Цель этого протокола заключается в описании нового подхода к моделированию рака молочной железы молочной железы, основанного на внутрипроточной инъекции аденовируса в молочные железы мыши. Такой подход позволяет временно контролировать сяполивую манипуляцию онкогенными событиями как клеточного типа, так и органно.
Рак молочной железы является неоднородным заболеванием, возможно, из-за сложных взаимодействий между различными клетками происхождения и онкогенных событий. Мышиные модели играют важную роль в получении информации об этих сложных процессах. Хотя многие модели мыши были разработаны для изучения вклада различных онкогенных событий и клеток происхождения в опухолевом железе, эти модели часто не клеточного типа или органа конкретных или не может вызвать начало опухоли молочной железы в временно контролируемым образом. Здесь мы описываем протокол для создания нового типа моделей мыши рака молочной железы на основе внутрипроточной инъекции Cre-выражения аденовируса (Ad-Cre) в мышь молочных желез (MGs). Из-за прямого впрыска Ad-Cre в молочные протоки, этот подход является МГ конкретных, без каких-либо нежелательных индукции рака в других органах. Процедура внутрипротектольной инъекции может быть выполнена у мышей на разных стадиях их развития МГ (таким образом, она позволяет височное управление индукцией рака, начиная с 3-4 недель). Специфика клеточного типа может быть достигнута с помощью различных клеточных микропромоутеров для привода Экспрессии Cre в аденовирусном векторе. Мы показываем, что светящиеся и базальные молочные эпителиальные клетки (MECs) могут быть плотно ориентированы на Cre/loxP основе генетических манипуляций с помощью внутрипроточной инъекции Ad-Cre под контролем кератина 8 или кератина 5 промоутер, соответственно. Включив условный Репортер Cre (например, Cre/loxP-индуцируемого репортера Rosa26-YFP), мы показываем, что MECs, ориентированные на Ad-Cre, и опухолевые клетки, полученные из них, можно проследить, следуя за репортером-положительными клетками после внутрипротектонных инъекций.
Общая цель этого метода заключается в разработке нового подхода моделирования рака молочной железы на основе внутрипроточной инъекции Ad-Cre в мышь MG. Рекомбинационный генетический подход на основе cre/loxP широко используется для моделирования рака молочной железы у мышей. Первое поколение Cre/ loxP основе рака молочной железы мыши модели генерируются с помощью Cre-выражения трансгенных мышей под контролем MEC конкретных промоутеров (например, MMTV-Cre для светящихся MECs и часть базальных MECs, Wap-Cre и Blg-Cre для светящихся прародителей и альвеолярных светящихся МЭК, K14-Cre для базальных и часть светящихся MECs1,2,4,5)6, 7 (г. , 8 , 9. Однако, в то время как эти Cre трансгенных линий позволяют пространственный контроль Cre выражения (т.е., в различных подмножествах MECs), они не позволяют временной контроль Cre выражения и Cre / loxP-опосредованных генетических манипуляций. Второе поколение Cre/loxP основе рака молочной железы мыши модели использовать индуцируемой Cre деятельности / выражения подходов (например, использование Cre-эстроген рецепторов слияния “CreER”, который может только вызвать Cre / loxP рекомбинации при применении тамоксифена), и в результате, эти генетические инструменты позволяют как пространственные, так и временные контроля активации онкогенных событий в МЭК (например, K8-CreER– и K5-CreER-модели)10,11,12 . В обоих поколениях моделей мыши рака молочной железы, как промоутеры, используемые для привода Cre или CreER выражение (например, Krt8, Krt5) также могут быть активны в эпителиальных клетках других органов (т.е., они клеточного типа конкретных, но не орган-специфических) или имеют вытекающей выражение в типах клеток, кроме эпителиальных клеток (например, MMTV, который имеет вытекающей активности в гематопоэтиных клетках костного мозга), эти подходы могут привести к развитию нежелательного рака (ы) в других органах (ы). Если эти неожиданные раковые заболевания вызывают летальность у пораженных мышей, первоначальная цель моделирования рака молочной железы у этих мышей может быть запрещена (например, MMTV-Cre-управляемыеонкогенные события могут привести к гематопоиетические злокачественные новообразования и ранняя смерть мышей , из-за утечки промоутера MMTV в гематоподетические клетки)4.
Здесь мы сообщаем о подходе к моделированию рака молочной железы у мышей, который позволяет как клеточного типа, так и орган-специфические манипуляции онкогенных событий в временно контролируемой основе. Этот подход основан на внутрипроточной инъекции Ad-Cre в мышь MGs (и, таким образом, орган-специфический). Выражение Cre можно контролировать с помощью различных субпопуляционных промоутеров MEC, встроенных в аденовирусный вектор (например, Krt8 для светящихся МЭков, Krt5 для базальных МЭК, тем самым достигая специфичности клеточного типа). Индукция рака в MGs может быть временно контролируется путем инъекции Ad-Cre в мышей в разном возрасте, начиная с 3-4 недель (пубертальный) для взрослой стадии.
Успех этого подхода для индуцирования опухолей молочной железы из различных субпопуляций MECs опирается не только на выбор соответствующих клеточных типа конкретных промоутеров (для привода Cre выражение), но и на интрадуктальной процедуры инъекций себя. Идея этого подхода заключается в…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) грант R01 CA222560 и Министерство обороны Прорыв премии W81XWH-18-1-0037.
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |