Summary
L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato sull'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre nelle ghiandole mammarie dei topi. Questo approccio consente la manipolazione sia di tipo cellulare che di un organo degli eventi oncogeni in modo controllato temporaneamente.
Abstract
Il cancro al seno è una malattia eterogenea, probabilmente a causa di complesse interazioni tra diverse cellule di origine ed eventi oncogeni. I modelli di topo sono fondamentali per ottenere informazioni approfondite su questi processi complessi. Sebbene molti modelli murini siano stati sviluppati per studiare i contributi di vari eventi oncogeni e cellule di origine alla tumorigenesi mammaria, questi modelli spesso non sono di tipo cellulare o organo specifico o non possono indurre l'avvio della tumorigenesi mammaria in un modo controllato temporaneamente. Qui descriviamo un protocollo per generare un nuovo tipo di modelli di topo di cancro al seno basati sull'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre (Ad-Cre) nelle ghiandole mammarie del topo (MG). A causa dell'iniezione diretta di Ad-Cre nei dotti mammari, questo approccio è specifico di MG, senza alcuna induzione indesiderata del cancro in altri organi. La procedura di iniezione intraduttiva può essere eseguita nei topi in diverse fasi del loro sviluppo di MG (quindi, permette il controllo temporale dell'induzione del cancro, a partire da 3-4 settimane di età). La specificità del tipo di cellula può essere ottenuta utilizzando diversi promotori specifici del tipo di cellula per guidare l'espressione Cre nel vettore adenovirale. Dimostriamo che le cellule epiteliali mammarie luminali e basali (MEC) possono essere strettamente mirate per la manipolazione genetica basata su Cre/loxP tramite un'iniezione intraduttiva di Ad-Cre sotto il controllo del promotore Keratin 8 o Keratin 5, rispettivamente. Incorporando un reporter Cre condizionale (ad esempio, Reporter Inducibile in Cre/loxP Rosa26-YFP), mostriamo che i MEC presi di mira da Ad-Cre, e le cellule tumorali da essi derivate, possono essere rintracciati seguendo le cellule reporter-positive dopo l'iniezione intraductale.
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di sviluppare un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato su un'iniezione intraduttiva di Ad-Cre nel topo MG. L'approccio genetico basato sulla ricombinazione Cre/loxP è stato ampiamente utilizzato per modellare il cancro al seno umano nei topi. La prima generazione di modelli di topo di carcinoma mammario a base di Cre/loxP viene generata utilizzando topi transgenici che esprimono Cre-expressing sotto il controllo di promotori specifici del MEC (ad esempio, MMTV-Cre per i MEC luminosi e una porzione di MEC basali, Wap-Cre e Blg-Cre per progenitori luminali e MEC luminali alveolar, K14-Cre per basale e una porzione di MEC luminali1,2,3,4,5)6, 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9. , tuttavia, sebbene queste linee transgeniche Del Cre consentano il controllo spaziale dell'espressione Cre (cioè in diversi sottoinsiemi di MEC), non consentono il controllo temporale dell'espressione Cre e della manipolazione genetica mediata da Cre/loxP. La seconda generazione di modelli di topo di carcinoma mammario basati su Cre/loxP utilizza approcci inducibili per l'attività/espressione del creme (ad esempio, l'uso della fusione del recettore Cre-estrogeno [CreER], che può indurre la ricombinazione Cre/loxP solo dopo la somministrazione di tamoxifene) e di conseguenza, questi strumenti genetici consentono controlli spaziali e temporali dell'attivazione di eventi oncogeni nei MEC (ad esempio, modelli basati su K8-CreER- e K5-CreER)10,11,12 . In entrambe le generazioni di modelli di topo di cancro al seno, come promotori utilizzati per guidare l'espressione Cre o CreER (ad esempio, Krt8, Krt5) possono anche essere attivi nelle cellule epiteliali di altri organi (cioè, sono specifiche di tipo di cellula ma non specifiche dell'organo) o hanno un'espressione che perde in tipi di cellule diverse dalle cellule epiteliali (ad esempio, MMTV, che ha un'attività che perde nelle cellule ematopoietiche del midollo osseo), questi approcci possono portare allo sviluppo di tumori indesiderati in altri organi. Se questi tumori inaspettati causano letalità nei topi colpiti, lo scopo originale della modellazione del cancro al seno in questi topi può essere vietato (ad esempio, eventi oncogeni MMTV-Cre-driven può portare a neoplasie ematopoietiche e morte precoce dei topi , a causa della perdita del promotore MMTV nelle cellule ematopoietiche)4.
Qui segnaliamo un approccio di modellazione del cancro al seno nei topi che consente la manipolazione sia tipo di cellula che organo-specifica degli eventi oncogeni in modo controllato materialmente. Questo approccio si basa su un'iniezione intraduttiva di Ad-Cre nelle MG del topo (ed è, quindi, specifico dell'organo). L'espressione del creme può essere controllata utilizzando diversi promotori specifici del MEC incorporati nel vettore adenovirale (ad esempio, Krt8 per MEC luminali, Krt5 per i MEC basali, ottenendo così la specificità del tipo di cellula). L'induzione del cancro nelle MG può essere controllata temporaneamente mediante un'iniezione di Ad-Cre nei topi di età diverse, a partire da 3-4 settimane di età (pageratale) allo stadio adulto.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) di Brigham e Women's Hospital.
1. Generazione e manutenzione di topi sxed
- Ottenere il knockout condizionale flossed rilevante per il cancro al seno (ad esempio, Trp53tm1Brn [noto come Trp53L/L], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) o linee di topo knock-in condizionali (ad esempio, Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca-H1047R)Egan) dal repository del Jackson Laboratory (JAX) o del NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium (MMHCC). Inoltre, per facilitare la ricerca di MEC che subiscono una ricombinazione mediata da Cre, una linea condizionale Cre-reporter può essere ottenuta anche da JAX (ad esempio, Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [indicato come R26Y]).
- Alleva topi omozygosi Trp53L/L con topi reporter omozici R26Y o con topi omozici che trasportano gli alleluci del reporter R26Y e qualsiasi ulteriore knockout condizionale scisso o alleli knock-in per diversi modelli murini, per ottenere la progenie maschile e femminile di F1.
- I topi maschi e femmine intercross ehetozigous F1 per ottenere topi femminili composti F2 che sono omozici per ogni allele (come topi sperimentali), così come le femmine omozygous R26Y-solo omozygous (come topi di controllo). I topi Genotipo F2 basati sui primer PCR e sulle condizioni di ciclismo elencati di seguito, impostando due reazioni PCR standard da 20 ll (utilizzando Taq 5X Master Mix) in due diversi tubi PCR, uno con i primer R26Y e l'altro con il Trp53L primer. Utilizzare topi adulti (in genere tra i 2 e i 4 mesi) per tutti gli allevamenti.
- Per R26Y, eseguire la PCR a 94 gradi centigradi per 3 min, quindi a 94 gradi centigradi per 30 s, 60 gradi centigradi per 30 s e 72 s per 1 min per 35 cicli, seguiti da 72 gradi centigradi per 3 min e mantenendo a 14 gradi centigradi. Utilizzare primer (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
NOTA: una singola banda PCR di 250 bp indica un omozigote R26Y, una singola banda PCR di 500 bp indica un tipo selvaggio (WT) e due bande PCR (R26Y: 250 bp, WT: 500 bp) indicano un R26Y heterozygote (Figura 1A).
Per Trp53L, eseguire la PCR a 94 gradi centigradi per 3 min, quindi a 94 gradi centigradi per 30 s, 60 gradi centigradi per 30 s e 72 s per 1 min per 35 cicli, seguiti da 72 gradi centigradi per 3 min e mantenendo a 14 gradi. Utilizzare primer (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
NOTA: una singola banda PCR di 370 bp indica un omoytàgote Trp53L/L, una singola banda PCR di 288 bp indica un Trp53 // eterozygote (Figura 1B).
- Per R26Y, eseguire la PCR a 94 gradi centigradi per 3 min, quindi a 94 gradi centigradi per 30 s, 60 gradi centigradi per 30 s e 72 s per 1 min per 35 cicli, seguiti da 72 gradi centigradi per 3 min e mantenendo a 14 gradi centigradi. Utilizzare primer (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
2. Preparazione preoperatoria
- Autoclave tutti gli strumenti chirurgici 1 giorno prima dell'intervento chirurgico.
- Preparare lo 0,1% blu bromofenolo in salina con buffer fosfato (PBS) e conservarlo a 4 gradi centigradi. Diluire l'Ad-Cre che verrà utilizzato per l'iniezione intraducttale nel mezzo DMEM con 0,01 M CaCl2 e bromofenolo blu ad un rapporto di 1:10 (cioè la miscela di iniezione).
NOTA: L'Ad-Cre utilizzato qui è stato ottenuto dall'Università dell'IowaViral Vector Core, con un titolo di titoli a titolo virale di 10 -1011 dollari pfu/mL. - Anestesizzare il topo femminile (generazione F2 come descritto nel passaggio 1.2, età che vanno da 3 a 4 settimane di età per adulto) utilizzando una camera isoflurane e applicare unguento per gli occhi. Durante la procedura, anestesizzare il topo continuamente assicurandosi inala 1–2,5% isoflurane in ossigeno. Controllare la profondità dell'anestesia almeno ogni 15 min eseguendo un pizzico di punta. Monitorare attentamente il mouse per qualsiasi cambiamento della frequenza respiratoria, regolando il livello di isoflurane di conseguenza, se necessario.
- Iniettare la melossia come analgesia sottocutaneamente ad una dose di 5 mg/kg, prima della procedura chirurgica.
- Esporre il sito chirurgico capezzolo applicando diverse gocce di crema per la rimozione dei peli; rimuovere la crema eccessiva e i capelli sciolti con asciugamani morbidi di carta.
NOTA: Eseguire questo passaggio in un'area separata da quella in cui deve essere eseguito l'intervento chirurgico. La rasatura non è raccomandata per evitare danni ai capezzoli. Prestare attenzione per rimuovere l'agente depilatorio chimico in modo tempestivo. Lasciare l'agente acceso troppo a lungo può provocare ustioni chimiche sulla pelle - Disinfettare prima il sito chirurgico con iodofori, seguito dal 70% di alcol, e terminare con un'applicazione finale di scrub iodophors. Fate questo in un movimento circolare dal centro dell'area di lavoro verso la periferia utilizzando una spugna di garza o applicatore con punta di cotone. Ripetere il ciclo 3x–4x.
3. Iniezione intraduttiva
- Utilizzare tecniche asettiche per tutta la procedura chirurgica.
- Fare un sito di incisione sulla pelle ad una lunghezza di 1 cm tra i due quattro MG inguinali (Figura 2). Separare con cura il lembo della pelle (con la MG) dal peritoneo parietale in modo da visualizzare l'albero duttale mammario.
- Tenere con attenzione il capezzolo con le pinze del Orologiaio e rimuovere il capezzolo esterno senza tagliare la pelle vicina, utilizzando una forbice a micro-dissezione.
- Caricare il numero di 3-5 dollari di miscela di iniezione Ad-Cre in una siringa Hamilton da 25 litri con un ago a viscito metallico da 33 G. Stimare il volume della miscela di iniezione nella siringa in base al colorante blu incluso nella miscela.
NOTA: Utilizzare un volume più piccolo (ad es., 3 o L) quando si iniettano in MG di femmine di 3-4 settimane e un volume maggiore (ad esempio, 10 l) quando si iniettano in MG di femmine che allattano. - Tenere delicatamente il bordo del lembo della pelle con una pinzetta curva fine e iniettare lentamente la miscela di iniezione Ad-Cre nel capezzolo, monitorando nel frattempo la diffusione del colorante blu nell'albero duttale di mammiferi. Mantenere il tasso di iniezione il più basso possibile per evitare danni al lume duttale.
NOTA: il liquido iniettato (come illustrato dal colorante blu bromofenolo incluso) che si diffonde in tutto l'albero duttale senza fuoriuscire nel compartimento stroforme indica un'iniezione intraducttale di successo. - Ritirare delicatamente l'ago dal capezzolo per evitare perdite del liquido iniettato.
- Esaminare il lato distale (cioè lontano dal capezzolo) della MG o l'area circostante del capezzolo iniettato. Si noti che gonfiore tintura blu (cioè, colorante diffusione nel vicino stroma) indica un'iniezione di grasso mammario piuttosto che un'iniezione intraduttiva di successo.
- Chiudere le ferite chirurgiche (dal punto 3.2) nella pelle con le clip della ferita.
4. Assistenza postoperatoria
- Rimuovere il mouse dall'anestesia e posizionarlo su una piastra di riscaldamento all'interno di una gabbia pulita per il recupero.
- Somministrare la melossicama sottocutaneamente a 5 mg/kg di nuovo, 24 h dopo l'intervento chirurgico.
- Monitorare le condizioni generali dell'animale e cercare segni di infezione nel sito di incisione per 5 giorni.
- Le clip della ferita vengono rimosse 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
5. Monitoraggio dello sviluppo del tumore mammario
- Monitorare i topi iniettati due volte alla settimana dalla palpazione per qualsiasi segno di sviluppo del tumore mammario.
- Una volta che il tumore è palpabile, monitorare il topo ogni giorno e misurare la dimensione del tumore fino a raggiungere l'endpoint sperimentale, come determinato dalla dimensione (ad esempio, raggiungendo il 10–15% del peso corporeo del topo) o dalla condizione (ad esempio, ulcerata o necrotica) del tumore, o dal condizioni di salute generali del topo (ad es. comatosi, moribond).
- Eutanasia il topo per asfissia di anidride carbonica, seguita da un metodo secondario (ad esempio, lussazione cervicale).
- Isolare i tessuti tumorali mammari e analizzarli per citometria di flusso, immunofluorescenza o profilazione dell'espressione (ad esempio, mediante sequenziamento dell'RNA [RNAseq] o microarray), come descritto in precedenza12.
- Eseguire l'analisi citometrica del flusso mediante l'analisi per le cellule negative del lignaggio (Lin-: negativo per i marcatori di lignaggio CD45 [marcatore leubucito], CD31 [marcatore di cellule endoteliali]e TER119 [marcatore di eritrocite]) e analizzare le cellule nel tumore in base alla loro espressione di YFP, CD24 e CD29.
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Representative Results
I risultati di genotipizzazione PCR rappresentativi per gli alleli R26Y e Trp53L sono illustrati nella Figura 1.
Anche se, in linea di principio, tutti i 10 MG possono essere sottoposti alla procedura di iniezione intraducttale, praticamente, i due quattro MG inguinali sono tipicamente selezionati per l'iniezione, a causa della loro accessibilità più facile e di dimensioni più grandi di MG (Figura 2). Durante l'intervento chirurgico, è importante mantenere un'area di lavoro disinfettata e ordinata ed eseguire la procedura con strumenti sterili (Figura 3). Durante l'iniezione intraducttale, l'inclusione di un colorante blu (ad esempio, blu bromofeno) nella miscela di iniezione aiuta la visualizzazione di un'iniezione di successo di Ad-Cre nell'intero albero duttale (Figura 4). I topi femminili più giovani in cui l'iniezione intraducttale (con un volume inferiore della miscela di iniezione) può essere eseguita con successo sono quelli a 3 settimane di età (Figura 4A),anche se per la maggior parte degli esperimenti di induzione del tumore mammario, topi femmine giovani adulti (ad esempio, 2 mesi di età) vengono in genere utilizzati (Figura 4B). Inoltre, l'iniezione intraduttiva (con un volume maggiore della miscela di iniezione) può essere eseguita anche nei topi femminili durante la gestazione precoce/media per colpire le cellule alveolare (Figura 4C).
Nella nostra esperienza, nei topi con il reporter R26Y e Trp53L/L (con o senza alleli condizionali aggiuntivi), la ricombinazione mediata da Cre ha interrotto le alleli da knockout condizionale Trp53 (e alleli knockout condizionali, se utilizzati) e, nel frattempo, ha acceso il reporter YFP (dall'allele R26Y, così come da qualsiasi allele knock-in condizionale aggiuntivo, se usato). Per colpire diverse sottopopolazioni MEC per l'induzione di tumori mammari, sono stati utilizzati virus Ad-Cre sotto il controllo di diversi promotori specifici del sottoinsieme MEC per l'iniezione (Figura 5). Ad-Cre, ad esempio sotto il controllo di Keratin 8 (Krt8) promotore (Ad-K8-Cre) è stato utilizzato per indirizzare i MEC luminali. In precedenza, abbiamo segnalato l'uso di Ad-Cre sotto il controllo del promotore Keratin 14 (Krt14) (Ad-K14-Cre) per indirizzare i MEC basali13. Tuttavia, come abbiamo riferito, iniezione intraducttale di Ad-K14-Cre non solo mirato meC basali, ma anche una porzione di MEC luminali13. Recentemente abbiamo testato un altro Ad-Cre sotto il controllo di Keratin 5 (Krt5) promotore (Ad-K5-Cre)14 e abbiamo scoperto che può indirizzare più strettamente il lignaggio basale, portando alla marcatura genetica dei MEC basali (Figura 5). Le percentuali tipiche di MEC marcati da YFP dall'iniezione Ad-K8-Cre o Ad-K5-Cre sono di circa lo 0,1%-1%.
Per Trp53L/L; Topi donne R26Y sotto il background genetico FVB, l'iniezione intraducttale di Ad-K8-Cre, che si rivolge ai loro MEC luminosi, ha portato allo sviluppo di tumori mammari diversi mesi dopo l'iniezione (Figura 6A). I topi con un background genetico diverso (ad esempio, C57/B6) possono presentare una latenza più lunga dello sviluppo di tumori mammari dopo l'iniezione. A causa dell'inclusione del reporter condizionale R26Y, le cellule epiteliali tumorali erano tipicamente contrassegnate da YFP e potevano essere rilevate dalla citometria di flusso (Figura 6B); potrebbero essere arricchiti dal flow-sorting delle cellule YFP per ulteriori analisi.
Figura 1: Risultati di genotipizzazione PCR rappresentativi per gli alleli R26Y e Trp53 L. WT - di tipo selvaggio; Homo - omozigote. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagramma schematico dell'iniezione intraduttiva del virus Ad-Cre in un MG. (A) Sito di incisione nella linea mediana tra i due quattro MG. (B) Iniezione intraducttale di Ad-Cre con un colorante blu (per una migliore visualizzazione) in uno dei quattro MgM. (C) Chiusura dell'incisione nella pelle da clip di ferita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Panoramica dell'impostazione asettica per la chirurgia dei roditori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Visualizzazione di un'iniezione intraducttale di successo nell'intero albero duttale di mammiferi. (A) Un esempio dell'iniezione intraducttale di 3 - L di miscela di iniezione (con blu bromofenolo) in un MG di un topo femmina di 3 settimane. (B) Iniezione intraduttiva di 5 - L di miscela di iniezione in un MG di un topo femmina giovane adulta. (C) Iniezione intraduttiva di 10 - L di miscela di iniezione in un MG di un topo femmina a prima /metà gestazione. (D) Un esempio di iniezione di grasso mammario piuttosto che di un'iniezione intraducttale di successo. Iniezione intraduttiva di 5 - L di miscela di iniezione in un MG di un topo femmina giovane adulto. a) L'area della pelle che circonda il capezzolo iniettato; b) L'altro lato del lembo della pelle che mostra il cuscinetto di grasso mammario; cerchio giallo indica coloranti diffusi nel tampone grasso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Grafici rappresentativi dell'analisi citometrica del flusso delle cellule marcate con YFP dopo l'iniezione intraduttiva. YFP- popolazioni da MG di R26Y femmine vergini 3 giorni dopo un'iniezione intraduttiva di Ad-K8-Cre (sinistra, iniezione in un timore di 7 x 109 pfu/mL) o Ad-K5-Cre (destra, iniezione in un titro di 7,86 x 109 pfu/ mL) virus. I grafici si basano su un'analisi della colorazione CD24 e CD29 in lignaggio negativo (Lin-, cioè, negativo per le celle CD45, CD31 e TER119) YFP. Lu - Lin-CD24altoCD29basso livello MEC cancello; Ba - Lin-CD24bassoCD29cancello AD alta basale MEC; la strategia di gating per i MEC luminali ebasali si basa su Shackleton et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Sviluppo del tumore in Trp53L/L; R26Y topi femminili intraduttivainamente iniettati con Ad-K8-Cre. (A) Un topo rappresentativo che mostra la crescita tumorale (frecce) diversi mesi dopo un'iniezione con Ad-K8-Cre. (B) Circa l'8,8% delle cellule vive (sulla base della colorazione DAPI) da un tumore rappresentativo è risultato positivo all'espressione YFP, sulla base dell'analisi citometrica del flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il successo di questo approccio per indurre tumori mammari provenienti da diverse sottopopolazioni di MEC si basa non solo sulla scelta di promotori specifici del tipo di cellula appropriati (per guidare l'espressione Cre), ma anche sulla procedura di iniezione intraduttiva stessa. L'idea alla base di questo approccio è che i virus Ad-Cre iniettati sono conservati nell'albero duttale, che è una struttura nascosta con lumen, e quindi, solo i MEC sono esposti ai virus e sono infettati da Ad-Cre. A causa dello spazio limitato del lume all'interno dei dotti mammari, è importante iniettare solo un piccolo volume della miscela di iniezione ad ogni MG (cioè, 3-5 dollari l. Il volume iniettato deve anche essere regolato in base all'età dei topi (cioè, un volume più piccolo deve essere utilizzato quando viene iniettato in topi di 3-4 settimane). Quando il volume del liquido iniettato è eccessivo a causa della pressione dell'iniezione e dello spazio limitato del lume duttale, il fluido può essere "spinto" attraverso gli strati epiteliali nello stroma, portando a un'infezione virale indesiderata nelle cellule stromali.
Poiché la specificità del tipo di cellula è raggiunta dal promotore utilizzato nel vettore adenovirale per guidare l'espressione Cre, una limitazione di questo approccio è la potenziale mancanza di un promotore appropriato per indirizzare l'espressione Cre a una sottopopolazione MEC specifica. In precedenza abbiamo segnalato l'uso del virus Ad-K8-Cre pan-luminale per colpire i MEC luminali12,13 e l'uso del virus Ad-Wap-Cre per colpire i progenitori luminosi alveolar5. In questo studio, abbiamo mostrato l'uso del virus Ad-K5-Cre per indirizzare i MEC basali (Figura 5). Manca ancora la capacità di utilizzare questo approccio per indirizzare la sottopopolazione LUMinal MEC positiva del recettore estrogeno. Il vettore adenovirale che abbiamo usato qui potrebbe ospitare un inserto fino a 8 kb. Pertanto, per sviluppare Ad-Cre specifico del sottoinsieme di MEC, il promotore utilizzato per guidare l'espressione Cre non può che essere inferiore a 7 kb. In pratica, un grande frammento promotore, anche se di dimensioni inferiori a 7 kb, può essere difficile da sottoclone. Al fine di adattarsi al vettore adenovirale, anche se un promotore troncato può essere utilizzato, non può ricapitolare fedelmente il modello di espressione del suo gene corrispondente quando sotto il controllo del promotore endogeno e pieno.
Il reporter condizionale R26Y incluso nel modello murino qui ha fornito un modo per contrassegnare le cellule di origine e tracciare la loro progressione alle cellule tumorali. Da notare che la percentuale di cellule tumorali marcate da YFP nel tumore risultante sembrava essere abbastanza bassa (Figura 6B). Ciò potrebbe essere dovuto alla possibilità che, oltre alle cellule epiteliali tumorali marcate da YFP, il tumore includesse anche molte cellule immunitarie e cellule stromali, che costituivano la maggior parte della massa tumorale.
Rispetto ad altri modelli murini di cancro al seno, questo approccio porta all'avvio del tumore mammario da un piccolo numero di MEC (ad esempio, MEC luminosi quando Ad-K8-Cre viene iniettato), spesso a un livello clonale12. Poiché l'avvio della tumoralgenesi umana è probabilmente clonale, questo approccio riassume più fedelmente questo aspetto dello sviluppo del cancro umano. Inoltre, anche quando p53 viene interrotto solo in un piccolo numero di MEC, la perdita di p53 porta alla loro espansione clonale, portando alla produzione di un pool più ampio di MEC mutati; ciò consentirebbe un'ulteriore evoluzione clonale dai p53-deficient MEC (al momento dell'acquisizione di ulteriori mutazioni somatiche)12. Poiché il TP53 è il gene più comunemente mutato nel cancro al seno umano16 e poiché la mutazione TP53 è un evento precoce nella tumorigenesi mammaria umana17,18, combinando il modello murino fliledT Trp53 con il topo modelli per altri eventi oncogeni, possiamo studiare come questi eventi oncogeni cooperano con la perdita di p53 e come contribuiscono congiuntamente allo sviluppo del tumore mammario da un'origine cellulare definita. Inoltre, poiché è necessario un minor allevamento per mettere insieme più alleli, questo approccio ridurrebbe al minimo i costi di allevamento e il tempo, il che dovrebbe facilitare gli studi di modellazione del cancro al seno su scala più ampia, in un periodo più breve.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla concessione R01 CA222560 dei National Institutes of Health (NIH) e dal Department of Defense Breakthrough Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
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