Summary
Цель этого протокола заключается в описании нового подхода к моделированию рака молочной железы молочной железы, основанного на внутрипроточной инъекции аденовируса в молочные железы мыши. Такой подход позволяет временно контролировать сяполивую манипуляцию онкогенными событиями как клеточного типа, так и органно.
Abstract
Рак молочной железы является неоднородным заболеванием, возможно, из-за сложных взаимодействий между различными клетками происхождения и онкогенных событий. Мышиные модели играют важную роль в получении информации об этих сложных процессах. Хотя многие модели мыши были разработаны для изучения вклада различных онкогенных событий и клеток происхождения в опухолевом железе, эти модели часто не клеточного типа или органа конкретных или не может вызвать начало опухоли молочной железы в временно контролируемым образом. Здесь мы описываем протокол для создания нового типа моделей мыши рака молочной железы на основе внутрипроточной инъекции Cre-выражения аденовируса (Ad-Cre) в мышь молочных желез (MGs). Из-за прямого впрыска Ad-Cre в молочные протоки, этот подход является МГ конкретных, без каких-либо нежелательных индукции рака в других органах. Процедура внутрипротектольной инъекции может быть выполнена у мышей на разных стадиях их развития МГ (таким образом, она позволяет височное управление индукцией рака, начиная с 3-4 недель). Специфика клеточного типа может быть достигнута с помощью различных клеточных микропромоутеров для привода Экспрессии Cre в аденовирусном векторе. Мы показываем, что светящиеся и базальные молочные эпителиальные клетки (MECs) могут быть плотно ориентированы на Cre/loxP основе генетических манипуляций с помощью внутрипроточной инъекции Ad-Cre под контролем кератина 8 или кератина 5 промоутер, соответственно. Включив условный Репортер Cre (например, Cre/loxP-индуцируемого репортера Rosa26-YFP), мы показываем, что MECs, ориентированные на Ad-Cre, и опухолевые клетки, полученные из них, можно проследить, следуя за репортером-положительными клетками после внутрипротектонных инъекций.
Introduction
Общая цель этого метода заключается в разработке нового подхода моделирования рака молочной железы на основе внутрипроточной инъекции Ad-Cre в мышь MG. Рекомбинационный генетический подход на основе cre/loxP широко используется для моделирования рака молочной железы у мышей. Первое поколение Cre/ loxP основе рака молочной железы мыши модели генерируются с помощью Cre-выражения трансгенных мышей под контролем MEC конкретных промоутеров (например, MMTV-Cre для светящихся MECs и часть базальных MECs, Wap-Cre и Blg-Cre для светящихся прародителей и альвеолярных светящихся МЭК, K14-Cre для базальных и часть светящихся MECs1,2,4,5)6, 7 (г. , 8 , 9. Однако, в то время как эти Cre трансгенных линий позволяют пространственный контроль Cre выражения (т.е., в различных подмножествах MECs), они не позволяют временной контроль Cre выражения и Cre / loxP-опосредованных генетических манипуляций. Второе поколение Cre/loxP основе рака молочной железы мыши модели использовать индуцируемой Cre деятельности / выражения подходов (например, использование Cre-эстроген рецепторов слияния "CreER", который может только вызвать Cre / loxP рекомбинации при применении тамоксифена), и в результате, эти генетические инструменты позволяют как пространственные, так и временные контроля активации онкогенных событий в МЭК (например, K8-CreER- и K5-CreER-модели)10,11,12 . В обоих поколениях моделей мыши рака молочной железы, как промоутеры, используемые для привода Cre или CreER выражение (например, Krt8, Krt5) также могут быть активны в эпителиальных клетках других органов (т.е., они клеточного типа конкретных, но не орган-специфических) или имеют вытекающей выражение в типах клеток, кроме эпителиальных клеток (например, MMTV, который имеет вытекающей активности в гематопоэтиных клетках костного мозга), эти подходы могут привести к развитию нежелательного рака (ы) в других органах (ы). Если эти неожиданные раковые заболевания вызывают летальность у пораженных мышей, первоначальная цель моделирования рака молочной железы у этих мышей может быть запрещена (например, MMTV-Cre-управляемыеонкогенные события могут привести к гематопоиетические злокачественные новообразования и ранняя смерть мышей , из-за утечки промоутера MMTV в гематоподетические клетки)4.
Здесь мы сообщаем о подходе к моделированию рака молочной железы у мышей, который позволяет как клеточного типа, так и орган-специфические манипуляции онкогенных событий в временно контролируемой основе. Этот подход основан на внутрипроточной инъекции Ad-Cre в мышь MGs (и, таким образом, орган-специфический). Выражение Cre можно контролировать с помощью различных субпопуляционных промоутеров MEC, встроенных в аденовирусный вектор (например, Krt8 для светящихся МЭков, Krt5 для базальных МЭК, тем самым достигая специфичности клеточного типа). Индукция рака в MGs может быть временно контролируется путем инъекции Ad-Cre в мышей в разном возрасте, начиная с 3-4 недель (пубертальный) для взрослой стадии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные здесь методы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Бригама и женской больницы.
1. Генерация и содержание флоксированных мышей
- Получить рак молочной железы соответствующие флоксс условный нокаут (например, Trp53tm1Brn (называется Trp53L /L, Brca1tm1Aash иBrca1L / L) или условный стук в линии мыши (например, Gt (ROSA)26Sortm1 (Pik3ca-H1047R)Egan) из лаборатории Джексона (JAX) или NCI Мышь Модели рака человека консорциума (MMHCC) репозиторий. Кроме того, для облегчения погони за MECs, которые проходят Cre-опосредоченной рекомбинации, условная линия Cre-reporter также может быть получена от JAX (например, Gt (ROSA)26Sortm1 (EYFP)Cos (называется R26Y).
- Порода Trp53L / L гомозиготных мышей с R26Y гомозиготных мышей репортера или с гомозиготных мышей проведения R26Y репортер аллелей и любые дополнительные floxed условный нокаут или стук в аллели для различных мыши модели, чтобы получить гетерозиготные F1 мужского и женского потомства.
- Интеркросс гетерозиготных F1 мужчин и самок мышей для получения F2 соединения самок мышей, которые гомозиготны для каждого аллеля (как экспериментальные мыши), а также R26Y-только гомозиготные женщины (как контроль мышей). Genotype F2 мышей на основе ПЦР праймеры и велосипедных условиях, перечисленных ниже, путем создания двух стандартных 20 Реакций ПЦР 20 Л (с помощью Taq 5X Master Mix) в двух различных пЦР-трубках, один с праймерами R26Y, а другой с Trp53L грунтовки. Используйте взрослых мышей (обычно около 2-4 месяцев) для всех размножения.
- Для R26Y, выполнить ПЦР на 94 градусов по Цельсию в течение 3 мин, затем при 94 c для 30 с, 60 градусов по Цельсию для 30 с, и 72 C в течение 1 мин в течение 35 циклов, а затем 72 C в течение 3 мин, и поддержание на 14 градусов по Цельсию. Используйте грунтовки (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один диапазон ПЦР 250 bp указывает на R26Y гомозигота, один диапазон ПЦР 500 bp указывает дикий тип (WT), и две полосы ПЦР (R26Y: 250 bp, WT: 500 bp) указывают R26Y гетерозигот (рисунок1A).
Для Trp53L, выполнить ПЦР на 94 градусов по Цельсию в течение 3 мин, затем при 94 c для 30 с, 60 градусов по Цельсию для 30 с, и 72 C в течение 1 мин в течение 35 циклов, а затем 72 C в течение 3 мин, и поддержание на 14 градусов по Цельсию. Используйте грунтовки (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; ii) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна полоса ПЦР 370 bp указывает на гомозиготу Trp53L/L, один диапазон ПЦР 288 б.п. указывает на Trp53q /) WT, а две полосы ПЦР (WT: 288 bp, Trp53L: 370 bp) указывают на Trp53L / » гетерозигот(рисунок 1B).
- Для R26Y, выполнить ПЦР на 94 градусов по Цельсию в течение 3 мин, затем при 94 c для 30 с, 60 градусов по Цельсию для 30 с, и 72 C в течение 1 мин в течение 35 циклов, а затем 72 C в течение 3 мин, и поддержание на 14 градусов по Цельсию. Используйте грунтовки (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
2. Предоперационная подготовка
- Автоклавировать все хирургические инструменты за 1 день до операции.
- Приготовьте 0,1% бромофенол синий в фосфат-буферный солен (PBS) и хранить его при 4 градусах Цельсия. Разбавить Ad-Cre, который будет использоваться для внутрипроточной инъекции в среде DMEM с 0,01 M CaCl2 и бромофенол синий в соотношении 1:10 (т.е., инъекционные смеси).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ad-Cre используется здесь был получен из Университета Айовы Вирусный вектор Core, с запасом вирусный титр в размере 1010-1011 pfu/mL. - Анестезия женская мышь (F2 поколения, как описано в шаге 1.2, возраст от 3-4 недель до взрослых) с помощью изофлуранов камеры и применять глазной мази. Во время процедуры, анестезирует мышь непрерывно, обеспечивая его вдыхает 1%-2,5% изофруран в кислороде. Проверьте глубину анестезии по крайней мере каждые 15 минут, выполняя щепотку ног. Тщательно следите за мышью для любых изменений в частоте дыхания, регулируя уровень изофлуран соответственно, при необходимости.
- Вводят мелоксикам в качестве обезболивания подкожно в дозе 5 мг/кг, до хирургической процедуры.
- Разоблачить сосок хирургического сайта, применяя несколько капель крема для удаления волос; удалить чрезмерное крем и распущенные волосы с помощью мягких бумажных полотенец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в отдельной области от места проведения операции. Бритье не рекомендуется, чтобы избежать повреждения сосков. Используйте осторожность, чтобы удалить химическое депиляционное вещество своевременно. Оставляя агента на слишком долго может привести к химическому ожогу кожи - Дезинфицировать хирургическое место с йодофорами во-первых, а затем 70% алкоголя, и в конце с окончательным применением скраба иодофоров. Делайте это круговыми движениями от центра рабочей зоны к периферии с помощью марлевой губки или хлопчатобумажного аппликатора. Повторите цикл 3x-4x.
3. Внутридукция инъекций
- Используйте асептические методы на протяжении всей хирургической процедуры.
- Сделайте разрез на коже длиной 1 см между двумя четвертыми ингинали MGs(рисунок 2). Тщательно отделить кожный лоскут (с МГ) от теменной перитонеума, чтобы визуализировать молочное протоковое дерево.
- Тщательно держите сосок с щипцы часов и удалить внешний сосок, не разрезая любой близлежащий кожи, используя микро-рассечение ножницами.
- Нагрузка 3-5 л впрыска смеси Ad-Cre в 25 Л Гамильтон шприц с 33 G металлический концентратор иглы прикреплены. Оцените объем инъекционной смеси в шприц на основе синего красителя, включенного в смесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте меньший объем (например, 3 л) при инъекциях в МГ женщин 3-4 недель и больший объем (например, 10 кЛ) при инъекциях в МГ кормящих самок. - Аккуратно удерживайте край кожного лоскута с тонким изогнутым пинцетом и впрысните смесь инъекций Ad-Cre медленно в сосок, тем временем наблюдая за распространением синего красителя в молочное протоковое дерево. Поддерживайте скорость инъекций как можно ниже, чтобы избежать повреждения протокового просвета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция жидкости (как иллюстрируется включены бромофенола синий краситель), распространяется по всему протоковому дереву без утечки в стромальный отсек указывает на успешную внутрипровизм инъекций. - Аккуратно вывести иглу из соска, чтобы избежать утечки инъекционной жидкости.
- Изучите дистальную сторону (т.е. вдали от соска) MG или прилегающую область вводимых сосков. Обратите внимание, что отек синий краситель (т.е. краситель диффузии в близлежащих строма) указывает на инъекции молочной жира колодки, а не успешной внутрипроточной инъекции.
- Закройте хирургические раны (от шага 3.2) в коже раными зажимами.
4. Послеоперационный уход
- Удалите мышь из анестезии и поместите его на грелку внутри чистой клетки для восстановления.
- Администрирование meloxicam подкожно на 5 мг/кг снова, 24 ч после операции.
- Мониторинг общего состояния животного и искать признаки инфекции на месте разреза в течение 5 дней.
- Зажимы для ран удаляются через 7-10 дней после операции.
5. Мониторинг развития опухоли молочной железы
- Мониторинг инъекционных мышей два раза в неделю пальпации для любых признаков развития опухоли молочной железы.
- Как только опухоль ощутима, контролировать мышь ежедневно и измерять размер опухоли, пока она не достигнет экспериментальной конечной точки, как определяется размер (например, достигая 10%-15% от массы тела мыши) или состояние (например, ulcerated или некротический) опухоли, или общее состояние здоровья мыши (например, коматоза, умирающий).
- Эвтанизировать мышь при удушении углекислого газа, а затем вторичным методом (например, вывихшей шейки матки).
- Изолировать ткани опухоли молочной железы и анализировать их с помощью цитометрии потока, иммунофлуоресценции или профилирования экспрессии (например, по секвенированию РНК (RNAseq) или microarray), как описано ранее12.
- Выполните циклометрический анализ потока путем gating для линии отрицательных клеток (Lin- :отрицательный для маркеров линии CD45 «лейкоцитный маркер», CD31 «эндотелиальный маркер клетки» и TER119 «эритроцит маркер»), и анализировать клетки в опухоли на основе их выражение YFP, CD24 и CD29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель PCR генотипирования результаты для R26Y и Trp53L аллели показаны на рисунке 1.
Хотя, в принципе, все 10 MGs могут быть подвергнуты процедуре внутрипроточной инъекции, практически, два четвертых ингиналя MGs, как правило, выбраны для инъекций, из-за их более легкой доступности и больших размеров MG (Рисунок 2). Во время операции важно поддерживать дезинфицированную и незагроможденные рабочую зону и выполнять процедуру с помощью стерильных инструментов(рисунок3). Во время внутрипроточной инъекции включение синего красителя (например, бромофенол синий) в инъекционную смесь помогает визуализировать успешную инъекцию Ad-Cre во все протоковое дерево (рис.4). Самые молодые самки мышей, в которых интрадуктальные инъекции (с меньшим объемом инъекционной смеси) могут быть выполнены успешно являются те, в возрасте 3 недель(рисунок 4A), хотя и для большинства экспериментов индукции опухоли молочной железы, молодые взрослые мыши женского пола (например, 2 месяца возраста) обычно используются(рисунок 4B). Кроме того, внутрипротоковая инъекция (с большим объемом инъекционной смеси) также может быть выполнена у самок мышей в начале/середине беременности, чтобы нацелить альвеолярные клетки(рисунок 4C).
По нашему опыту, у мышей с R26Y репортер и Trp53L / L (с или без каких-либо дополнительных условных аллелей), Cre-опосредованной рекомбинации нарушили Trp53 условный нокаут аллелей (и любые дополнительные аллели нокаута (и любые дополнительные условный нокаут аллелей, если используется) и, тем временем, повернулся на репортера YFP (от аллеля R26Y, а также от любых дополнительных условных стук-в аллель, если используется). Для целевой различных MEC субпопуляций для индукции опухоли молочной железы, Ad-Cre вирусы под контролем различных подмножество MEC конкретных промоутеров были использованы для инъекций(Рисунок 5). Например, Ad-Cre под контролем Keratin 8 (Krt8) промоутер (Ad-K8-Cre) был использован для целевой светящиеся MECs. Ранее мы сообщали об использовании Ad-Cre под контролем Keratin 14 (Krt14) промоутер (Ad-K14-Cre) для целевой базальных MECs13. Однако, как мы уже сообщали, внутрипротектовные инъекции Ad-K14-Cre не только целевые базальные МЭК, но и часть светящихся МЭК13. Недавно мы протестировали еще один Ad-Cre под контролем Keratin 5 (Krt5) промоутер (Ad-K5-Cre)14 и обнаружили, что он может более плотно целевой базальной линии, что приводит к генетической маркировки только базальные MECs (Рисунок 5). Типичные проценты YFP-маркированных MECs от либо Ad-K8-Cre или Ad-K5-Cre инъекции около 0,1%-1%.
Для Trp53L/L; R26Y самок мышей под fVB генетического фона, интрадуктальной инъекции Ad-K8-Cre, которая направлена на их светящиеся MECs, привело к развитию опухолей молочной железы через несколько месяцев после инъекции (Рисунок 6A). Мыши с другим генетическим фоном (например, C57/B6) могут проявлять более длительную задержку развития опухолей молочной железы после инъекции. Из-за включения условного r26Y репортера, опухолевые эпителиальные клетки, как правило, отмечены YFP и могут быть обнаружены цитометрии потока(рисунок6B); они могут быть обогащены за счет сортировки потоков ячеек YFPдля дальнейшего анализа.
Рисунок 1: Представитель PCR генотипирования результаты для R26Y и Trp53L аллелей. WT - дикий тип; Гомозигота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схематическая диаграмма внутрипроточной инъекции вируса Ad-Cre в MG. (A) Разрез в средней линии между двумя четвертыми MGs. (B) Интрадуктальная инъекция Ad-Cre с синим краситель (для лучшей визуализации) в один из четвертых MGs. (C) Закрытие разреза в коже раны клипы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Обзор асептической установки для хирургии грызунов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Визуализация успешной внутрипроточной инъекции во все молочное протоковое дерево. ()Пример внутрипроточной инъекции 3 л инъекционной смеси (с бромофенол синий) в MG 3-недельной женской мыши. (B) Интрадуктальная инъекция 5 зЛ инъекционной смеси в МГ молодой взрослой женской мыши. (C) Интрадуктальная инъекция 10 зЛ инъекционной смеси в МГ женской мыши в начале/середине беременности. (D) Пример инъекции молочной жировой прокладки, а не успешной инъекции интрадукта. Внутрипровальная инъекция 5 л инъекционной смеси в МГ молодой взрослой женской мыши. a) область кожи, окружающая инъекционный сосок; b) другая сторона кожного лоскута, показывающая маммарийную жировую прокладку; желтый круг указывает на краситель, рассеянный в жировой подушечке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Представитель ныеслова цитометрического анализа клеток, отмеченных YFP, при внутридуктовой инъекции. YFP- популяции из MGs r26Y девственных самок через 3 дня после внутрипроточной инъекции Ad-K8-Cre (слева, инъекция в титер 7 х 10pfu/mL) или Ad-K5-Cre (справа, инъекция в титер 7,86 х 10 pfu/ мЛ) вирусов. Сюжеты основаны на анализе CD24 и CD29 окрашивания в линии отрицательного (Lin-; т.е., отрицательный для CD45, CD31, и TER119 выражение) YFPи клетки. Лу Лин-CD24высокийCD29низкий светящийся MEC ворота; Ба и Лин-CD24низкийCD29высокие базальные ворота MEC; стратегия gating для светящихся и базальных MECs основана на Shackleton et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Развитие опухоли в Trp53L/L; R26Y самок мышей интрадуктивно вводят с Ad-K8-Cre. (A) Один представитель мыши показаны рост опухоли (стрелки) через несколько месяцев после инъекции с Ad-K8-Cre. (B) Около 8,8% живых клеток (на основе DAPI окрашивания) от репрезентативной опухоли были положительными для экспрессии YFP, на основе цитометрического анализа потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успех этого подхода для индуцирования опухолей молочной железы из различных субпопуляций MECs опирается не только на выбор соответствующих клеточных типа конкретных промоутеров (для привода Cre выражение), но и на интрадуктальной процедуры инъекций себя. Идея этого подхода заключается в том, что инъекционные вирусы Ad-Cre сохраняются в протоковом дереве, которое представляет собой скрытую структуру с просветом, и поэтому только МЕК подвергаются воздействию вирусов и инфицированы Ad-Cre. Из-за ограниченного проема пространства в молочных протоках, важно только вводить небольшой объем смеси инъекций для каждого MG (т.е., 3-5 л). Вводимый объем также должен быть скорректирован в зависимости от возраста мышей (т.е. меньший объем должен использоваться при введении в 3-х до 4 недель мышей). Когда объем инъекционной жидкости является чрезмерным из-за давления от инъекции и ограниченного протокальное пространство просвет, жидкость может быть "выталкивается" через эпителиальные слои в стромы, что приводит к нежелательной вирусной инфекции в стромальных клетках.
Так как специфичность клеточного типа достигается промоутером, используемым в аденовирусном векторе для привода Экспрессии Cre, ограничением этого подхода является потенциальное отсутствие соответствующего промоутера для целевого экспрессии Cre на конкретную субпопуляцию MEC. Ранее мы сообщали об использовании пан-светящегося Ad-K8-Cre вируса для целевой светящиеся MECs12,13 и использование ad-Wap-Cre вируса для целевой альвеолярных светящихся прародителей5. В этом исследовании, мы показали использование Ad-K5-Cre вируса для целевой базальных MECs(Рисунок 5). Мы по-прежнему не хватает возможности использовать этот подход для целевой эстрогена рецептор-положительный светящийся MEC субпопуляции. Аденовирусный вектор, который мы использовали здесь, мог вместить вставку до 8 кб. Таким образом, для разработки MEC-подсет-специфических Ad-Cre, промоутер используется для привода Cre выражение может быть только менее 7 кб. Практически, большой фрагмент промоутера, даже если менее 7 кб в размере, может быть трудно подклон. Для того, чтобы вписаться в аденовирусный вектор, хотя усеченный промоутер может быть использован, он не может точно резюмировать модель выражения своего соответствующего гена, когда под контролем эндогенного, полного промотора.
R26Y условный репортер, включенный в модель мыши здесь предоставил способ отметить клетки происхождения и проследить их прогрессирование к раковым клеткам. Следует отметить, что процент YFP-маркированных раковых клеток в резкую опухоль оказалась довольно низкой(рисунок 6B). Это может быть связано с возможностью того, что, в дополнение к YFP-отмеченных опухолевых эпителиальных клеток, опухоль также включены многие иммунные клетки и стромальные клетки, которые составляют основную часть опухолевой массы.
По сравнению с другими моделями мыши рака молочной железы, этот подход приводит к инициации опухоли молочной железы от небольшого числа MECs только (например, светящиеся MECs, когда Ad-K8-Cre вводится), часто на клональном уровне12. Поскольку начало опухоли человека, вероятно, будет клональным, этот подход резюмирует этот аспект развития рака человека более верно. Кроме того, даже если p53 нарушается лишь в небольшом числе МЭК, потеря p53 приводит к их клональному расширению, что приводит к производству большего пула мутировавших МЭК; это позволило бы дальнейшую клональную эволюцию от p53-дефицитных MECs (при приобретении дополнительных соматических мутаций)12. Как TP53 является наиболее часто мутировавшим геном в раке молочной железы человека16 и как TP53 мутации является ранним событием в опухоли молочной железы человека17,18, путем объединения Trp53 floxed мыши модель с мышью модели для других онкогенных событий, мы можем изучить, как эти онкогенные события сотрудничают с потерей p53 и как они совместно способствуют развитию молочной опухоли от определенного клеточного происхождения. Кроме того, поскольку для объединения нескольких аллелей требуется меньше размножения, такой подход позволит свести к минимуму затраты на разведение и время, что должно облегчить исследования по моделированию рака молочной железы в более широком масштабе в более короткий период.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) грант R01 CA222560 и Министерство обороны Прорыв премии W81XWH-18-1-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
