Summary
该协议的目的是描述一种新的乳腺癌建模方法,该方法基于将Cre-表达腺病毒注射到小鼠乳腺的电位内。这种方法允许以时间控制的方式对致癌事件进行细胞型和器官特异性操作。
Abstract
乳腺癌是一种异质疾病,可能是由于不同来源细胞和致癌事件之间的复杂相互作用。鼠标模型有助于深入了解这些复杂过程。虽然已经开发了许多小鼠模型来研究各种致癌事件和原源细胞对乳腺肿瘤发生的贡献,但这些模型往往不是细胞型或器官特异性的,或者不能诱导乳腺肿瘤的启动。时间控制的方式。在这里,我们描述了一个协议,以生成一种新型的乳腺癌小鼠模型,基于在电感中注射Cre-表达腺病毒(Ad-Cre)到小鼠乳腺(Mg)。由于直接将 Ad-Cre 注射到乳腺导管中,这种方法是 MG 特异性,在其他器官中没有任何不需要的癌症诱导。内导注射程序可以在小鼠MG发育的不同阶段进行(因此,它允许从3-4周起对癌症诱导进行时间控制)。细胞类型特异性可以通过使用不同的细胞类型特异性启动子来驱动腺病毒载体中的Cre表达。我们表明,在角蛋白8或角蛋白5促进剂的控制下,通过Ad-Cre的内导注射,可以紧紧围绕基于Cre/loxP的基因操作的发光和基底乳腺上皮细胞(MECs)。通过合并有条件的Cre报告器(例如,Cre/loxP诱导的Rosa26-YFP报告),我们表明Ad-Cre所针对的MECs和从它们中提取的肿瘤细胞,可以通过在电内注射后跟踪报告者阳性细胞来追踪。
Introduction
该方法的总体目标是开发一种新的乳腺癌建模方法,该方法基于在小鼠MG中注射Ad-Cre的电位内。基于Cre/loxP重组的遗传方法已被广泛用于模拟小鼠的人类乳腺癌。第一代基于Cre/loxP的乳腺癌小鼠模型是通过使用Cre-表达转基因小鼠在MEC特异性促进因素(例如,发光MEC的MMTV-Cre和部分基础MEC,Wap-Cre和Blg-Cre用于发光祖和阿尔维拉尔发光 MEC,K14-Cre 用于基础和部分灯具 MECs1,2,3,4,5)6,7,8,9.然而,虽然这些Cre转基因线能够对Cre表达进行空间控制(即,在MECs的不同子集中),但它们不允许对Cre表达和Cre/loxP介导的基因操作进行时间控制。第二代基于Cre/loxP的乳腺癌小鼠模型采用诱导的Cre活性/表达方法(例如,使用Cre-雌激素受体融合[CreER],在服用他莫西芬时只能诱导Cre/loxP重组),以及因此,这些遗传工具允许空间和时间控制在MECs(例如,K8-CreER-和K5-CreER为基础的模型)10、11、12中致癌事件的激活.在两代的乳腺癌小鼠模型中,作为驱动Cre或CreER表达的启动子(例如,Krt8,Krt5)也可能活跃在其他器官的上皮细胞中(即,它们是细胞型特异性,但不是器官特异性)或在上皮细胞以外的细胞类型中具有泄漏的表达(例如,MMTV,在骨髓造血细胞中具有泄漏活性),这些方法可能导致其他器官中不需要的癌症的发展。如果这些意外癌症导致受影响的小鼠致命性,则可能禁止对这些小鼠进行乳腺癌建模的最初目的(例如,MMTV-Cre驱动的致癌事件可能导致造血恶性肿瘤和小鼠过早死亡,由于造血细胞中MMTV启动子的泄漏4。
在这里,我们报道了小鼠的乳腺癌建模方法,该方法允许以时间控制的方式对致癌事件进行细胞型和器官特异性操作。这种方法基于将 Ad-Cre 注射到小鼠 MG 中(因此,是特定于器官的)。Cre表达可以通过使用嵌入在腺病毒载体中的不同MEC亚群特异性启动子(例如,Krt8用于发光MEC,Krt5用于基基MEC,从而达到细胞类型特异性)进行控制。通过在不同年龄的小鼠中注射 Ad-Cre,从 3-4 周(青春期)到成人阶段,MG 中的癌症诱导可以暂时控制。
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Protocol
此处描述的所有方法均已获得布里格姆和妇女医院的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。
1. 浮花小鼠的生成与维持
- 获得与乳腺癌相关的絮凝条件敲除(例如,Trp53tm1Brn [称为Trp53 L/L]、Brca1 tm1Aash [Brca1L/L])或条件敲撞鼠标线(例如,Gt(ROSA)26Sortm1(皮克3卡+H1047R)伊根)来自杰克逊实验室(JAX)或NCI人类癌症联盟(MMHCC)实验室的小鼠模型。此外,为了便于对经过 Cre 介的重组的 MEC 进行跟踪,还可以从 JAX 获得有条件的 Cre-报告线(例如,Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [称为R26Y])。
- 品种Trp53L/L同源小鼠与R26Y同源式报告小鼠或与同源小鼠携带R26Y报告等位乐和任何额外的 flox 条件敲除或敲击等位器为不同鼠标模型,以获得异体F1的男性和女性后代。
- 交叉杂合F1雄性小鼠和雌性小鼠获得F2复合雌性小鼠,每个等位基因(作为实验小鼠)以及R26Y-仅同源雌性小鼠(作为对照小鼠)。基于下面列出的PCR引材和循环条件的基因型F2小鼠,通过在两个不同的PCR管中设置两个标准的20μLPCR反应(使用Taq 5X主混合),一个与R26Y引源,另一个与Trp53L引注。使用成年小鼠(通常约2-4个月大)进行所有繁殖。
- 对于R26Y,在 94°C 下执行 PCR 3 分钟,然后在 94°C 下执行 30 秒,在 94°C 下执行 PCR,30 秒执行 60°C,在 35 个周期中执行 72°C 1 分钟,然后 72°C 3 分钟,并保持在 14°C。使用引物 (i) R26YFP-1: AAA GTC GTT GTG AGT TGT TAT;(二) R26YFP-2:GCG AAG AGT TG TCC TCA ACC;(三) R26YFP-3:GGA GCG GGA GAA ATG ATAT ATG。
注: 单个 PCR 波段 250 bp 表示R26Y同源体,单个 PCR 波段 500 bp 表示野生型 (WT),两个 PCR 波段(R26Y : 250 bp,WT: 500 bp)表示R26Y异构体(图 1A)。
对于Trp53L,在 94°C 下执行 PCR 3 分钟,然后在 94°C 下执行 30 秒,在 94°C 下执行 PCR,30 秒执行 60°C,在 35 个周期中执行 72°C 1 分钟,然后 72°C 3 分钟,并保持在 14°C。使用引基 (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG AGG AAC AAC CCA G;(二) p53F2-10 1R: AGC ACA GAG GCA GAG 交流。
注: 单个 PCR 频带 370 bp 表示Trp53L/L同源,单个 PCR 频带 288 bp 表示Trp53+/+ WT,两个 PCR 频段(WT: 288 bp,Trp53 L: 370 bp)表示Trp53L/=杂音 (图 1B)
- 对于R26Y,在 94°C 下执行 PCR 3 分钟,然后在 94°C 下执行 30 秒,在 94°C 下执行 PCR,30 秒执行 60°C,在 35 个周期中执行 72°C 1 分钟,然后 72°C 3 分钟,并保持在 14°C。使用引物 (i) R26YFP-1: AAA GTC GTT GTG AGT TGT TAT;(二) R26YFP-2:GCG AAG AGT TG TCC TCA ACC;(三) R26YFP-3:GGA GCG GGA GAA ATG ATAT ATG。
2. 术前准备
- 在手术前1天,所有手术工具都进行高压灭菌。
- 在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备0.1%溴酚蓝,并将其储存在4°C。以 1:10 的比例(即注射混合物)稀释 DMEM 介质中用于电内注射的 Ad-Cre,该介质为 0.01 M CaCl2和溴酚蓝色。
注:此处使用的 Ad-Cre 是从爱荷华大学病毒载体核心获得,其库存病毒色斑为 +1010±1011 pfu/mL。 - 使用离室麻醉雌性小鼠(步骤 1.2 中所述的 F2 代,年龄从 3-4 周到成人),并使用异常室应用眼膏。在手术过程中,通过确保小鼠吸入1%~2.5%的缺氧物来连续麻醉。通过进行脚趾捏合,至少每15分钟检查一次麻醉深度。仔细监测小鼠呼吸速率的任何变化,必要时相应地调整分路胶的水平。
- 在手术前,以5mg/kg的剂量,以5mg/kg的剂量注射梅洛西卡姆作为心底痛。
- 通过应用几滴脱毛霜来暴露奶嘴手术部位;使用软纸巾去除过多的奶油和松散的头发。
注: 在与手术分开的区域执行此步骤。不建议剃须,以免损坏奶嘴。小心及时去除化学脱毛剂。长时间使用试剂可能会导致皮肤发生化学灼伤 - 先用碘化物消毒手术部位,然后是70%酒精,最后应用磨砂碘化物。使用纱布海绵或棉布施用器,从工作区域中心向外围方向以圆形运动进行。重复循环 3x×4x。
3. 电内注射
- 在整个外科过程中使用无菌技术。
- 在两个四分之一的内伤MGs之间,在皮肤上做一个长度为±1厘米的切口部位(图2)。小心地将皮瓣(带 MG)与腹膜分离,以便可视化乳腺导管树。
- 小心地握住手表制造商的钳子,并使用微解剖剪刀去除外部奶嘴,而不会切割任何附近的皮肤。
- 将 Ad-Cre 注射混合物加载到 25 μL 汉密尔顿注射器中,并贴有 33 G 金属轮毂针。根据混合物中包括的蓝色染料估计注射器中注射混合物的体积。
注:在注射至3~4周大女性的MGs时,使用较小的体积(例如3μL),在注射哺乳期女性MG时使用较大的体积(例如10μL)。 - 用细弯曲的钳子轻轻握住皮瓣的边缘,将 Ad-Cre 注射混合物缓慢地注入奶嘴,同时监测蓝色染料向乳腺导管树的扩散。保持注射率尽可能低,以避免损坏导管流明。
注:注入的液体(如随附的溴酚蓝色染料所示)扩散到整个导管树中,而不会泄漏到基质腔中,表明导传内注射成功。 - 轻轻地从奶嘴中取出针头,以避免喷射的液体有任何泄漏。
- 检查 MG 的远端 ( 即远离奶嘴 ) 或注嘴的周围区域。请注意,膨胀的蓝色染料(即,扩散到附近的频闪的染料)表示乳腺脂肪垫注射,而不是成功的电内注射。
- 用伤口夹关闭皮肤上的手术伤口(从步骤 3.2 开始)。
4. 术后护理
- 将鼠标从麻醉中取出,放在干净的笼子内的加热垫上进行恢复。
- 再次在5mg/kg下皮下施用梅洛西卡姆,手术后24小时。
- 监测动物的一般状况,并在切口部位寻找感染迹象5天。
- 伤口夹在手术后7-10天被移除。
5. 监测乳腺肿瘤的发展
- 监测注射小鼠每周两次通过触觉检查任何乳腺肿瘤发育的迹象。
- 一旦肿瘤明显,每天监测小鼠并测量肿瘤大小,直到它到达实验终点,由大小(例如,达到小鼠体重的10%-15%)或肿瘤的状况(如溃疡或坏死)或由小鼠的一般健康状况(例如,昏迷,垂死)。
- 通过二氧化碳窒息使小鼠安乐死,然后采用辅助方法(例如宫颈脱位)。
- 分离乳腺肿瘤组织,并通过流动细胞学、免疫荧光或表达分析(例如,通过RNA测序[RNAeq]或微阵列)进行分析,如前12所述。
- 通过门控为系骨阴性细胞(Lin -:对系系标记CD45[白细胞标记]、CD31[内皮细胞标记]和TER119[红细胞标记]进行流细胞测定分析),并根据它们分析肿瘤中的细胞YFP、CD24 和 CD29 的表达。
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Representative Results
R26Y和Trp53L等位基因的代表性PCR基因分型结果如图1所示。
虽然原则上,所有10个MG都可以接受电内注射程序,但实际上,两个四分之一的内念MG通常被选择注射,因为它们更容易获得和更大的MG尺寸(图2)。在手术过程中,保持消毒和整洁的工作区域,用无菌工具进行手术非常重要(图3)。在电内注射过程中,在注射混合物中加入蓝色染料(例如溴酚蓝)有助于将 Ad-Cre 成功注射到整个导管树中(图 4)。可以成功进行内电内注射(注射混合物体积较小的)的最年轻的雌性小鼠是3周大(图4A),尽管对于大多数乳腺肿瘤诱导实验,年轻的成年雌性小鼠(例如,2 个月大)通常使用 (图 4B)。此外,在早/中妊娠期间,也可在雌性小鼠中进行电内注射(注射混合物体积较大),以靶向腹泡细胞(图4C)。
根据我们的经验,在具有R26Y报告器和Trp53L/L(带或不带任何附加条件等位子)的小鼠中,Cre 介导的重组中断了Trp53条件敲除等位子(以及任何附加的条件敲除等位基因(如果使用),同时打开 YFP 报告器(来自R26Y等位基因,以及任何附加的条件敲离等位,如果使用)。为了针对乳腺肿瘤诱导的不同MEC亚群,在不同MEC子集特异性启动子的控制下,Ad-Cre病毒用于注射(图5)。例如,在角蛋白8(Krt8)促进剂(Ad-K8-Cre)的控制下,Ad-Cre被用来瞄准发光MEC。以前,我们报告在角蛋白14(Krt14)促销员(Ad-K14-Cre)的控制下使用Ad-Cre来瞄准基底MECs13。然而,正如我们所报道的,Ad-K14-Cre的电感注射不仅针对基基MEC,而且包括部分发光MECs13。我们最近测试了另一个Ad-Cre在角蛋白5(Krt5)促进剂(Ad-K5-Cre)14的控制下,发现它可以更紧密地瞄准基础系,导致只有基础 MEC 的基因标记 (图 5)。Ad-K8-Cre或Ad-K5-Cre注射中标有 YFP 标记的 MEC 的典型百分比约为 0.1%-1%。
对于Trp53L/L;R26Y雌性小鼠在FVB遗传背景下,Ad-K8-Cre的电位注射,针对其发光MEC,导致乳房肿瘤在注射几个月后发展(图6A)。具有不同遗传背景的小鼠(例如 C57/B6)注射后可能表现出较长的乳腺肿瘤发展延迟。由于包含有条件的R26Y报告器,肿瘤上皮细胞通常以YFP标记,可以通过流动细胞测定检测(图6B);它们可以通过YFP+细胞的流分集来丰富,以便进一步分析。
图1:R26Y和Trp53L等位基因的代表性PCR基因分型结果。WT = 野生型;同源性 = 同源性。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:Ad-Cre病毒在MG中注射的架构图。(A) 在两个第四个 MG 之间中间线的切口位点 (B) 用蓝色染料(为了更好的可视化)将 Ad-Cre 的内电内注射到第四个 MG 之一中(C)通过伤口夹关闭皮肤的切口。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:啮齿动物手术无菌设置概述。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:将成功的电内注射到整个乳腺导管树中进行可视化。(A) 3 μL注射混合物(带溴酚蓝)的电内注射到3周大雌性小鼠MG中的例子。(B) 将5μL注射混合物的内电内注射到年轻成年雌性小鼠的MG中。(C) 在妊娠早期/中期将10μL注射混合物内注入雌性小鼠MG。(D) 乳腺脂肪垫注射的例子,而不是成功的电内注射。将5μL注射混合物的内电注入年轻成年雌性小鼠的MG。( a ) 注嘴周围的皮肤区域 ;(b) 显示乳腺脂肪垫的皮肤皮瓣的另一侧;黄色圆圈表示染料扩散到脂肪垫中。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5:在电内注射时对YFP标记细胞的流细胞学分析的代表性图。YFP= R26Y处女母体MGs的种群在Ad-K8-Cre(左,在7 x 109 pfu/mL)或Ad-K5-Cre(右,注射在7.86 x 109 pfu/ 的山皮后 3 天)注射mL) 病毒。图基于对CD24和CD29在系向阴性(Lin-;即CD45、CD31和TER119表达的阴性)YFP+细胞染色的分析。陆+ 林-CD24高CD29低亮度MEC门;Ba = 林-CD24低CD29高基基 MEC 门;发光和基基MEC的门控策略基于沙克尔顿等人15。请点击此处查看此图的较大版本。
图6:Trp53L/L的肿瘤发展;R26Y雌性小鼠在导内注射Ad-K8-Cre。(A) 一只代表小鼠在注射Ad-K8-Cre几个月后显示肿瘤生长(箭头)。(B) 根据流细胞分析,来自代表性肿瘤的活细胞(基于DAPI染色)中约8.8%对YFP表达呈阳性。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这种方法从MECs的不同亚群诱导乳腺肿瘤的成功不仅取决于选择适当的细胞型特异性启动子(驱动Cre表达),还取决于电内注射程序本身。这种方法背后的思想是,注入的Ad-Cre病毒被保留在导流明树中,这是一个带有流明的隐蔽结构,因此,只有MEC暴露在病毒中,并且感染了Ad-Cre。由于乳腺管道内的流明空间有限,因此只向每个 MG 注入少量注射混合物非常重要(即 ±3-5 μL)。注射的体积也应根据小鼠的年龄进行调整(即,当注射到3至4周大的小鼠时,应使用较小的体积)。当注射液的体积过大时,由于注射压力和导管流明空间有限,液体可能通过上皮层"推出"到频闪层,导致基质细胞中不必要的病毒感染。
由于细胞型特异性是由腺病毒载体中使用的促进器来驱动Cre表达的,因此这种方法的一个局限性是可能缺乏一个合适的启动子来将Cre表达定位到特定的MEC子群。我们之前曾报道过使用泛光Ad-K8-Cre病毒来靶向发光MECs12,13,并使用Ad-Wap-Cre病毒来靶向5号球泡。 在这项研究中,我们展示了Ad-K5-Cre病毒用于目标基基MEC(图5)。我们仍然缺乏使用这种方法瞄准雌激素受体阳性发光MEC亚群的能力。我们在这里使用的去病毒载体可以容纳高达8 kb的插入物。因此,要开发特定于 MEC 子集的 Ad-Cre,用于驱动 Cre 表达式的启动程序只能小于 7 kb。实际上,大型启动子片段,即使大小小于 7 kb,也很难进行子克隆。为了适应去病毒载体,虽然可以使用截断的启动子,但在内源性、完全启动子的控制下,它可能不会忠实地重述其相应基因的表达模式。
此处的小鼠模型中包含的R26Y条件报告器提供了一种标记源细胞并跟踪其进展到癌细胞的方法。值得注意的是,在肿瘤中,YFP标记的癌细胞的百分比似乎相当低(图6B)。这可能是由于一种可能性,除了YFP标记的肿瘤上皮细胞,肿瘤还包括许多免疫细胞和基质细胞,构成肿瘤质量的大部分。
与其他小鼠模型乳腺癌相比,这种方法导致乳腺肿瘤的启动从少数MECs只(例如,发光MECs时,Ad-K8-Cre注射),往往在克隆水平12。由于人类肿瘤的产生可能是克隆的,这种方法更忠实地概括了人类癌症发展的这一方面。此外,即使 p53 仅在少数 MEC 中中断,p53 的丢失也会导致其克隆扩展,导致产生更大的突变 MEC 池;这将允许从p53缺乏MECs(在获得额外的体细胞突变时)进一步克隆进化12。由于TP53是人类乳腺癌中最常见的突变基因16,由于TP53突变是人类乳腺肿瘤发生的早期事件17,18,通过结合Trp53花环小鼠模型与小鼠其他致癌事件的模型,我们可以研究这些致癌事件如何与p53损失合作,以及它们如何共同促进乳腺肿瘤从定义的细胞来源发展。此外,由于需要较少的育种来将多个等位子放在一起,这种方法将最大限度地减少育种成本和时间,这将促进在较短的时期内进行更大规模的乳腺癌建模研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家卫生研究院(NIH)授予R01 CA222560和国防部突破奖W81XWH-18-1-0037的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
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