Summary
Bu protokol amacı yeni bir meme kanseri modelleme yaklaşımı CRE-ifade adenovirüsü fare meme bezleri içine intraduktal enjeksiyon dayalı açıklamak için. Bu yaklaşım, Onkojenik olayların hem hücre tipi hem de Organ spesifik manipülasyon geçici olarak kontrollü bir şekilde sağlar.
Abstract
Meme kanseri heterojen bir hastalıktır, muhtemelen kökenleri ve Onkojenik olayların farklı hücreler arasındaki karmaşık etkileşimler nedeniyle. Fare modelleri, bu karmaşık süreçlere bilgi kazanma konusunda enstrümantal. Birçok fare modeli, çeşitli Onkojenik olayların ve menşe hücrelerinin meme tümörijenezde katkıları çalışmak için geliştirilmiştir rağmen, bu modeller genellikle hücre tipi veya Organ spesifik değildir veya bir içinde meme tümörijenezde başlamasını teşvik edemez geçici olarak kontrollü bir şekilde. Burada CRE-ifade adenovirüsü (ad-CRE) fare meme bezleri (MGS) içine intraduktal enjeksiyon dayalı meme kanseri fare modelleri yeni bir tür oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Ad-CRE ' nin meme kanallarına doğrudan enjekte edilmesi nedeniyle, bu yaklaşım diğer organlarda herhangi bir istenmeyen kanser indüksiyonu olmaksızın MG spesifik olarak görülmektedir. İntraduktal enjeksiyon prosedürü fareler içinde kendi mg gelişimi farklı aşamalarında yapılabilir (böylece, kanser indüksiyon temporal kontrole izin verir, başlayarak ~ 3-4 hafta yaş). Hücre tipi özgüllüğü, Adenoviral Vektördeki CRE ifadesini götürmek için farklı hücre türüne özgü promotörler kullanılarak elde edilebilir. Biz luminal ve bazal meme epitelyal hücreler (MECS) sıkı CRE/loxp tabanlı genetik manipülasyon Keratin 8 veya Keratin 5 Promoter, sırasıyla ad-CRE bir intraduktal enjeksiyon yoluyla hedeflenebilir olduğunu göstermektedir. Koşullu bir CRE muhabiri (örn., CRE/loxp-indüklenebilir Rosa26-YFP Reporter) ekleyerek, reklam-CRE tarafından hedeflenen MECS ve onlardan türeyen tümör hücreleri, intraduktal enjeksiyon sonrasında muhabir-pozitif hücreleri takip ederek takip edilebilir.
Introduction
Bu yöntemin genel hedefi fare mg içine ad-CRE bir intraduktal enjeksiyon dayalı yeni bir meme kanseri modelleme yaklaşımı geliştirmektir. CRE/loxP rekombinasyon tabanlı genetik yaklaşım yaygın farelerde insan meme kanseri modeli için kullanılmıştır. CRE/loxP tabanlı meme kanseri fare modellerinin ilk nesil MEC özgü promotörler kontrolü altında CRE-ifade transjenik fareler kullanılarak oluşturulur (örneğin, luminal MECs için Mmtv-CRE ve bazal MECS bir kısmı, WAP-CRE ve Luminal projenatörler ve alveoler luminal MECs için blg-CRE, bazal Için K14-CRE ve luminal MECS bir kısmı1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. ancak, bu CRE transjenik hatları CRE ifadesinin uzamsal kontrolünü etkinleştirirken (yani, MECS farklı alt kümelerinde), CRE Ifadesi ve CRE/loxp-aracılı genetik manipülasyon temporal kontrole izin vermez. CRE/loxP tabanlı meme kanseri fare modellerinin ikinci nesil indüklenebilir CRE aktivite/ifade yaklaşımlar (örneğin, CRE-estrojen reseptör Fusion kullanımı [CreER], hangi sadece Tamoxifen yönetimi üzerine CRE/loxP rekombinasyon neden olabilir) kullanmak ve Sonuç olarak, bu genetik araçlar MECS (örneğin, K8-creer-ve K5-creertabanlı modeller) Onkojenik olayların aktivasyonunun hem uzamsal ve temporal kontrolleri izin verir10,11,12 . Meme kanseri fare modellerinin her iki nesilde, CRE veya CreER ifadesi (örn., Krt8, Krt5) götürmek için kullanılan organizatörler olarak da diğer organların epitelyal hücrelerde aktif olabilir (yani, onlar hücre tipi özeldir ama organ özgü değil) veya epitelyal hücreler dışındaki hücre tiplerinde (örn., kemik iliği hematopoetik hücrelerde sızdıran aktivite olan Mmtv), bu yaklaşımlar diğer organlarda (s) istenmeyen kanserlerin gelişmesine yol açabilir. Bu beklenmeyen kanserler etkilenen farelerde kötülüğü neden olursa, bu fareler içinde modelleme meme kanserinin orijinal amacı yasaklanabilir (örn., Mmtv-CRE-Driven Onkojenik olaylar hematopoetik malignite ve fareler erken ölümü neden olabilir , hematopoetik hücrelerde mmtv Organizatör sızıntısı nedeniyle)4.
Burada bir meme kanseri modelleme yaklaşımı farelerde her iki hücre tipi-ve organ özgü manipülasyon geçici olarak kontrollü bir şekilde Onkojenik olayların sağlayan rapor. Bu yaklaşım, fare MGS içine ad-CRE bir intraduktal enjeksiyon dayanmaktadır (ve bu nedenle, organ özgü). CRE ifadesi, Adenoviral vektörü (örn., luminal MECs için Krt8 , bazal MECS için Krt5 , böylece hücre tipi özgüllüğü elde) gömülü farklı MEC alt nüfus özgü promotörler kullanılarak kontrol edilebilir. MGs kanser indüksiyon temporally farklı yaşlarda fareler içine ad-CRE bir enjeksiyon ile kontrol edilebilir, başlayarak 3-4 hafta yaş (pubertal) Yetişkin aşamaya.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Brigham ve kadın Hastanesi kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıANUC) tarafından onaylanmıştır.
1. floxed fareler üretimi ve Bakımı
- Meme kanserine uygun floked koşullu nakavt (örn., Trp53tm1Brn [ Trp53l/l], BRCA1tm1Aash [BRCA1L/l]) veya koşullu Knock-in fare hatları (örn., Gt (Rosa) 26SorTm1 (PIK3CA * H1047R) Egan) Jackson Laboratory (JAX) veya ınsan kanseri Konsorsiyumu (MMHCC) depo NCı fare modelleri. Buna ek olarak, CRE-aracılı rekombinasyon geçmesi MECs kovalamak kolaylaştırmak için, bir koşullu CRE-Reporter hattı da JAX (örneğin, gt (Rosa) 26SorTM1 (EYFP) cos [ R26Y] olarak adlandırılır) elde edilebilir.
- Breed Trp53l/l homozigot fareler ile R26Y homozigot muhabir fareler veya homozigot fareler taşıyan R26Y muhabir alelleri ve herhangi bir ek floxed koşullu nakavt veya Knock-in alelleri farklı fare modelleri, heterozigot F1 erkek ve dişi Progeny elde etmek.
- Intercross heterozigot F1 erkek ve kadın fareler her allel için homozigot olan F2 bileşik kadın fareler elde etmek (deneysel fareler gibi), yanı sıra R26Y-Sadece homozigot kadın (kontrol fareler olarak). Aşağıda listelenen PCR astar ve bisiklet koşullarına dayalı Genotype F2 fareler, iki farklı PCR tüplerinde iki adet standart 20 μl PCR reaksiyonu (Taq 5x Master Mix kullanarak) oluşturarak, biri R26Y astarlar ve diğeri Trp53L Primers. Tüm üreme için yetişkin fareler (genellikle yaklaşık 2 – 4 ay) kullanın.
- R26YIçin 94 °c ' de 3 dakika boyunca PCR, 30 s Için 94 °c, 30 s Için 60 °c, 35 döngüleri için 1 dakika Için 72 °c, ardından da 3 dakika Için 72 °c ve 14 °c ' de bakım yapın. Astar kullanın (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
Not: 250 BP tek bir PCR Band bir R26Y homozygote gösterir, 500 BP tek bir PCR Band bir Wild-Type (WT) ve iki PCR bantları (R26Y: 250 BP, WT: 500 BP) bir R26Y heterozigot gösterir (Şekil 1a).
Trp53Liçin 94 °c ' de 3 dakika boyunca PCR, 30 sn için 94 °c, 30 72 s için 60 °c, 35 döngüleri için 1 dakika, sonra da 72 °c ' de 3 dakika ve 14 °c ' de sürdürüyor. Kullanım astarlar (i) p53F2-10 1F: CAC aaa AAC AGG TTA AAC CCA G; (II) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
Not: 370 BP tek bir PCR Band Trp53l/l homozygote gösterir, 288 BP tek bir PCR Band bir Trp53+/+ WT ve iki PCR bantları gösterir (WT: 288 BP, Trp53L: 370 BP) bir Trp53L göstermek /+ heterozigot (Şekil 1B).
- R26YIçin 94 °c ' de 3 dakika boyunca PCR, 30 s Için 94 °c, 30 s Için 60 °c, 35 döngüleri için 1 dakika Için 72 °c, ardından da 3 dakika Için 72 °c ve 14 °c ' de bakım yapın. Astar kullanın (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
2. ameliyat öncesi hazırlık
- Ameliyattan 1 gün önce tüm cerrahi aletleri otoklav.
- Fosfat-tamponlu tuzlu (PBS)% 0,1 bromophenol mavi hazırlayın ve 4 °C ' de saklayın. 0,01 M CAcl2 ve bromophenol mavi 1:10 (yani, enjeksiyon karışımı) bir oran ile dmem orta intraduktal enjeksiyon için kullanılacak ad-CRE seyreltilebilir.
Not: burada kullanılan ad-CRE Iowa viral vector Core Üniversitesi 'nden elde edildi, bir stok viral titresi ile ~ 1010– 1011 PFU/ml. - Bir izofluran odası kullanarak ve göz merhem uygulamak kadın fare (F2 nesil adım 1,2, Yaş 3-4 hafta Yetişkin) arasında değişen açıklandığı gibi anestezize. Prosedür sırasında, oksijen sürekli% 1-% 2.5 Isoflurane berbat sağlayarak fare anestezize. Bir ayak tutam gerçekleştirerek en az 15 dakika anestezi derinliği kontrol edin. Dikkatle solunum hızında herhangi bir değişiklik için fareyi izlemek, buna göre Isoflurane seviyesini ayarlayarak, gerekirse.
- Cerrahi işlemden önce 5 mg/kg 'lık bir dozda subkutan olarak Meloksikam enjekte edilir.
- Saç kaldırma krem birkaç damla uygulayarak meme cerrahi site açığa; yumuşak kağıt havlular kullanarak aşırı krem ve gevşek saç kaldırın.
Not: Bu adımı, ameliyatın gerçekleştirileceği yerden ayrı bir alanda gerçekleştirin. Meme uçlarına zarar vermemek için tıraş edilmesi önerilmez. Kimyasal Depilatuar Ajan zamanında kaldırmak için dikkatli olun. Ajanı çok uzun süre terk etmek cildin kimyasal yanmasına neden olabilir - Cerrahi siteyi önce iyodoforlar ile dezenfekte edin, ardından% 70 alkol ve son olarak Scrub iyodoforlar uygulaması ile sona erdirin. Bir gazlı bez sünger veya pamuk uçlu aplikatör kullanarak çevre doğru çalışma alanının merkezinden dairesel hareket bunu. Döngüsü 3x-4X tekrarlayın.
3. intraductal enjeksiyon
- Cerrahi prosedür boyunca aseptik teknikler kullanın.
- İki dördüncü inguinal MGs arasında ~ 1 cm uzunluğunda cilt üzerinde bir kesi site olun (Şekil 2). Dikkatle cilt flep (mg ile) parietal periton böylece meme duktal ağacı görselleştirmek için ayırın.
- Meme ucunu Watchmaker 'ın forsepları ile dikkatlice tutun ve yakın cildi kesmeden dış meme ucunu mikro Diseksiyon makas kullanarak çıkarın.
- 33 G metal göbek iğnesi ile 25 μL Hamilton şırıngaya yük ~ 3 – 5 μL ad-CRE enjeksiyon karışımı yapıştırılmıştır. Karışım dahil mavi boya dayalı şırınga enjeksiyon karışımı hacmi tahmin.
Not: 3 – 4 haftalık kadın ve daha büyük hacimli (örn. 10 μL) MGs 'ye enjekte edilirken, emzirme dişi MGs 'ye enjekte edildiğinde daha küçük bir hacim (örn. 3 μL) kullanın. - İnce kavisli bir cımbız ile cilt kapağının kenarına hafifçe tutun ve ad-CRE enjeksiyon karışımı yavaş meme içine enjekte, bu arada meme duktal ağaca mavi boya yayılmasını izleme. Duktal lümene zarar vermemek için enjeksiyon hızını mümkün olduğunca düşük koruyun.
Not: enjekte edilen sıvı (dahil bromophenol mavi boya ile gösterildiği gibi) stromal bölmesine sızdırmadan tüm duktal ağaç boyunca yayılan başarılı bir intraduktal enjeksiyon gösterir. - Enjekte edilen sıvının herhangi bir sızıntısını önlemek için iğneyi meme ucuna hafifçe çekin.
- MG 'nin veya enjekte edilen meme ucunun çevresindeki bölgenin distal tarafını (örn. meme uçından uzak) inceleyin. Şişkinlik mavi boya (yani, yakın stroma içine difüzör boya) başarılı bir intraduktal enjeksiyon yerine bir meme yağ Pad enjeksiyon gösterir unutmayın.
- Yara kliplerine sahip deride cerrahi yaraları (adım 3,2) kapatın.
4. ameliyat sonrası bakım
- Anesteziden fareyi çıkarın ve kurtarma için temiz bir kafes içinde bir Isıtma Pad üzerine yerleştirin.
- Meloksikam subkutan 5 mg/kg tekrar, ameliyattan 24 saat sonra yönetin.
- Hayvanın genel koşullarını izleyin ve 5 gün boyunca kesi bölgesinde enfeksiyon belirtileri arayın.
- Yara klipleri ameliyat sonrası ~ 7-10 gün kaldırılır.
5. meme tümörünün gelişiminin izlenmesi
- Meme tümörü gelişimi herhangi bir işareti için palpasyon tarafından haftada iki kez enjekte fareler izleyin.
- Tümör palpe edildikten sonra, fareyi günlük olarak izleyin ve tümör boyutunu, boyut tarafından belirlendiği gibi deneysel uç noktaya ulaşana kadar ölçün (örn. fare vücut ağırlığının% 10 ' unun% 15 ' ine ulaşan) veya tümör (örn. ülserli veya nekrotik) veya genel sağlık durumu (örn., Comatose, Moribund).
- Fare, karbon dioksit Asphyxiation, ikincil bir Yöntem (örneğin, servikal dislocation) tarafından takip.
- Meme tümör dokularının izole ve akış sitometri, immünofluorescence veya ifade profil oluşturma (örneğin, RNA sıralamasının [rnaseq] veya microarray tarafından), daha önce açıklandığı gibi analiz12.
- Lineage-negatif hücreler için gating tarafından akış cytometrik analiz gerçekleştirin (Lin-: Lineage işaretçileri IÇIN negatif CD45 [lökosit Marker], CD31 [endotel hücre Marker], ve TER119 [eritrosit Marker]), ve kendi temelinde tümör hücreleri analiz YFP, CD24 ve CD29 ifadesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
R26Y ve Trp53L alelleri için temsilci PCR Genotipleme sonuçları Şekil 1' de gösterilmiştir.
Her ne kadar, prensip olarak, tüm 10 MGS intraduktal enjeksiyon prosedürü tabi olabilir, pratikte, iki dördüncü inguinal MGS genellikle enjeksiyon için seçilir, onların kolay erişilebilirlik ve daha büyük mg boyutları nedeniyle (Şekil 2). Cerrahi sırasında dezenfekte edilen ve karmaşık olmayan bir çalışma alanını korumak ve prosedürü steril aletlerle gerçekleştirmek önemlidir (Şekil 3). İntraduktal enjeksiyon sırasında, enjeksiyon karışımındaki mavi bir boya (örneğin, bromophenol Mavisi) eklenmesi, ad-CRE ' nin tüm duktal ağacına başarılı bir enjeksiyonu görüntülemeyi sağlar (Şekil 4). İntraduktal enjeksiyon (enjeksiyon karışımı daha küçük bir hacmine sahip) en genç kadın fareler başarıyla gerçekleştirilebilir ~ 3 hafta yaş (Şekil 4A), çoğu meme tümör indüksiyon deneyler için rağmen, Genç Yetişkin kadın fareler (örn. 2 ay) genellikle kullanılır (Şekil 4b). Buna ek olarak, intraduktal enjeksiyon (enjeksiyon karışımı daha büyük bir hacmine sahip) aynı zamanda erken/orta-gebelikte alveoler hücreleri hedef (Şekil 4c) sırasında kadın fareler yapılabilir.
Bizim deneyimimizde, R26Y Reporter ve Trp53l/l (herhangi bir ek koşullu alelleri ile veya olmadan) ile fareler, CRE-aracılı rekombinasyon Trp53 koşullu nakavt alelleri kesintiye (ve herhangi bir ek Koşullu nakavt alleles, kullanılırsa) ve bu arada, YFP muhabiri ( R26Y ALLELE, yanı sıra herhangi bir ek koşullu Knock-in ALLELE, kullanıldığında) açık. Meme tümörü indüksiyonu için farklı MEC alt kitlesini hedeflemek için, enjeksiyon için farklı MEC alt kümesine özgü promotörler kontrol altında ad-CRE virüsleri kullanılmıştır (Şekil 5). Örneğin, Keratin 8 (Krt8) organizatör (ad-K8-CRE) kontrolü altında ad-CRE luminal MECS hedef için kullanıldı. Daha önce, bazal MECs13' ü hedef almak Için Keratin 14 (Krt14) promotör (ad-K14-CRE) kontrolü altında ad-CRE kullanımını bildirdik. Ancak, biz bildirilen, ad-K14-CRE intraduktal enjeksiyon sadece bazal MECS değil, aynı zamanda luminal MECS13bir kısmını hedeflenmiştir. Geçenlerde Keratin kontrolü altında başka bir ad-CRE test 5 (Krt5) organizatör (ad-K5-CRE)14 ve daha sıkı bazal soy hedef olabilir bulundu, sadece bazal MECS genetik işaretleme lider (Şekil 5). Ad-K8-CRE veya ad-K5-CRE enjeksiyonu Ile YFP işaretli MECS tipik yüzdeleri yaklaşık% 0.1-1% ' dir.
Trp53L/liçin; Fvb genetik arka planda R26Y dişi fareler, onların luminal MECS hedefleyen ad-K8-CREintraduktal enjeksiyon, enjeksiyonu birkaç ay sonra meme tümörlerinin gelişmesine yol açtı (Şekil 6a). Farklı bir genetik arka plan ile fareler (örn., C57/B6) enjeksiyondan sonra meme tümörlerinin geliştirilmesi daha uzun bir gecikme gösterebilir. Koşullu R26Y Reporter dahil nedeniyle, tümör epitelyal hücreler genellikle YFP tarafından işaretlenmiş ve akış sitometri tarafından tespit edilebilir (Şekil 6B); daha fazla analiz için YFP+ hücrelerinin akış sıralama tarafından zenginleştirilebilir.
Resim 1: R26Y ve Trp53L alleles IÇIN temsilci PCR Genotipleme sonuçları. WT = vahşi tip; Homo = homozygote. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: ad-CRE virüsü bir mg içine intraduktal enjeksiyon Şematik diyagramı. (A) Iki dördüncü mg arasında orta çizgisinde kesi site. (B) dördüncü MGS biri içine mavi boya (daha iyi görselleştirme için) Ile ad-CRE intraductal enjeksiyon. (C) yara kliplerine göre deride kesi kapanması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: kemirgen cerrahisi için aseptik kurulumuna genel bakış. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: tüm meme duktal ağacın içine başarılı bir intraduktal enjeksiyon görselleştirme. (A) 3 μL enjeksiyon karışımı (bromophenol mavi), 3 haftalık bir kadın fare mg içine intraduktal enjeksiyon bir örnektir. (B) 5 μL enjeksiyon karışımı intraductal enjeksiyon bir genç yetişkin kadın fare bir mg içine. (C) erken/orta-gebelik bir kadın fare bir mg Içine 10 μL enjeksiyon karışımı intraductal enjeksiyon. (D) başarılı bir intraduktal enjeksiyon yerine bir meme yağ Pad enjeksiyon bir örnek. İntraductal enjeksiyon 5 μL enjeksiyon karışımı bir MG Genç Yetişkin kadın fare içine. (a) enjekte edilen meme ucunu çevreleyen cilt alanı; (b) meme yağ yastığı gösteren deri flep diğer tarafı; sarı daire yağ yastık içine yayılan boya gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: intraduktal enjeksiyon üzerine YFP-işaretli hücrelerin akış cytometrik analizinin temsilcisi araziler. R26Y bakire dişi MGS gelen YFP+ nüfus 3 gün ad-K8-CRE bir intraduktal enjeksiyon sonra (sol, bir titresi at enjeksiyon 7 x 109 PFU/ml) veya ad-K5-CRE (sağ, bir titresi at enjeksiyon 7,86 x 109 PFU/ mL) virüsler. Çizimler, CD24 ve CD29 boyayan bir analizine dayanmaktadır-negatif (Lin-; i.e., CD45, CD31 ve TER119 ifadesi için negatif) YFP+ hücreler. Lu = Lin-CD24yüksekCD29düşük luminal MEC kapısı; Ba = Lin-CD24düşükCD29yüksek bazal MEC kapısı; luminal ve bazal MECs için gating stratejisi Shackleton ve al.15dayanmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: Trp53L/l'de tümör gelişimi; R26Y kadın fareler intraductally ad-K8-CREile enjekte. (A) ad-K8-CREile enjeksiyondan birkaç ay sonra tümör büyümesini (oklar) gösteren bir temsilci fare. (B) yaklaşık 8,8% canlı hücrelerin (DAPI boyama dayalı) bir temsili tümör YFP ifadesi, akış cytometrik analiz dayalı pozitif oldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MECS farklı alt popülasyonlarının meme tümörleri inducing için bu yaklaşımın başarısı sadece uygun hücre tipi özgü promotörler (CRE ifade götürmek için) tercih değil, aynı zamanda intraduktal enjeksiyon prosedürü kendisi dayanır. Bu yaklaşımın arkasındaki fikir, enjekte edilen ad-CRE virüslerinin Lümen ile gizlenmiş bir yapı olan duktal ağacında korunduğunu ve bu nedenle, sadece MECs virüslere maruz kalmaktadır ve ad-CRE tarafından enfekte olmaktadır. Meme kanalları içinde sınırlı lümen alanı nedeniyle, sadece her mg (yani, ~ 3-5 μL) enjeksiyon karışımı küçük bir hacim enjekte etmek önemlidir. Enjekte hacmi de fareler yaşına göre ayarlanması gerekir (yani, daha küçük bir hacim 3-4 hafta-eski fareler enjekte edildiğinde kullanılmalıdır). Enjekte edilen sıvı hacmi enjeksiyon ve sınırlı duktal lümen boşluğu basıncı nedeniyle aşırı olduğunda, sıvı stromal hücrelerde istenmeyen bir viral enfeksiyon yol, stroma içine epitelyal katmanları aracılığıyla "dışarı itti" olabilir.
Hücre tipi özgüllüğü, CRE ifadesini götürmek için Adenoviral vektörde kullanılan Organizatör tarafından elde edildiğimden, bu yaklaşımın bir sınırlaması, CRE ifadesini belirli bir MEC alt popülasyonuna hedef almak için uygun bir organizasyonun olası eksikliği olur. Daha önce luminal MECS12,13 ve hedef alveoler luminal ataları5 ad-WAP-CRE virüs kullanımı hedef Pan-luminal ad-K8-CRE virüsü kullanımını bildirdi. Bu çalışmada, bazal MECs 'i hedef almak için ad-K5-CRE virüsünün kullanımını gösterdik (Şekil 5). Hala estrojen reseptörü-pozitif luminal MEC alt nüfus hedef bu yaklaşımı kullanmak için yeteneği eksikliği. Burada kullanılan Adenoviral vektörü 8 KB 'ye kadar bir kesici uç barındırabilir. Böylece, MEC-alt-özel ad-CRE geliştirmek için, CRE ifade sürücü için kullanılan organizatör sadece 7 KB 'den az olabilir. Pratikte, büyük bir organizatör parçası, boyutu 7 KB 'den az olsa bile, subclone zor olabilir. Adenoviral vektörüne sığacak şekilde, kesilmiş bir organizatör kullanılabilir olsa da, endojen, tam organizörün kontrolü altında, karşılık gelen geni ifade desenini sadakatle yeniden göstermeyebilir.
R26Y koşullu muhabir burada fare modeli dahil Orijin hücrelerini işaretlemek ve kanser hücrelerine ilerlemesini izlemek için bir yol sağladı. Not, ortaya çıkan tümördeki YFP işaretli kanser hücrelerinin yüzdesi oldukça düşük görünüyordu (Şekil 6B). Bu bir olasılık nedeniyle olabilir, YFP-işaretli tümör epitelyal hücrelere ek olarak, tümör aynı zamanda birçok bağışıklık hücreleri ve stromal hücreleri dahil, hangi tümör kütlesi toplu oluşturdu.
Meme kanseri diğer fare modelleri ile karşılaştırıldığında, bu yaklaşım sadece MECS az sayıda (örn., ad-K8-CRE enjekte edildiğinde luminal MECS), genellikle bir klonal seviye12' de meme tümör başlaması yol açar. İnsan tümörijenezde başlangıcı clonal olması muhtemeldir, bu yaklaşım daha sadakatle insan kanseri gelişimi bu yönü reapita. Buna ek olarak, p53 sadece az sayıda MECS içinde bozulduğunda bile, p53 kaybı onların klonal genişleme yol açar, mutasyona uğramış MECS daha büyük bir havuz üretimine yol; Bu, p53-eksikliği MECs (ek somatik mutasyonlar edinilmesi üzerine) daha fazla klonal evrim izin verir12. TP53 , insan meme kanserinde en sık mutasyona uğramış gen olan16 ve TP53 mutasyonu, insan meme tümörijenezde17,18, fare ile Trp53 floxed fare modelini birleştirerek erken bir olaydır diğer Onkojenik olaylar için modeller, biz nasıl bu Onkojenik olayların p53 kaybı ile işbirliği ve nasıl ortaklaşa tanımlanmış bir hücresel kökenli meme tümörü gelişimi için katkıda çalışabiliriz. Buna ek olarak, daha az üreme birlikte birden alelleri koymak için gerekli olduğu, bu yaklaşım, daha kısa bir dönemde, daha büyük bir ölçekte meme kanseri modelleme çalışmalarını kolaylaştırmak gerekir üreme maliyeti ve zaman, en aza indirmek olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NıH) Grant R01 CA222560 ve bölüm savunma atılım Ödülü W81XWH-18-1-0037 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
