Summary
이 프로토콜의 목표는 마우스 유방 땀샘으로 Cre 발현 아데노바이러스의 자궁 내 주입에 기초한 새로운 유방암 모델링 접근을 기술하는 것입니다. 이 접근은 세포 모형 및 기관 특정 조작을 시간적으로 통제한 방식으로 oncogenic 사건을 둘 다 허용합니다.
Abstract
유방암은 이기종 질병, 기원의 다른 세포 와 종양 발생 이벤트 사이의 복잡 한 상호 작용 때문일 수 있습니다. 마우스 모델은 이러한 복잡한 프로세스에 대한 통찰력을 얻는 데 중요한 역할을 합니다. 많은 마우스 모형이 유방 종양발생에 각종 종양 발생및 기원의 세포의 기여를 공부하기 위하여 개발되었더라도, 이 모형은 수시로 세포 모형 또는 기관 특정이 아니거나 유방 종양 발생의 개시를 유도할 수 없습니다 일시적으로 제어 방식. 여기에서 우리는 마우스 유방 땀샘 (MGs)으로 Cre 발현 아데노 바이러스 (Ad-Cre)의 경막 주사에 근거를 둔 유방암 마우스 모형의 새로운 모형을 생성하는 프로토콜을 기술합니다. 유선 덕트에 Ad-Cre를 직접 주입하기 때문에이 접근법은 다른 장기에서 원치 않는 암 유도없이 MG 특정입니다. 경막 주사 절차는 MG 발달의 다른 단계에서 마우스에서 수행 될 수있다 (따라서, 그것은 암 유도의 시간적 제어를 허용, ~에서 시작 ~3-4 나이의 주). 세포 형 특이성은 아데노 바이러스 벡터에서 Cre 발현을 유도하기 위해 상이한 세포 형 특이적 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 우리는 발광 및 기저 유방 상피 세포 (MECs)가 각각 케라틴 8 또는 케라틴 5 프로모터의 통제하에 Ad-Cre의 경막 주사를 통해 Cre /loxP 기반 유전자 조작을 위해 단단히 표적으로 할 수 있음을 보여줍니다. 조건부 Cre 리포터(예를 들어, Cre/loxP-유도성 Rosa26-YFP 리포터)를 통합함으로써, 우리는 Ad-Cre에 의해 표적화된 MECs, 및 그로부터 유래된 종양 세포가, 유도 내 주사 후 리포터 양성 세포를 따라 추적될 수 있음을 보여준다.
Introduction
이 방법의 전반적인 목표는 마우스 MG에 Ad-Cre의 경내 주입에 근거를 둔 새로운 유방암 모델링 접근을 개발하는 것입니다. Cre/loxP 재조합 기반 유전 적 접근법은 마우스에서 인간 유방암을 모델링하는 데 널리 사용되어 왔습니다. Cre/loxP 기반 유방암 마우스 모델의 1세대는 MEC 특이적 프로모터(예: 광ME및 기저 MEC의 일부인 MMTV-Cre) 및 기저 MEC의 일부, Wap-Cre 및 발광 선조 및 폐포 광도 MEC, K14-Cre 기저 및 발광 MEC의 일부에 대한 Blg-Cre 1, 2,3,4,5)6, 7명 , 8개 , 9. 그러나, 이러한 Cre 형질전환 선은 Cre 발현의 공간 제어를 가능하게하지만 (즉, MEC의 다른 하위 세트에서), 그들은 Cre 발현 및 Cre / loxP 매개 유전 조작의 시간적 제어를 허용하지 않습니다. Cre/loxP 기반 유방암 마우스 모델의 2세대는 유도성 Cre 활성/발현 접근법을 활용합니다(예를 들어, 타목시펜 투여 시 크레/록스P 재조합을 유도할 수 있는 Cre-에스트로겐 수용체 융합[CreER]의 사용),, 그 결과, 이러한 유전 적 도구는 MECs에서 의 한인 발생 이벤트의 활성화의 공간 적 및 시간적 제어를 모두 허용 (예를 들어, K8-CreER- 및 K5-CreER기반 모델)10,11,12 . 유방암 마우스 모델의 두 세대에서, Cre 또는 CreER 발현을 구동하는 데 사용되는 프로모터로서 (예를 들어, Krt8, Krt5)또한 다른 장기의 상피 세포에서 활성화 될 수있다 (즉, 그들은 세포 유형 특이적이지만 장기 특이적이지 않음) 또는 상피 세포 이외의 세포 유형에서 새는 발현을 가지고 (예를 들어, MMTV,이는 골수 조혈 세포에서 새는 활성을 가지고), 이러한 접근 방식은 다른 기관에서 원치 않는 암의 개발로 이어질 수 있습니다.. 이러한 예기치 않은 암이 영향을받는 마우스에서 치사를 일으키는 경우,이 마우스에서 유방암을 모델링하는 원래의 목적은 금지 될 수있다 (예를 들어, MMTV-Cre-구동 종양 발생 이벤트는 조혈 악성 종양과 마우스의 조기 사망으로 이어질 수 있습니다 , 조혈 세포에서 MMTV 프로모터의 누설로 인해)4.
여기에서 우리는 일시적으로 통제된 방식으로 세포 모형 및 기관 특정 조작을 둘 다 허용하는 마우스에 있는 유방암 모델링 접근을 보고합니다. 이 접근법은 마우스 MGs에 Ad-Cre의 내 삽입을 기반으로 합니다 (따라서 장기별). Cre 발현은 아데노바이러스 벡터에 내장된 상이한 MEC 서브모멘트 특이적 프로모터를 사용하여 제어될 수 있다(예를 들어, 발광 MEC의 경우, 기저 MEC의 경우 Krt8, 따라서 세포 형 특이성을 달성). MGs에 있는 암 유도는 성인 단계에 나이의 3-4 주 (사춘기)에서 시작하여 다른 나이에 마우스로 Ad-Cre의 주입에 의해 일시적으로 통제될 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 브리검 및 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 플록스 마우스의 생성 및 유지 보수
- 유방암 관련 플록스 조건부 녹아웃(예: Trp53Tm1Brn [Trp53L/L], Brca1Aash [Brca1L/L])또는 조건부 노크인 마우스 라인(예: GT(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)이건) 잭슨 연구소 (JAX) 또는 인간 암 컨소시엄의 NCI 마우스 모델 (MMHCC) 저장소에서. 또한, Cre-mediaed 재결합을 거치는 MEC의 추격을 용이하게 하기 위해, 조건부 크레 리포터 라인은 또한 JAX(예를 들어, GT(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos[R26Y로 지칭된다]로부터 얻을 수 있다.
- R26Y 동형접합체 리포터 마우스또는 R26Y 리포터 대립구를 운반하는 동형접합 마우스를 가진 품종 Trp53L/L 동형접합마우스 및 다른 에 대한 추가 플럭스 조건부 녹아웃 또는 노크-인 대립구 마우스 모델, 헤테로지구스 F1 남성과 여성의 자손을 얻을 수 있습니다.
- 인터크로스 헤테로지쿠스 F1 수컷 및 암컷 마우스는 각 알레르(실험마우스로서)에 대해 동형접합체인 F2 화합물 암컷 마우스뿐만 아니라 R26Y-유일한동형접합여성(대조군 마우스로서)을 얻었다. 아래 나열된 PCR 프라이머 및 사이클링 조건에 기초한 유전자형 F2 마우스는 두 개의 서로 다른 PCR 튜브에 2개의 표준 20 μL PCR 반응(Taq 5X Master Mix 사용)을 설정하여 R26Y 프라이머를 사용하고 다른 하나는 Trp53L과 함께 프라이머. 모든 번식에 성인 마우스 (일반적으로 약 2-4 개월 의 나이)를 사용합니다.
- R26Y의경우, 3분 동안 94°C에서 PCR을 수행한 다음 30초동안 94°C, 30초동안 60°C, 35사이클동안 1분 동안 72°C, 3분 동안 72°C, 14°C에서 유지합니다. 프라이머 사용 (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCC ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG 가트 ATG ATG.
참고: 250 bp의 단일 PCR 대역은 R26Y 동형화이고, 단일 PCR 대역은 500 bp의 단일 PCR 대역은 야생형(WT)을 나타내고, 2개의 PCR 대역(R26Y: 250 bp, WT: 500 bp)은 R26Y 헤테로지고테(그림1A)를나타낸다.
Trp53L의경우 94°C에서 3분 동안 PCR을 수행한 다음 30초동안 94°C, 30초동안 60°C, 35사이클동안 1분 동안 72°C, 3분 동안 72°C, 14°C에서 PCR을 유지합니다. 프라이머 (i) p53F2-10 1F 사용: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA 태그 GAG GCA 개그 AC.
참고: 370bp의 단일 PCR 대역은 Trp53L/L 호모자고테를 나타내며, 288bp의 단일 PCR 대역은 Trp53+/+ WT를 나타내고, 두 개의 PCR 대역(WT: 288bp, Trp53L: 370bp)은 Trp53 L을 나타냅니다. /+ 헤테로지고테(그림1B).
- R26Y의경우, 3분 동안 94°C에서 PCR을 수행한 다음 30초동안 94°C, 30초동안 60°C, 35사이클동안 1분 동안 72°C, 3분 동안 72°C, 14°C에서 유지합니다. 프라이머 사용 (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCC ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG 가트 ATG ATG.
2. 수술 전 준비
- 수술 1 일 전에 모든 수술 도구를 오토 클레이브.
- 인산완식염수(PBS)에 0.1% 브로모페놀 블루를 준비하고 4°C에 보관합니다. DMEM 배지에서 0.01 M CaCl2 및 브로모페놀 블루를 1:10의 비율로 사용하여 DMEM 배지에서 의 증감 주사에 사용될 Ad-Cre를 희석한다(즉, 주사 혼합물).
참고 : 여기에 사용되는 광고 - Cre는 아이오와 바이러스 벡터 코어의 대학에서 얻은, ~ 1010-1011 pfu / mL의 주식 바이러스 성 가이터와. - 이소플루란 챔버를 사용하여 암컷 마우스(1.2단계에서 설명한 대로 F2 세대, 나이 3-4주에서 성인까지의 연령)를 마취시키고 눈 연고를 적용한다. 시술 중에 마우스가 산소에서 1%-2.5% 이소플루란을 흡입하도록 하여 마우스를 지속적으로 마취시다. 발가락 핀치를 수행하여 적어도 매 15 분마다 마취의 깊이를 확인하십시오. 필요한 경우 호흡률의 변화가 있는지 마우스를 조심스럽게 모니터링하고 그에 따라 이소플루란의 수준을 조정하십시오.
- 5 mg/kg의 복용량에 피하 진통으로 멜 록시 캄을 주입, 외과 적 절차 전에.
- 제모 크림의 여러 방울을 적용하여 젖꼭지 수술 부위를 노출; 부드러운 종이 타월을 사용하여 과도한 크림과 느슨한 머리를 제거하십시오.
참고: 수술이 수행될 위치와 는 별개의 영역에서 이 단계를 수행합니다. 젖꼭지가 손상되지 않도록 면도는 권장하지 않습니다. 적시에 화학 제모제를 제거하기 위해주의를 사용. 에이전트를 너무 오래 방치하면 피부에 화학적 화상을 입을 수 있습니다. - 먼저 요오드도프로 수술 부위를 소독하고 70 % 알코올을 마시고 스크럽 이오도프를 최종 적용하십시오. 거즈 스폰지 또는 면 팁 어플리케이터를 사용하여 작업 영역의 중심에서 주변을 향해 원을 그리며 이 작업을 수행합니다. 주기를 3x-4x 반복합니다.
3. 경내 주사
- 수술 절차 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용하십시오.
- 두 개의 네 번째 인과 MGs 사이에 ~ 1cm의 길이로 피부에절개 부위를 만듭니다 (그림 2). 유방 덕트 나무를 시각화할 수 있도록 정수리 복막에서 피부 플랩 (MG)을 조심스럽게 분리하십시오.
- 조심스럽게 워치메이커의 집게로 젖꼭지를 잡고 미세 해부 가위를 사용하여 근처의 피부를 자르지 않고 외부 젖꼭지를 제거합니다.
- 33 G 금속 허브 바늘이 부착된 25 μL 해밀턴 주사기에 Ad-Cre 주입 혼합물의 ~3-5 μL을 적재합니다. 혼합물에 포함된 청색 염료에 기초하여 주사기 내의 주사 혼합물의 부피를 추정한다.
참고: 3-4주 된 암컷의 MGs에 주입할 때 더 작은 부피(예: 3 μL)를 사용하고 수유 여성의 MGs에 주입할 때 더 큰 부피(예: 10 μL)를 사용하십시오. - 미세한 곡선 트위저로 피부 플랩의 가장자리를 부드럽게 잡고 Ad-Cre 주입 혼합물을 젖꼭지에 천천히 주입하고, 한편 유방 덕트 트리에 청색 염료가 퍼지는 것을 모니터링합니다. 덕트 루멘의 손상을 피하기 위해 가능한 한 낮은 주입 속도를 유지하십시오.
참고: 주입된 유체(포함된 브로모페놀 블루 염료에 의해 도시된 바와 같이)는 기질 구획으로 누출되지 않고 덕트 나무 전체에 퍼져 있는 성공적인 자궁 내 주사를 나타낸다. - 주입된 액체의 누출을 방지하기 위해 젖꼭지에서 바늘을 부드럽게 제거하십시오.
- MG의 말단 측 (즉, 젖꼭지에서 멀리) 또는 주입된 젖꼭지의 주변 지역을 검사합니다. 팽윤 하는 푸른 염료 (즉, 염료 근처 기질로 확산) 유 방 지방 패드 주입 보다는 성공적인 내 심 출 주사를 나타냅니다.
- 상처 클립으로 피부의 외과 적 상처 (3.2 단계에서)를 닫습니다.
4. 수술 후 치료
- 마취에서 마우스를 제거하고 복구를위해 깨끗한 케이지 내부의 가열 패드에 놓습니다.
- 멜 록시 캄 을 피하 관리 5 mg/kg 다시, 24 수술 후 시간.
- 동물의 일반적인 상태를 모니터링하고 5 일 동안 절개 부위에서 감염 징후를 찾습니다.
- 상처 클립은 수술 후 ~ 7-10 일 후에 제거됩니다.
5. 유방 종양의 발달을 감시
- 유방 종양 발달의 어떤 표시든지를 위한 촉진에 의해 주입된 마우스를 매주 2회 감시하십시오.
- 종양이 만져지면 매일 마우스를 모니터링하고 실험 종점에 도달 할 때까지 종양 크기를 측정하십시오(예: 마우스 체중의 10%-15%에 도달) 또는 종양의 상태(예: 궤양성 또는 괴사)에 의해 결정됩니다. 마우스의 일반적인 건강 상태 (예를 들어, 혼수 상태, moribund).
- 이산화탄소 질식에 의해 마우스를 안락사시키고, 이차 방법 (예를 들어, 자궁 경부 탈구)이 뒤따른다.
- 유방 종양 조직을 분리하고 앞서12일설명한 바와 같이 유세포분석, 면역형광, 또는 발현 프로파일링(예를 들어, RNA 시퀀싱[RNAseq] 또는 마이크로어레이)에 의해 분석한다.
- 계보 음성 세포에 대한 게이팅에 의한 유동 세포 분석 수행(Lin-: 계보 마커 CD45 [백혈구 마커]), CD31 [내피 세포 마커], 및 TER119 [적혈구 마커]에 따라 종양내 세포를 분석합니다. YFP, CD24 및 CD29의 표현.
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Representative Results
R26Y 및 Trp53L 대두에 대한 대표적인 PCR 지질형 검사 결과는 도1에 나타내고 있다.
원칙적으로, 모든 10개의 MGs는 모두 경감 내 주사 절차를 실시할 수 있지만, 실질적으로, 두 개의 제4 인큐니탈 MG는 일반적으로주입을 위해 선택되며, 이는 그들의 접근성및 더 큰 MG 크기(도 2)로 인해 선택된다. 수술 중, 소독되고 깔끔한 작업 영역을 유지하고 멸균 도구로 절차를 수행하는 것이중요합니다 (그림 3). 자궁 내 주사 동안, 주사 혼합물에 청색 염료(예를 들어, 브로모페놀 블루)를 포함시키는 것은 전체 덕트 트리내로 Ad-Cre의 성공적인 주입을 시각화하는 데 도움이 된다(그림 4). 가장 어린 암컷 마우스는 (주사 혼합물의 더 작은 부피가) 성공적으로 수행 될 수있는 것은 ~3 주 (그림 4A)이지만 대부분의 유방 종양 유도 실험의 경우 젊은 성인 여성 마우스입니다. (예를 들어, 2개월)은 통상적으로 사용된다(도4B). 또한, 자궁 내 주사(주사 혼합물의 더 큰 부피)는 또한 폐포 세포를 표적으로 하는 초기/중간 임신도중 여성 마우스에서 수행될 수 있다(도 4C).
우리의 경험에서, R26Y 리포터와 Trp53L/L (또는 추가 조건부 대립 조절없이) 마우스에서, Cre-mediaed 재조합은 Trp53 조건부 녹아웃 대립 계열 (및 추가 조건부 녹아웃 대립 구슬을 사용 하 고, 한편, YFP 리포터를 켜 (R26Y 대립 계에서, 뿐만 아니라 어떤 추가 조건부 노크-인 대립 구 슬 레이에서, 사용 하는 경우). 유방 종양 유도에 대해 상이한 MEC 소집단을 표적으로 하기 위해, 상이한 MEC 서브세트 특이적프로모터의 제어 하에 Ad-Cre 바이러스가 주사를 위해 사용되었다(도 5). 예를 들어, 케라틴8(Krt8)프로모터(Ad-K8-Cre)의 제어 하에 Ad-Cre를 사용하여 발광 MEC를 표적화하였다. 이전에는 기저 MECs 13을 대상으로 케라틴 14(Krt14) 프로모터(Ad-K14-Cre)의 제어하에Ad-Cre의 사용을 보고하였다. 그러나, 우리가 보고 한 바와 같이, Ad-K14-Cre의 경막 주사는 기저 MEC뿐만 아니라 발광 MEC13의일부를 대상으로합니다. 최근 케라틴 5(Krt5) 프로모터(Ad-K5-Cre)의 제어하에 또 다른 Ad-Cre를 테스트한 결과, 기저 계보를 보다 엄격하게 표적으로 삼을 수 있다는 것을 발견하였고, 이는 기저 MECs만의 유전자 마킹으로 이어진다(그림5). Ad-K8-Cre 또는 Ad-K5-Cre 주입에서 YFP 표시 MEC의 일반적인 백분율은 약 0.1%-1%.
Trp53L /L의경우; R26Y 암컷 마우스는 FVB 유전적 배경 하에서, 그들의 발광 MEC를 표적으로 하는 Ad-K8-Cre의경내 주사는, 주사 후에 몇 달 유방 종양의 발달로 이끌어 냈다 (그림6A). 상이한 유전적 배경을 가진 마우스(예를 들어, C57/B6)는 주사 후 유방 종양 발병의 더 긴 대기 시간을 나타낼 수 있다. 조건부 R26Y 리포터의 포함으로 인해, 종양 상피 세포는 전형적으로 YFP에 의해 표시되었고 유세포측정에 의해 검출될 수 있었다(도6B); 추가 분석을 위해 YFP+ 세포의 흐름 분류에 의해 농축 될 수 있습니다.
도 1: R26Y 및 Trp53L 알레에 대한 대표적인 PCR 지질검사 결과. WT = 와일드 타입; 호모 = 동종 화자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MG에 Ad-Cre 바이러스의 내부 주입의 개략도. (A) 두 개의 네 번째 MGs 사이의 중간선에 절개 부위(B) 파란색 염료(더 나은 시각화를 위해)로 Ad-Cre의 내막 주사를 제4 MGs 중 하나에 삽입하였다. (C) 상처 클립에 의한 피부 내 절개 폐쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 설치류 수술에 대한 무균 설정 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 전체 유방 덕트 트리에 성공적인 자궁 내 주사의 시각화. (A) 3주령 암컷 마우스의 MG내로 주사 혼합물(브로모페놀 블루)의 3 μL의 내주사의 예. (B) 젊은 성인 여성 마우스의 MG에 주입 혼합물의 5 μL의 경막 주사. (C) 임신 초기/중간 임신 시 암컷 마우스의 MG에 10 μL의 주입 혼합물을 주입합니다. (D) 유방 지방 패드 주사의 예는 성공적인 자궁 내 주사가 아닌. 젊은 성인 여성 마우스의 MG에 주입 혼합물의 5 μL의 경내 주입. (a) 주입된 젖꼭지를 둘러싼 피부 부위; (b) 유방 지방 패드를 나타내는 피부 플랩의 다른 쪽; 노란색 원은 염료가 지방 패드로 확산되는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 연내 주입 시 YFP 표시 세포의 유동 세포 분석의 대표적인 플롯. R26Y 처녀 여성의 MGs에서 YFP+ 인구 3 Ad-K8-Cre의 내부 주입 후 일 (왼쪽, 7 x 109 pfu/mL의 역가에 주입) 또는 Ad-K5-Cre (오른쪽, 7.86 x 109 pfu/ mL) 바이러스. 플롯은 계보-음수(Lin- 즉, CD45, CD31 및TER119 발현에 대한 음수) YFP+ 셀에서 CD24 및 CD29 염색의 분석을 기반으로 한다. 루 = 린-CD24높은CD29 저휘도 MEC 게이트; Ba = 린-CD24낮은CD29높은 기저 MEC 게이트; 발광 및 기저 MEC에 대한 게이팅 전략은 Shackleton 외15를기반으로합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: Trp53L/L에서종양 개발; R26Y 암컷 마우스는 Ad-K8-Cre를내덕으로 주입하였다. (a) A-K8-Cre를주사한 후 몇 달 후 종양 성장(화살표)을 나타내는 대표적인 마우스. (b) 대표적인 종양으로부터의 살아있는 세포(DAPI 염색에 기초)의 약 8.8%가 유세포분석결과에 기초하여 YFP 발현에 대해 양성이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
MECs의 다른 하위 집단에서 유방 종양을 유도하기위한이 접근법의 성공은 적절한 세포 유형 특이적 프로모터를 선택하는 것뿐만 아니라 (Cre 발현을 유도하기 위해) 뿐만 아니라 자궁 내 주사 절차 자체에 의존합니다. 이 접근의 뒤에 아이디어는 주입된 Ad-Cre 바이러스가 루멘을 가진 은폐한 구조물인 덕트 트리에서 유지된다는 것입니다, 그러므로, 단지 MECs는 바이러스에 드러내고 Ad-Cre에 의해 감염됩니다. 유방 덕트 내의 제한된 루멘 공간으로 인해 각 MG (즉, ~ 3-5 μL)에 주사 혼합물의 소량만 주입하는 것이 중요합니다. 주입된 부피는 또한 마우스의 나이에 따라 조정되어야 한다(즉, 3-4주령 마우스에 주입될 때 더 작은 부피를 사용해야 한다). 주입된 액체의 부피가 주입 및 제한된 덕트 루멘 공간에서의 압력으로 인해 과도할 때, 유체는 기질로 상피 층을 통해 "밀려나게"될 수 있으며, 기질 세포에서 원치 않는 바이러스 감염으로 이어질 수 있습니다.
세포형 특이성은 Cre 발현을 유도하기 위해 아데노바이러스 벡터에 사용되는 프로모터에 의해 달성되기 때문에, 이러한 접근법의 한계는 특정 MEC 소집단에 대한 Cre 발현을 표적화하는 적절한 프로모터의 잠재적 부족이다. 우리는 이전에 발광 MECs12,13 및 폐포 광도 선조를 대상으로 Ad-Wap-Cre 바이러스의 사용을 대상으로 팬 발광 Ad-K8-Cre 바이러스의 사용을보고했다5. 본 연구에서는, 기저 MECs를 표적으로 하는 Ad-K5-Cre 바이러스의 사용을 보여주었다(그림 5). 우리는 아직도 에스트로겐 수용체 양성 광도 MEC 소집단을 표적으로 하기 위하여 이 접근을 사용하는 기능이 부족합니다. 우리가 여기에서 사용한 아데노바이러스 벡터는 최대 8kb의 삽입을 수용할 수 있었습니다. 따라서, MEC 서브셋 특이적 Ad-Cre를 개발하기 위해, Cre 발현을 구동하는 데 사용되는 프로모터는 7 kb 미만일 수 있었다. 실질적으로, 큰 프로모터 단편은 크기가 7 kb 미만이라 하더라도, 서브클론하기 어려울 수 있다. 아데노바이러스 벡터에 맞추기 위해, 잘린 프로모터가 사용될 수 있지만, 내인성, 완전 프로모터의 통제 하에 있을 때 그의 상응하는 유전자의 발현 패턴을 충실하게 되풀이하지 않을 수 있다.
여기에 마우스 모델에 포함된 R26Y 조건부 리포터는 기원의 세포를 표시하고 암세포로의 진행을 추적하는 방법을 제공하였다. 참고로, 생성된 종양에서 YFP 표시 암세포의 백분율은 상당히낮은 것으로 나타났다(도 6B). 이것은 YFP 표시한 종양 상피 세포 이외에, 종양이 또한 종양 질량의 대량을 구성하는 많은 면역 세포 및 기질 세포를 포함할 가능성 때문일 수 있었습니다.
유방암의 다른 마우스 모델과 비교하여, 이 접근법은 소수의 MECs(예를 들어, Ad-K8-Cre가 주입될 때 발광 MECs)로부터 유방 종양 개시를 종종 클론 수준12에서유도한다. 인간 종양 발생의 개시가 클로나일 가능성이 높기 때문에, 이 접근법은 인간 암 발달의 그 양상을 더 충실하게 되풀이합니다. 또한, p53이 소수의 MEC에서만 중단되더라도 p53의 손실은 클론 확장으로 이어져 돌연변이 된 MEC의 더 큰 풀을 생산합니다. 이것은 p53 결핍 MECs (추가 체세포 돌연변이의 취득시)에서 추가 클론 진화를 허용할 것입니다12. TP53은 인간 유방암16에서 가장 일반적으로 돌연변이된 유전자이며 TP53 돌연변이는 인간 유방 종양발생17,18에서초기 사건이기 때문에, Trp53 플럭스마우스 모델을 마우스와 결합시킴으로써 그밖 종양 발생 사건을 위한 모형은, 우리는 이 종양 발생 사건이 p53 손실과 어떻게 협력하는지 그리고 정의된 세포 기원에서 유방 종양 발달에 어떻게 공동으로 기여하는지 연구할 수 있습니다. 또한, 여러 개의 알레를 함께 두기 위해 더 적은 번식이 필요하기 때문에, 이 접근법은 사육 비용과 시간을 최소화할 것이며, 이는 더 짧은 기간에 더 큰 규모로 유방암 모델링 연구를 촉진해야 한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (NIH) 교부금 R01 CA222560및 국방부 획기적인 상 W81XWH-18-1-0037에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
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