Operation ist es wichtig, einen desinfizierten und übersichtlichen Arbeitsbereich zu erhalten und den Eingriff mit sterilen Werkzeugen durchzuführen (Abbildung 3). Während der intraduktiven Injektion hilft die Aufnahme eines blauen Farbstoffs (z.B. Bromphenolblau) in das Injektionsgemisch bei der Visualisierung einer erfolgreichen Injektion von Ad-Cre in den gesamten duktalen Baum (Abbildung 4). Die jüngsten weiblichen Mäuse, bei denen die intrauktale Injektion (mit einem kleineren Volumen der Injektionsmischung) erfolgreich durchgeführt werden kann, sind diejenigen im Alter von 3 Wochen (Abbildung4A), obwohl für die meisten Mammary Tumor Induktionsexperimente junge erwachsene weibliche Mäuse (z. B. 2 Monate alt) werden in der Regel verwendet (Abbildung 4B). Darüber hinaus kann die intrauktale Injektion (mit einem größeren Volumen des Injektionsgemisches) auch bei weiblichen Mäusen während der frühen/mittleren Trächtigkeit durchgeführt werden, um alveolare Zellen anzugreifen (Abbildung 4C).
Nach unserer Erfahrung störte bei Mäusen mit dem R26Y-Reporter und Trp53L/L (mit oder ohne zusätzliche bedingte Allele) die cre-vermittelte Rekombination die bedingten K.o.-Jes-Alleeln Trp53 (und bedingte K.o.-Allele, falls verwendet) und in der Zwischenzeit den YFP-Reporter (aus dem R26Y-Allel sowie von jedem zusätzlichen bedingten Einschlagsallel, falls verwendet), eingeschaltet. Um verschiedene MEC-Subpopulationen für die Induktion von Brusttumoren ins Visier zu nehmen, wurden Ad-Cre-Viren unter der Kontrolle verschiedener MEC-Submengen-spezifischer Promotoren zur Injektion verwendet (Abbildung 5). Zum Beispiel wurde Ad-Cre unter der Kontrolle von Keratin 8 (Krt8) Promoter (Ad-K8-Cre) verwendet, um luminale MECs anzuvisieren. Zuvor berichteten wir über die Verwendung von Ad-Cre unter der Kontrolle des Keratin 14 (Krt14) Promoters (Ad-K14-Cre), um basale MECs13anzuvisieren. Wie berichtet, zielte die intrauktale Injektion von Ad-K14-Cre jedoch nicht nur auf basale MECs ab, sondern auch auf einen Teil der luminalen MECs13. Wir haben vor kurzem einen anderen Ad-Cre unter der Kontrolle von Keratin 5 (Krt5) Promoter getestet (Ad-K5-Cre)14 und festgestellt, dass es die Basallinie enger ansprechen kann, was zu einer genetischen Markierung von nur basalen MECs führt (Abbildung 5). Die typischen Prozentsätze von YFP-markierten MECs aus Ad-K8-Cre- oder Ad-K5-Cre-Injektionen liegen bei 0,1%-1%.
Für Trp53L/L; R26Y weibliche Mäuse unter dem genetischen Hintergrund der FVB, die intraduktive Injektion von Ad-K8-Cre, die auf ihre luminalen MECs abzielt, führte einige Monate nach der Injektion zur Entwicklung von Brusttumoren (Abbildung 6A). Mäuse mit einem anderen genetischen Hintergrund (z. B. C57/B6) können eine längere Latenz der Entwicklung von Brusttumoren nach der Injektion aufweisen. Aufgrund der Einbeziehung des bedingten R26Y-Reporters waren Tumorepithelzellen typischerweise durch YFP gekennzeichnet und konnten durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden (Abbildung 6B); sie könnten durch die Durchflusssortierung von YFP+ Zellen zur weiteren Analyse angereichert werden.
Abbildung 1: Repräsentative PCR-Genotypisierungsergebnisse für die R26Y- und Trp53 L-Allele. WT = Wildtyp; Homo = Homozygote. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der intraduktiven Injektion des Ad-Cre-Virus in ein MG. (A) Einschnittstelle in der Mittellinie zwischen den beiden vierten MGs. (B) Intraduktive Injektion von Ad-Cre mit einem blauen Farbstoff (für eine bessere Visualisierung) in eines der vierten MGs. (C) Schließen des Einschnitts in der Haut durch Wundclips. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Übersicht über den aseptischen Aufbau für Die Nagetierchirurgie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Visualisierung einer erfolgreichen intraduktiven Injektion in den gesamten Brustduktalbaum. (A) Ein Beispiel für die intraduktive Injektion von 3 l L Injektionsgemisch (mit Bromphenolblau) in ein MG einer 3 Wochen alten weiblichen Maus. (B) Intraduktale Injektion von 5 l Injektionsmischung in ein MG einer jungen erwachsenen weiblichen Maus. (C) Intraduktale Injektion von 10 l Injektionsgemisch in ein MG einer weiblichen Maus bei der frühen/mittleren Trächtigkeit. (D) Ein Beispiel für eine Brustfettpolsterinjektion anstelle einer erfolgreichen intrauktinalen Injektion. Intrauktale Injektion von 5 l Injektionsmischung in ein MG einer jungen erwachsenen weiblichen Maus. a) die Hautfläche, die die injizierte Brustwarze umgibt; b) die andere Seite der Hautklappe, die das Brustfettpolster zeigt; gelber Kreis zeigt Farbstoff in das Fettpolster diffundiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Darstellungen der zytometrischen Durchflussanalyse von YFP-markierten Zellen bei intraukdärer Injektion. YFP+ Populationen aus MGs von R26Y Jungfrauenweibchen 3 Tage nach einer intrauktiven Injektion von Ad-K8-Cre (links, Injektion bei einem Titer von 7 x 109 pfu/mL) oder Ad-K5-Cre (rechts, Injektion bei einem Titer von 7,86 x 109 pfu/ mL)-Viren. Plots basieren auf einer Analyse der CD24- und CD29-Färbung in Lineage-negativ (Lin-d.h. negativ für CD45-, CD31- und TER119-Expression) YFP+ Zellen. Lu = Lin-CD24highCD29low luminal MEC gate; Ba = Lin-CD24lowCD29high basal MEC Gate; die Gating-Strategie für luminale und basale MECs basiert auf Shackleton et al.15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Tumorentwicklung in Trp53L/L; R26Y weibliche Mäuse intrauktinzipiert mit Ad-K8-Cre. (A) Eine repräsentative Maus zeigt Tumorwachstum (Pfeile) mehrere Monate nach einer Injektion mit Ad-K8-Cre. (B) Etwa 8,8 % der lebenden Zellen (basierend auf DAPI-Färbung) aus einem repräsentativen Tumor waren positiv für die YFP-Expression, basierend auf der zytometrischen Durchflussanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der Erfolg dieses Ansatzes zur Induktion von Brusttumoren aus verschiedenen Subpopulationen von MECs hängt nicht nur von der Wahl geeigneter zelltypspezifischer Promotoren (um die Cre-Expression zu fördern), sondern auch von der intraduktiven Injektion selbst ab. Die Idee hinter diesem Ansatz ist, dass die injizierten Ad-Cre-Viren im duktalen Baum zurückgehalten werden, der eine verborgene Struktur mit Lumen ist, und daher sind nur MECs den Viren ausgesetzt und werden von Ad-Cre infiziert. Aufgrund des begrenzten Lumenraums in den Brustkanälen ist es wichtig, jedem MG nur ein kleines Volumen des Injektionsgemisches zu injizieren (d. h. 3-5 l). Das injizierte Volumen sollte auch auf der Grundlage des Alters der Mäuse angepasst werden (d. h. ein kleineres Volumen sollte verwendet werden, wenn es in 3- bis 4 Wochen alte Mäuse injiziert wird). Wenn das Volumen der injizierten Flüssigkeit aufgrund des Drucks der Injektion und des begrenzten duktalen Lumenraums übermäßig ist, kann Flüssigkeit durch die Epithelschichten in die Stroma "gedrückt" werden, was zu einer unerwünschten Virusinfektion in Stromalzellen führt.
Da die Zelltyp-Spezifität vom Promotor erreicht wird, der im adenoviralen Vektor verwendet wird, um die Cre-Expression zu fördern, ist eine Einschränkung dieses Ansatzes das potenzielle Fehlen eines geeigneten Promotors, um den Cre-Ausdruck auf eine bestimmte MEC-Subpopulation auszurichten. Wir berichteten zuvor über die Verwendung des pan-luminalen Ad-K8-Cre-Virus, um luminale MECs12,13 und die Verwendung des Ad-Wap-Cre-Virus auf alveolare Luminale-Vorläufer5zu zielen. In dieser Studie zeigten wir die Verwendung von Ad-K5-Cre-Virus, um basale MECs anzugreifen (Abbildung 5). Wir haben immer noch nicht die Möglichkeit, diesen Ansatz zu verwenden, um die Östrogenrezeptor-positive luminale MEC-Subpopulation zu zielen. Der adenovirale Vektor, den wir hier verwendet haben, könnte einen Einsatz von bis zu 8 kb aufnehmen. Um MEC-subset-spezifische Ad-Cre zu entwickeln, konnte der Promotor, der zum Antrieb des Cre-Ausdrucks verwendet wird, nur weniger als 7 kb betragen. Praktisch kann ein großes Promotorfragment, auch wenn es weniger als 7 kb groß ist, schwierig zu unterklonen sein. Um in den adenoviralen Vektor zu passen, kann zwar ein abgeschnittener Promotor verwendet werden, aber er kann das Expressionsmuster seines entsprechenden Gens nicht getreu rekapitulieren, wenn er unter der Kontrolle des endogenen, vollständigen Promotors steht.
Der R26Y bedingte Reporter, der hier in das Mausmodell aufgenommen wurde, bot eine Möglichkeit, die Ursprungszellen zu markieren und deren Progression zu Krebszellen zu verfolgen. Bemerkenswert erweise war der Anteil der YFP-markierten Krebszellen am resultierenden Tumor relativ gering (Abbildung 6B). Dies könnte auf die Möglichkeit zurückzuführen sein, dass der Tumor neben den YFP-markierten Tumorepithelzellen auch viele Immunzellen und Stromalzellen umfasste, die den Großteil der Tumormasse ausmachten.
Im Vergleich zu anderen Mausmodellen von Brustkrebs führt dieser Ansatz zur Brustkrebsinitiierung nur aus einer kleinen Anzahl von MECs (z. B. luminale MECs, wenn Ad-K8-Cre injiziert wird), oft auf klonaler Ebene12. Da die Einleitung der menschlichen Tumorgenese wahrscheinlich klonal ist, rekapituliert dieser Ansatz diesen Aspekt der menschlichen Krebsentwicklung getreuer. Darüber hinaus führt der Verlust von p53, selbst wenn p53 nur in einer kleinen Anzahl von MECs gestört wird, zu ihrer klonalen Expansion, was zur Produktion eines größeren Pools mutierter MECs führt; dies würde eine weitere klonale Weiterentwicklung von den p53-defizienten MECs (bei Erwerb zusätzlicher somatischer Mutationen) ermöglichen12. Da TP53 das am häufigsten mutierte Gen bei menschlichem Brustkrebs16 ist und als TP53-Mutation ein frühes Ereignis bei der menschlichen Brusttumorigenese17,18ist, indem das Trp53-Flox-Mausmodell mit der Maus kombiniert wird. Modelle für andere onkogene Ereignisse können wir untersuchen, wie diese onkogenen Ereignisse mit p53-Verlust zusammenarbeiten und wie sie gemeinsam zur Entwicklung von Brusttumoren aus einem definierten zellulären Ursprung beitragen. Da weniger Züchten erforderlich ist, um mehrere Allele zusammenzufügen, würde dieser Ansatz die Zuchtkosten und den Zeitaufwand minimieren, was Brustkrebsmodellierungsstudien in größerem Maßstab in einem kürzeren Zeitraum erleichtern sollte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der National Institutes of Health (NIH) R01 CA222560 und den Breakthrough Award des Department of Defense W81XWH-18-1-0037 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
