Summary
Le but de ce protocole est de décrire une nouvelle approche de modélisation de cancer du sein basée sur l'injection intraductale de l'adénovirus Cre-exprimant dans les glandes mammaires de souris. Cette approche permet à la fois la manipulation de type cellulaire et d'organe d'événements oncogènes d'une manière contrôlée temporellement.
Abstract
Le cancer du sein est une maladie hétérogène, peut-être due à des interactions complexes entre différentes cellules d'origine et des événements oncogènes. Les modèles de souris jouent un rôle déterminant dans l'obtention d'un aperçu de ces processus complexes. Bien que de nombreux modèles de souris ont été développés pour étudier les contributions de divers événements oncogènes et les cellules d'origine à la tumorigénèse du sein, ces modèles ne sont souvent pas de type cellulaire ou d'organe spécifique ou ne peut pas induire l'initiation de la tumorigenesis mammaire dans un manière contrôlée temporellement. Ici nous décrivons un protocole pour produire un nouveau type de modèles de souris de cancer du sein basés sur l'injection intraductale de cre-exprimant l'adénovirus (Ad-Cre) dans les glandes mammaires de souris (MGs). En raison de l'injection directe d'Ad-Cre dans les conduits mammaires, cette approche est spécifique MG, sans aucune induction non désirée de cancer dans d'autres organes. La procédure d'injection intraductale peut être effectuée chez les souris à différents stades de leur développement MG (donc, il permet le contrôle temporel de l'induction du cancer, à partir de 3-4 semaines d'âge). La spécificité de type cellulaire peut être atteinte en utilisant différents promoteurs de type cellulaire spécifique pour conduire l'expression Cre dans le vecteur adénoviral. Nous montrons que les cellules épithéliales mammaires luminaires et basiques (MEC) peuvent être étroitement ciblées pour la manipulation génétique à base de Cre/loxP par une injection intraductale d'Ad-Cre sous le contrôle du promoteur De kératine 8 ou Kératine 5, respectivement. En incorporant un journaliste conditionnel DeC (par exemple, Cre/loxP-inductcible Rosa26-YFP journaliste), nous montrons que les MEC ciblés par Ad-Cre, et les cellules tumorales dérivées d'eux, peuvent être tracés en suivant les cellules reporter-positives après injection intraductale.
Introduction
L'objectif global de cette méthode est de développer une nouvelle approche de modélisation du cancer du sein basée sur une injection intraductale d'Ad-Cre dans la souris MG. L'approche génétique basée sur la recombinaison Cre/loxP a été largement utilisée pour modéliser le cancer du sein humain chez la souris. La première génération de modèles de souris à base de Cre/loxP sur le cancer du sein est générée par l'utilisation de souris transgéniques exprimant cre sous le contrôle de promoteurs spécifiques au MEC (p. ex., MMTV-Cre pour les MEC suspicieux et une partie des MEC basiques, Wap-Cre et Blg-Cre pour les progéniteurs luminal et les MEC alvéolaires, K14-Cre pour les cimeaux et une partie des MECs luminal1,2,3,4,5)6, 7 Annonces , 8 Annonces , 9. Cependant, bien que ces lignes transgéniques Cre permettent le contrôle spatial de l'expression de Cre (c.-à-d., dans différents sous-ensembles de MECs), elles ne permettent pas le contrôle temporel de l'expression de Cre et de la manipulation génétique Cre/loxP-négociée. La deuxième génération de modèles de souris à base de Cancer du sein à base de Cre/loxP utilise des approches inductibles d'activité/expression cre (p. ex., l'utilisation de la fusion des récepteurs Cre-estrogen [CreER], qui ne peut induire la recombinaison Cre/loxP qu'à l'administration du tamoxifène) et en conséquence, ces outils génétiques permettent à la fois des contrôles spatiaux et temporels de l'activation d'événements oncogènes dans les MEC (p. ex., K8-CreER- et K5-CreER-modèles basés)10,11,12 . Dans les deux générations de modèles de souris de cancer du sein, comme les promoteurs utilisés pour conduire l'expression Cre ou CreER (par exemple, Krt8, Krt5) peuvent également être actifs dans les cellules épithéliales d'autres organes (c.-à-d., ils sont de type cellulaire spécifique, mais pas spécifique à l'organe) ou ont une expression qui fuit dans les types de cellules autres que les cellules épithéliales (par exemple, MMTV, qui a une activité qui fuit dans les cellules hématopoïétiques de moelle osseuse), ces approches peuvent conduire au développement de cancers indésirables (s) dans d'autres organes.s). Si ces cancers inattendus causent la létalité chez les souris touchées, le but initial de la modélisation du cancer du sein chez ces souris peut être interdit (p. ex., les événements oncogènes entraînés par MMTV-Crepeuvent entraîner des tumeurs malignes hématopoïétiques et la mort prématurée des souris. , en raison de la fuite du promoteur MMTV dans les cellules hématopoïétiques)4.
Ici nous rapportons une approche de modélisation de cancer du sein chez les souris qui permet la manipulation de type cellulaire- et d'organe-spécifique des événements oncogènes d'une manière temporellement commandée. Cette approche est basée sur une injection intraductale d'Ad-Cre dans les MG de souris (et est, par conséquent, spécifique à l'organe). L'expression de cre peut être contrôlée en utilisant différents promoteurs spécifiques à la sous-population MEC intégrés dans le vecteur adénoviral (par exemple, Krt8 pour les MEC slumineux, Krt5 pour les MEC basiques, réalisant ainsi une spécificité de type cellulaire). L'induction du cancer chez les GM peut être contrôlée temporellement par une injection d'Ad-Cre chez des souris à différents âges, à partir de 3-4 semaines d'âge (pubertal) jusqu'au stade adulte.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de Brigham and Women's Hospital.
1. Génération et entretien de souris floxed
- Obtenir le knock-out conditionnel floxed (p. ex., Trp53tm1Brn [appelé Trp53L/L], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) ou les lignes de souris knock-in conditionnelles (p. ex., Gt(ROSA)26Sortm1 (Pik3ca-H1047R)Egan) du référentiel du Jackson Laboratory (JAX) ou du NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium (MMHCC). En outre, pour faciliter la chasse aux CME qui subissent une recombinaison à médiation crécétique, une ligne conditionnelle de Cre-reporter peut également être obtenue auprès de JAX (p. ex. Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [appelé R26Y]).
- Reproduire Des souris homozygous De Race Trp53L/L avec des souris journaliste homozygotes R26Y ou avec des souris homozygous portant les allèles de journaliste R26Y et tout KO conditionnel ou knock-in supplémentaire pour différents modèles de souris, pour obtenir une progéniture hétérozygote F1 masculine et féminine.
- Intercross hétérozygous Hétéros F1 souris mâles et femelles pour obtenir F2 composés souris femelles qui sont homozygous pour chaque allèle (comme des souris expérimentales), ainsi que R26Y-seulement femelles homozygous (comme souris témoins). Génotype F2 souris basées sur les amorces PCR et les conditions de cyclisme énumérées ci-dessous, en mettant en place deux réactions PCR standard de 20 L (à l'aide de Taq 5X Master Mix) dans deux tubes PCR différents, l'un avec les amorces R26Y et l'autre avec le Trp53L d'apprêt. Utilisez des souris adultes (généralement autour de 2 à 4 mois) pour toute la reproduction.
- Pour R26Y, effectuer pcR à 94 oC pendant 3 min, puis à 94 oC pour 30 s, 60 oC pour 30 s et 72 oC pendant 1 min pendant 35 cycles, suivi de 72 oC pendant 3 min, et de maintenir à 14 oC. Utilisez les amorces (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG ATG ATG.
REMARQUE: Une seule bande PCR de 250 bp indique un homozygote R26Y, une seule bande PCR de 500 bp indique un type sauvage (WT), et deux bandes PCR (R26Y: 250 bp, WT: 500 bp) indiquent un heterozygote R26Y (Figure 1A).
Pour Trp53L, effectuer pcR à 94 oC pendant 3 min, puis à 94 oC pour 30 s, 60 oC pour 30 s, et 72 oC pendant 1 min pendant 35 cycles, suivi de 72 oC pendant 3 min, et de maintenir à 14 oC. Utiliser les amorces (i) p53F2-10 1F : CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
REMARQUE : Une seule bande PCR de 370 pb indique un Homozygote Trp53L/L, une seule bande PCR de 288 pb indique un Trp53/ WT, et deux bandes PCR (WT : 288 bp, Trp53L: 370 bp) indiquent un Trp53L / Heterozygote (Figure 1B).
- Pour R26Y, effectuer pcR à 94 oC pendant 3 min, puis à 94 oC pour 30 s, 60 oC pour 30 s et 72 oC pendant 1 min pendant 35 cycles, suivi de 72 oC pendant 3 min, et de maintenir à 14 oC. Utilisez les amorces (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG ATG ATG.
2. Préparation préopératoire
- Autoclave tous les outils chirurgicaux 1 jour avant la chirurgie.
- Préparer 0,1 % de bleu bromophénol dans de la saline tamponnée par le phosphate (PBS) et le conserver à 4 oC. Diluer l'Ad-Cre qui sera utilisé pour l'injection intraductale dans le milieu DMEM avec 0,01 M CaCl2 et bleu bromophénol à un rapport de 1:10 (c.-à-d., le mélange d'injection).
REMARQUE : L'Ad-Cre utilisé ici a été obtenu auprès du noyau viral vectoriel de l'Université de l'Iowa, avec un stock de taquet viral de 10à10 pfu/mL. - Anesthésiez la souris femelle (génération F2 telle que décrite à l'étape 1.2, âge allant de 3 à 4 semaines d'âge à l'adulte) à l'aide d'une chambre isoflurane et appliquez la pommade pour les yeux. Pendant la procédure, anesthésier la souris en permanence en s'assurant qu'elle inhale 1% - 2,5% isoflurane en oxygène. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie au moins toutes les 15 min en effectuant une pincée d'orteil. Surveillez attentivement la souris pour tout changement de la fréquence respiratoire, en ajustant le niveau d'isoflurane en conséquence, si nécessaire.
- Injecter méloxicam comme analgésie sous-cutanée à une dose de 5 mg/kg, avant l'intervention chirurgicale.
- Exposer le site chirurgical mamelon en appliquant plusieurs gouttes de crème d'épilation; enlever la crème excessive et les cheveux lâches à l'aide d'essuie-tout doux.
REMARQUE : Effectuez cette étape dans une zone séparée de l'endroit où la chirurgie doit être effectuée. Le rasage n'est pas recommandé afin d'éviter des dommages aux mamelons. Faites preuve de prudence pour éliminer l'agent déplaisé chimique en temps opportun. Laisser l'agent allumé trop longtemps peut entraîner des brûlures chimiques sur la peau - Désinfecter le site chirurgical avec des iodophors d'abord, suivi de 70% d'alcool, et se terminer par une application finale d'iodophors de gommage. Faites ceci dans un mouvement circulaire du centre de la zone de travail vers la périphérie utilisant une éponge de gaze ou un applicateur coton-vers. Répétez le cycle 3x-4x.
3. Injection intraductale
- Utilisez des techniques aseptiques tout au long de l'intervention chirurgicale.
- Faire un site d'incision sur la peau à une longueur de 1 cm entre les deux quatrièmes GM inguinal (figure 2). Séparez soigneusement le rabat cutané (avec le MG) du péritoine pariétal afin de visualiser l'arbre ductal mammaire.
- Tenez soigneusement le mamelon avec les forceps de l'horloger et retirez le mamelon extérieur sans couper la peau voisine, à l'aide d'un ciseau à micro-dissection.
- Chargez le mélange d'injection Ad-Cre dans une seringue Hamilton de 25 l avec une aiguille de moyeu métallique de 33 G fixée. Estimer le volume du mélange d'injection dans la seringue à partir du colorant bleu inclus dans le mélange.
REMARQUE : Utilisez un volume plus faible (p. ex., 3 L) lors de l'injection dans des GM de femelles âgées de 3 à 4 semaines et un plus grand volume (p. ex., 10 L) lors de l'injection dans des GM de femelles qui lactent. - Tenez doucement le bord de l'aileron de la peau avec une pince fine incurvée et injectez le mélange d'injection Ad-Cre lentement dans le mamelon, en attendant la surveillance de la propagation de la teinture bleue dans l'arbre canalaire mammaire. Maintenir le taux d'injection aussi bas que possible pour éviter des dommages au lumen canalaire.
REMARQUE : Le fluide injecté (comme illustré par le colorant bleu bromophenol inclus) se propageant dans l'arbre canalaire entier sans fuite dans le compartiment stromal indique une injection intraductale réussie. - Retirez délicatement l'aiguille du mamelon pour éviter toute fuite du liquide injecté.
- Examiner le côté distal (c.-à-d., loin du mamelon) du MG ou la zone environnante du mamelon injecté. Notez que le colorant bleu enflé (c.-à-d., colorant diffusant dans le stroma voisin) indique une injection de garniture de graisse mammaire plutôt qu'une injection intraductale réussie.
- Fermez les plaies chirurgicales (à partir de l'étape 3.2) dans la peau avec des pinces de plaie.
4. Soins postopératoires
- Retirez la souris de l'anesthésie et placez-la sur un coussin chauffant à l'intérieur d'une cage propre pour la récupération.
- Administrer méloxicam sous-cutané à 5 mg/kg à nouveau, 24 h après la chirurgie.
- Surveillez l'état général de l'animal et recherchez des signes d'infection sur le site d'incision pendant 5 jours.
- Les pinces de blessure sont enlevées de 7 à 10 jours après la chirurgie.
5. Suivi du développement de la tumeur mammaire
- Surveiller les souris injectées deux fois par semaine par palpation pour tout signe de développement de la tumeur mammaire.
- Une fois que la tumeur est palpable, surveillez la souris quotidiennement et mesurez la taille de la tumeur jusqu'à ce qu'elle atteigne le point final expérimental, tel que déterminé par la taille (par exemple, atteignant 10%-15% du poids corporel de la souris) ou l'état (par exemple, ulcéré ou nécrotique) de la tumeur, ou par le l'état de santé général de la souris (p. ex., comateux, moribond).
- Euthanasier la souris par asphyxie au dioxyde de carbone, suivie d'une méthode secondaire (p. ex., dislocation cervicale).
- Isolez les tissus de la tumeur mammaire et analysez-les par cytométrie du débit, immunofluorescence ou profilage d'expression (p. ex., par séquençage de l'ARN [RNAseq] ou microarray), tel que décrit précédemment12.
- Effectuer l'analyse cytométrique du débit en gating pour les cellules négrées de lignée (Lin-: négatif pour les marqueurs de lignée CD45 [marqueur de leucocyte], CD31 [marqueur cellulaire endothélial] et TER119 [marqueur érythrocyte]), et analyser les cellules de la tumeur en fonction de leur l'expression de YFP, CD24 et CD29.
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Representative Results
Les résultats de génotypage PCR représentatifs pour les allèles R26Y et Trp53L sont présentés à la figure 1.
Bien que, en principe, tous les 10 GM peuvent être soumis à la procédure d'injection intraductale, pratiquement, les deux quatrièmeS inguinalsont sont généralement sélectionnés pour l'injection, en raison de leur accessibilité plus facile et de plus grandes tailles de MG (Figure 2). Pendant la chirurgie, il est important de maintenir une zone de travail désinfectée et épurée et d'effectuer la procédure avec des outils stériles (figure 3). Pendant l'injection intraductale, l'inclusion d'un colorant bleu (p. ex., bleu bromophénol) dans le mélange d'injection aide à visualiser une injection réussie d'Ad-Cre dans l'arbre canalaire entier (figure 4). Les souris femelles les plus jeunes dans lesquelles l'injection intraductale (avec un plus petit volume du mélange d'injection) peut être exécutée avec succès sont celles à l'âge de 3 semaines (figure4A),bien que pour la plupart des expériences mammaires d'induction de tumeur, de jeunes souris femelles adultes (p. ex., 2 mois) sont généralement utilisés (figure 4B). En outre, l'injection intraductale (avec un plus grand volume du mélange d'injection) peut également être effectuée chez les souris femelles au début /mi-gestation pour cibler les cellules alvéolaires (Figure 4C).
D'après notre expérience, chez les souris avec le journaliste R26Y et Trp53L/L (avec ou sans allèles conditionnels supplémentaires), la recombinaison à médiation C a perturbé les allèles knock-out conditionnels Trp53 (et tout autre allèle conditionnel allèles knock conditionnel, s'il est utilisé) et, en attendant, tourné sur le journaliste YFP (de l'allèle R26Y, ainsi que de tout allèle conditionnel supplémentaire knock-in, si elle est utilisée). Pour cibler différentes sous-populations mec pour l'induction de tumeurs mammaires, les virus Ad-Cre sous le contrôle de différents promoteurs spécifiques au sous-ensemble MEC ont été utilisés pour l'injection (Figure 5). Par exemple, Ad-Cre sous le contrôle du promoteur De Kératine 8 (Krt8) (Ad-K8-Cre) a été utilisé pour cibler les MEC suspineux. Précédemment, nous avons rapporté l'utilisation d'Ad-Cre sous le contrôle du promoteur de Kératine 14 (Krt14) (Ad-K14-Cre) pour cibler les MEC basiques13. Cependant, comme nous l'avons signalé, l'injection intraductale d'Ad-K14-Cre a non seulement ciblé les MEC basal mais aussi une partie des MECluminals13. Nous avons récemment testé un autre Ad-Cre sous le contrôle de Keratin 5 (Krt5) promoteur (Ad-K5-Cre)14 et a constaté qu'il peut cibler plus étroitement la lignée basale, conduisant à la notation génétique de seulement MECbas (Figure 5). Les pourcentages typiques de CEM marqués YFP provenant de l'injection ad-K8-Cre ou Ad-K5-Cre sont d'environ 0,1 % à 1 %.
Pour Trp53L/L; R26Y souris femelles sous le fond génétique DeFB, l'injection intraductale d'Ad-K8-Cre, qui cible leurs MECluminals, a mené au développement des tumeurs mammaires plusieurs mois après l'injection (figure 6A). Les souris ayant un bagage génétique différent (p. ex. C57/B6) peuvent présenter une plus longue latence du développement de tumeurs mammaires après l'injection. En raison de l'inclusion du journaliste conditionnel R26Y, les cellules épithéliales tumorales étaient généralement marquées par le PFJ et pouvaient être détectées par cytométrie du débit (figure 6B); ils pourraient être enrichis par le tri des flux des cellules YFP pour une analyse plus approfondie.
Figure 1 : Résultats de génotypage PCR représentatifs pour les allèles R26Y et Trp53 L. WT - type sauvage; Homo et homozygote. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Diagramme schématique de l'injection intraductale du virus Ad-Cre dans un MG. (A) Site d'incision dans la ligne médiane entre les deux quatrièmes GM. (B) Injection intraductale d'Ad-Cre avec un colorant bleu (pour une meilleure visualisation) dans l'un des quatrièmes GM. (C) Fermeture de l'incision dans la peau par des pinces de plaie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Aperçu de la configuration aseptique pour la chirurgie des rongeurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Visualisation d'une injection intraductale réussie dans l'arbre canalaire mammaire entier. (A) Exemple de l'injection intraductale de 3 l l de mélange d'injection (avec le bleu de bromophenol) dans un MG d'une souris femelle de 3 semaines. (B) Injection intraductale de 5 ll de mélange d'injection dans un MG d'une jeune souris femelle adulte. (C) Injection intraductale de 10 l de mélange d'injection dans un MG d'une souris femelle au début/mi-gestation. (D) Un exemple d'injection de coussinet de graisse mammaire plutôt que d'une injection intraductale réussie. Injection intraductale de 5 l l de mélange d'injection dans un MG d'une jeune souris femelle adulte. a) La zone de la peau entourant le mamelon injecté; (b) L'autre côté de l'aileron de peau montrant le coussinet de graisse mammaire; le cercle jaune indique le colorant diffus dans le tampon de graisse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Parcelles représentatives de l'analyse cytométrique du débit des cellules marquées par le PFJ lors de l'injection intraductale. YFP- populations de MGs de femelles vierges R26Y 3 jours après une injection intraductale d'Ad-K8-Cre (à gauche, injection à un titer de 7 x 109 pfu/mL) ou Ad-K5-Cre (droite, injection à un titer de 7,86 x 109 pfu/ mL) virus. Les parcelles sont basées sur une analyse de la coloration CD24 et CD29 dans la lignée négative (Lin-; c.-à-d., négative pour CD45, CD31, et TER119 expression) YFP' cellules. Lu - Lin-CD24hauteCD29 faible CD29faible luminaire MEC gate; Ba - Lin-CD24faibleCD29haute porte basale MEC; la stratégie de gating pour les MEC suspineux et basaux est basée sur Shackleton et coll.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Développement tumoral dans Trp53L/L; R26Y souris femelles injectées par voie intraductique avec Ad-K8-Cre. (A) Une souris représentative montrant la croissance tumorale (flèches) plusieurs mois après une injection avec Ad-K8-Cre. (B) Environ 8,8% des cellules vivantes (basées sur la coloration DAPI) d'une tumeur représentative étaient positives pour l'expression de YFP, basée sur l'analyse cytométrique de flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le succès de cette approche pour induire des tumeurs mammaires de différentes sous-populations de MECs repose non seulement sur le choix des promoteurs appropriés de type cellulaire -spécifique (pour conduire l'expression de Cre) mais également sur la procédure d'injection intraductale elle-même. L'idée derrière cette approche est que les virus Injectés Ad-Cre sont conservés dans l'arbre ductal, qui est une structure cachée avec lumen, et donc, seuls les MEC sont exposés aux virus et sont infectés par Ad-Cre. En raison de l'espace de lumen limité dans les conduits mammaires, il est important d'injecter seulement un petit volume du mélange d'injection à chaque MG (c.-à-d., 3-5 l). Le volume injecté doit également être ajusté en fonction de l'âge des souris (c.-à-d., un volume plus faible doit être utilisé lorsqu'il est injecté dans des souris de 3 à 4 semaines). Lorsque le volume du liquide injecté est excessif en raison de la pression de l'injection et de l'espace de lumen canalaire limité, le liquide peut être « poussé » à travers les couches épithéliales dans le stroma, conduisant à une infection virale indésirable dans les cellules stromales.
Étant donné que la spécificité de type cellulaire est atteinte par le promoteur utilisé dans le vecteur adénoviral pour conduire l'expression Cre, une limitation de cette approche est l'absence potentielle d'un promoteur approprié pour cibler l'expression Cre à une sous-population mec spécifique. Nous avons précédemment signalé l'utilisation du virus pan-luminaire Ad-K8-Cre pour cibler les MECs luminaires12,13 et l'utilisation du virus Ad-Wap-Cre pour cibler les progéniteurs luminal alvéolaires5. Dans cette étude, nous avons montré l'utilisation du virus Ad-K5-Cre pour cibler les MEC basiques (figure 5). Nous n'avons toujours pas la capacité d'utiliser cette approche pour cibler la sous-population de MEC luminaire récepteur-positif d'oestrogène. Le vecteur adénoviral que nous avons utilisé ici pourrait accueillir un insert allant jusqu'à 8 kb. Ainsi, pour développer l'Ad-Cre spécifique à MEC-sous-ensemble, le promoteur utilisé pour conduire l'expression Cre ne pouvait être que de moins de 7 kb. Pratiquement, un grand fragment de promoteur, même si la taille est inférieure à 7 kb, peut être difficile à sous-cloner. Afin de s'intégrer dans le vecteur adénoviral, bien qu'un promoteur tronqué puisse être utilisé, il peut ne pas récapituler fidèlement le modèle d'expression de son gène correspondant lorsqu'il est sous le contrôle du promoteur endogène et complet.
Le journaliste conditionnel R26Y inclus dans le modèle de souris ici fourni un moyen de marquer les cellules d'origine et de tracer leur progression vers les cellules cancéreuses. Il convient de noter que le pourcentage de cellules cancéreuses marquées par le PFJ dans la tumeur résultante semblait assez faible (figure 6B). Ceci pourrait être dû à une possibilité que, en plus des cellules épithéliales de tumeur YFP-marquées, la tumeur a également inclus beaucoup de cellules immunitaires et de cellules stromal, qui ont constitué la majeure partie de la masse de tumeur.
Comparée à d'autres modèles murins du cancer du sein, cette approche mène à l'initiation de tumeur mammaire d'un petit nombre de MECseulements seulement (par exemple, MECluminal quand Ad-K8-Cre est injecté), souvent à un niveau clonal12. Comme l'initiation de la tumorigénèse humaine est susceptible d'être clonale, cette approche récapitule cet aspect du développement du cancer humain plus fidèlement. En outre, même lorsque la p53 n'est perturbée que dans un petit nombre de MEC, la perte de p53 conduit à leur expansion clonale, conduisant à la production d'un plus grand bassin de MEC mutés; cela permettrait une nouvelle évolution clonale à partir des CME déficients p53 (lors de l'acquisition de mutations somatiques supplémentaires)12. Comme TP53 est le gène le plus couramment muté dans le cancer du sein humain16 et que la mutation TP53 est un événement précoce dans la tumorigénèse du sein humain17,18, en combinant le modèle de souris floxed Trp53 avec la souris modèles pour d'autres événements oncogéniques, nous pouvons étudier comment ces événements oncogènes coopèrent avec la perte de p53 et comment ils contribuent conjointement au développement de tumeur mammaire d'une origine cellulaire définie. En outre, comme il faut moins de reproduction pour assembler plusieurs alleles, cette approche réduirait au minimum le coût et le temps de reproduction, ce qui devrait faciliter les études de modélisation du cancer du sein à plus grande échelle, dans une période plus courte.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par national Institutes of Health (NIH) subvention R01 CA222560 et par department of Defense Breakthrough Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
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