Summary
यहाँ प्रस्तुत कुशल CRISPR/Cas9 ribonucleoप्रोटीन-मध्यस्थ जीन संपादन के लिए एक प्रोटोकॉल है स्तनधारी कोशिकाओं में ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग कर.
Abstract
जीन संपादन nucleases, CRISPR द्वारा प्रतिनिधित्व संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9), जैव चिकित्सा अनुसंधान में मुख्यधारा के उपकरण होते जा रहे हैं. transfection द्वारा लक्ष्य कोशिकाओं में CRISPR/Cas9 तत्वों का सफल वितरण कुशल जीन संपादन के लिए एक शर्त है. इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि ट्यूब इलेक्ट्रोपोरोनेशन (टीई) मशीन CRISPR/Cas9 ribonucleoप्रोटीन (RNP) की डिलीवरी, एकल-संक्षिप्त ओलिगोडोऑक्सीन्यूक्लिओटाइड (sODN) दाता टेम्पलेट्स के साथ स्तनधारी कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लिए, मजबूत करने के लिए सुराग सटीक जीन संपादन की घटनाओं. सबसे पहले, टीई CRISPR/Cas9 RNP और ssODNs देने के लिए interleukin 2 रिसेप्टर सबयूनिट गामा (IL2RG) जीन और sepiapterin रिडक्टेज (एसपीआर) जीन खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तनों को प्रेरित करने के लिए लागू किया गया था। 3.57%-20% की सटीक उत्परिवर्तन दर जीवाणु टीए क्लोनिंग अनुक्रमण द्वारा निर्धारित के रूप में प्राप्त किया गया. एक ही रणनीति तो epidermal विकास कारक रिसेप्टर (EGFR), मायोसिन बाध्यकारी प्रोटीन सी, कार्डियक (Mybpc3), और हीमोग्लोबिन subunit बीटा (HBB) सहित कई नैदानिक रूप से प्रासंगिक जीन पर मानव iPSCs में इस्तेमाल किया गया था. लगातार, अत्यधिक सटीक उत्परिवर्तन दर हासिल की गई (11.65%-37.92%) के रूप में गहरी अनुक्रमण (DeepSe) द्वारा निर्धारित. वर्तमान कार्य दर्शाता है कि CRISPR/Cas9 RNP की ट्यूब इलेक्ट्रोपोट्रेशन स्तनधारी कोशिकाओं में जीन संपादन के लिए एक कुशल transfection प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है.
Introduction
CRISPR/Cas9 जीन संपादन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रोग्राम योग्य न्यूक्लीज है। यह जीनोम में एकल गाइड आरएनए (sgRNA) दोनों लक्ष्य दृश्यों और एक आसन्न प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रम की मध्यस्थता मान्यता के माध्यम से काम करता है। Cas9 न्यूक्लेस एक डबल-स्लेड डीएनए ब्रेक (डीएसबी) पीएएम अनुक्रम1के ऊपर तीन न्यूक्लिओटाइड स्थित उत्पन्न करता है। DSBs या तो त्रुटि-प्रवण गैर-homologous अंत में शामिल होने (NHEJ) या homology निर्देशित मरम्मत (HDR) रास्ते के माध्यम से मरम्मत कर रहे हैं. HDR मार्ग के माध्यम से सटीक जीन संपादन प्राप्त करने के लिए, दाता टेम्पलेट्स अक्सर प्लाज्मिड डीएनए (pDNA) या एकल-स्लेड ओलिगोडियोक्सिन्यूक्लिओटाइड (sODN) के प्रारूप में प्रदान की जाती हैं।
CRISPR/Cas9 और sgRNA तीन स्वरूपों में कोशिकाओं को दिया जा सकता है: Cas9 प्रोटीन और gRNA2,3के ribonucleoप्रोटीन (RNP) परिसर ; Cas9 mRNA और sgRNA4,5; या प्लाज्मिड डीएनए (पीडीएनए) जिसमें आवश्यक प्रमोटर, संचालित एसजीआरए, और कैस9 कोडिंग क्षेत्र6,7,8शामिल हैं । कई समूहों ने दिखा दिया है कि जब CRISPR/Cas9 RNP के रूप में दिया जाता है, जीन संपादन दक्षता अक्सर pDNA या MRNA प्रारूपों में प्राप्त उन outperforms, न्यूक्लिक एसिड9की तुलना में RNP के बहुत छोटे आकार के कारण . इसके अलावा, यह पहले से पता चला है कि एक उपन्यास ट्यूब electroporation (टीई) मशीन विशेष रूप से कई सेल प्रकार9में जीन संपादन अनुप्रयोगों में प्रभावी है.
वर्तमान कार्य में प्रस्तुत कई नैदानिक रूप से प्रासंगिक लोसी में विभिन्न प्रजातियों के स्तनधारी कोशिकाओं को CRISPR/Cas9 RNP के वितरण के लिए TE का उपयोग करने में एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल है। इस उपन्यास ते transfection तकनीक और उच्च HDR दर घटना जैव चिकित्सा अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोगों मिल सकता है.
Protocol
सभी पशु रखरखाव, देखभाल, और उपयोग प्रक्रियाओं की समीक्षा की और मिशिगन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. कोशिकाओं की तैयारी
-
अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (ATCC) से मानव iPSCs (ACS-1030) प्राप्त करें। आपूर्तिकर्ता के निर्देशों का पालन करते हुए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर (5% सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस पर) में फीडर-मुक्त सेल संस्कृति माध्यम (सामग्री की तालिका देखें) के साथ कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स पर संस्कृति iPScs।
- 2 ज transfection से पहले, 10 डिग्री एम Rho-संबद्ध, coiled-कुंडल युक्त प्रोटीन kinase (ROCK) अवरोधक Y27632 के साथ iPSCs का इलाज (जो का उपयोग अलग मानव hiPSCs के apoptosis कम कर देता है और अस्तित्व और बिना hiPSCs के क्लोनिंग दक्षता बढ़ जाती है उनकी बहुरूपियाको प्रभावित करना।
- जब transfecting, सेल टुकड़ी समाधान के साथ iPSCs भंग (सामग्री की तालिकादेखें) 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एकल कोशिकाओं के लिए कोशिका संख्या की गणना.
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खरगोश कान त्वचा ऊतक बायोप्सी की एक प्राथमिक संस्कृति का उपयोग कर एक खरगोश फाइब्रोब्लास्ट सेल संस्कृति की स्थापना, जैसा कि पहले10वर्णित .
- एक 0.5 सेमी x 0.5 सेमी कान त्वचा बायोप्सी खरगोश कान की नोक से प्राप्त की है। कान के ऊतकों से बाल दाढ़ी.
- 5% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ Dulbecco के फॉस्फेट-बफर ेड नमकीन (DPBS) के साथ 2x कुल्ला। एक नया 6 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान के लिए कान के ऊतकों स्थानांतरण, तो छोटे टुकड़ों में ऊतक में कटौती ($1.0 मिमी x 1.0 मिमी). बाहर सुखाने से ऊतक को रोकने के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम की कुछ बूँदें जोड़ें.
- एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान के लिए कटा हुआ ऊतक बिखरा हुआ है, तो संस्कृति माध्यम के 10 एमएल जोड़ें. खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में सुसंस्कृत कर रहे हैं। सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस) में ऊतक संस्कृति पकवान रखो।
- चढ़ाना के बाद तीन से पांच दिन, 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को पचाने के लिए trypsin-EDTA का उपयोग करें। सेल संख्या की गणना करें।
2. डिजाइन और GRNAs और दाता Oligos के संश्लेषण
- प्रत्येक जीन के लिए, डिजाइन गाइड आरएनए एक ऑनलाइन उपकरण का उपयोग कर लक्षित टिड्डी के अनुक्रम के आधार पर (उदाहरण के लिए, और lt;http://crispor.tefor.net/
- ब्याज के डीएनए अनुक्रम में पेस्ट करें.
- एक जीनोम और प्रोटोस्पेसर संलग्न आकृति (पीएएम) का चयन करें। इनपुट डीएनए दृश्यों में संभव गाइड दृश्यों उत्पादन पृष्ठ पर प्रदर्शित किया जाएगा. यह उच्च भविष्यवाणी दक्षता और कम ऑफ-लक्ष्य क्षमता के साथ gRNA का चयन करने के लिए सिफारिश की है.
- GRNAs transcribing के लिए एक वाणिज्यिक विक्रेता द्वारा डीएनए संश्लेषित करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक gRNA संश्लेषण किट का उपयोग कर gRNA के इन विट्रो प्रतिलेखन में प्रदर्शन करते हैं।
- GRNA संश्लेषण किट में शामिल एक आरएनए शुद्धि माइक्रो कॉलम का उपयोग कर के लिए gRNA को शुद्ध करें। एकाग्रता को मापने, तो -80 डिग्री सेल्सियस पर GRNAs की दुकान।
- प्रत्येक उत्परिवर्तन साइट के लिए एक sSODN दाता टेम्पलेट डिज़ाइन करें. SODNs IDT जैसे वाणिज्यिक विक्रेताओं द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है। सामान्य में, प्रत्येक ssODN है 120-160 न्यूक्लिओटाइड (nt) लंबाई में, बाएं होमोलोजी हाथ में 60-80 nt और सही homology हाथ में 60-80 nt से मिलकर. संपादित डीएनए के recuting को रोकने के लिए, PAM पर एक मूक उत्परिवर्तन जब भी संभव हो ssODN में पेश किया जाना चाहिए. CRISPR कट साइट के रूप में संभव के रूप में इच्छित जीनोमिक परिवर्तन के करीब स्थित होना चाहिए.
3. Cas9 RNP और ssODNs के ट्यूब विद्युत
- अनुभाग 1 में वर्णित कक्षों को तैयार करें.
- 20 डिग्री सेल्सियस विद्युत बफर में 2-3 x 105 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। एक एकल सेल निलंबन का उत्पादन करने के लिए ध्यान से ऊपर और नीचे पिपेट।
- Cas9 RNP transfection के लिए, 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर gRNA के 0.67 डिग्री ग्राम के साथ Cas9-NLS प्रोटीन के premix 2 $g. इसके बाद, कोशिकाओं के साथ 2 डिग्री एसओडीएन के साथ गठित आरएनपी परिसर को धीरे-धीरे मिलाएं।
- ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन किट द्वारा प्रदान किए गए यूनिवर्सल फिट पिपेट युक्तियों का उपयोग करके सेल मिश्रण को 20 डिग्री सेल्सियस इलेक्ट्रोपोरेशन ट्यूब में स्थानांतरित करें। बेहतर इलेक्ट्रोपोरेशन प्राप्त करने के लिए, स्थानांतरण के दौरान हवा के बुलबुले के गठन से बचने की कोशिश करें।
- इलेक्ट्रोपोरेटर के स्लॉट में इलेक्ट्रोपोरेशन ट्यूब रखें और समाप्त करने के लिए "जाओ" दबाएँ। प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए निर्माता के सुझाए गए पैरामीटर का पालन करें. उदाहरण के लिए, मानव iPSCs और खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के लिए, वोल्टेज सेट 420 V है और पल्स समय है 30 ms. एक सफल electroporation चक्र इलेक्ट्रोपोरेटर के प्रदर्शन स्क्रीन पर पल्स रिपोर्ट द्वारा संकेत दिया है.
- इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बाद, मानव आई पी एस कोशिकाओं को सेल संस्कृति भाग में वर्णित पूर्व-वार्म्ड Y-27632 युक्त संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में स्थानांतरित करें। खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के लिए, उन्हें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ DMEM को स्थानांतरित.
- एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के एक अच्छी तरह से resuspended कोशिकाओं प्लेट.
- संस्कृति माध्यम हर दिन बदलें. Y-27632 मानव iPSC संस्कृति माध्यम से हटा दिया गया है 24 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोट्रेशन.
4. जीन संपादन घटनाओं का विश्लेषण
- इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बाद हार्वेस्ट सेल 72 एच। मानव iPSCs के लिए खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं या सेल टुकड़ी समाधान के लिए trypsin-EDTA का उपयोग संस्कृति प्लेट से पाचन कोशिकाओं। अपकेंद्रित्र के बाद, 350 एमएल लाइसिस बफर (1 एम ट्रास एचसीएल, 5 एम नासीएल, 0.5 एम ईडीटीए; पीएच 8.0, 10% एसडीएस, 20 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीनेज के स्टॉक के 20 लाख प्रति 1 एमएल लाइसिस बफर के साथ, तो रात में 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
- मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर phenol-क्लोरोफॉर्म के साथ जीनोमिक डीएनए निकालें.
- उच्च निष्ठा डीएनए polymerase का उपयोग कर लक्षित क्षेत्र युक्त 100-200 बीपी डीएनए टुकड़े बढ़ाना, तो एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर या सीधे पीसीआर उत्पादों से एक पीसीआर एसवी मिनी किट का उपयोग कर जैल से डीएनए टुकड़े शुद्ध।
- बैक्टीरियल कॉलोनी अनुक्रमण द्वारा जीन संपादन दक्षता निर्धारित करने के लिए, एक TOPO टीए क्लोनिंग किट का उपयोग कर एक पीसीआर4-TOPO वेक्टर में शुद्ध पीसीआर उत्पादों को लिगेज। बेतरतीब ढंग से जीवाणु क्लोन लेने, तो TOPO टीए क्लोनिंग किट द्वारा प्रदान की एक सार्वभौमिक अनुक्रमण प्राइमर का उपयोग कर आवेषण अनुक्रम।
- गहरी अनुक्रमण द्वारा जीन संपादन दक्षता निर्धारित करने के लिए, एक डीएनए अनुक्रमण कोर में CRISPR प्रवर्धक अनुक्रमण के लिए चरण 4.3 से शुद्ध PCR उत्पादों ($ 100-200 बीपी) भेजें।
Representative Results
खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के लिए Cas9 आरएनपी और ssODNs के टीई
स्तनधारी कोशिकाओं को कैस9 आरएनपी की टी-मध्यीय वितरण की समग्र प्रक्रिया चित्र 1में दर्शाई गई है। सबसे पहले, C231Y और Q235X उत्परिवर्तनों IL2RG जीन में उत्पादित किया गया, और R150G उत्परिवर्तन खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में एसपीआर जीन में उत्पादन किया गया था. आईएल2आरजी और एसपीआर जीनों में नुकसान-ऑफ-फंक्शन उत्परिवर्तनों को क्रमशः प्राथमिक इम्यूनोडेफिशियेंसी11 और मोटर और संज्ञानात्मक घाटे12के कारण जाना जाता है।
विशिष्ट sgRNA डिजाइन चित्र 2कमें सचित्र हैं। लक्षित क्षेत्रों को बढ़ाना करने के लिए प्रयुक्त प्राइमर तालिका 3में सूचीबद्ध हैं। सारणी 1में sodNs के अनुक्रम दिखाए गए हैं। जीन संपादन दर जीवाणु टीए क्लोनिंग द्वारा निर्धारित की गई थी (चित्र 2ख) . IL2RG C231 टिड्डी में, 28 क्लोन है कि अनुक्रम थे में से, एक (3.57%) सटीक C231Y उत्परिवर्तन किया, चार (14.28%) किया प्रविष्टि या विलोपन (इंडेल) उत्परिवर्तन, और शेष 23 (82%) जंगली प्रकार के थे. IL2RG Q235 स्थानों पर, 27 क्लोन कि अनुक्रम थे में से, दो (7.41%) सटीक Q235X उत्परिवर्तन किया, तीन किया indel उत्परिवर्तन (11.11%) और शेष जंगली प्रकार के थे. एसपीजी R150 लोकपथ पर, 20 क्लोन अनुक्रम में से, पांच (25%) सटीक R150G उत्परिवर्तन किया, 10 (50%) इन्डल उत्परिवर्तन किया, और शेष जंगली प्रकार थे.
मानव आई पी एस सी के लिए Cas9 आरएनपी और ssODNs के टीई
TE तो मानव iPSCs के लिए Cas9 RNP और ssODNs देने के लिए इस्तेमाल किया गया था और EGFR, Mybpc3, और HBB जीन में नैदानिक रूप से प्रासंगिक loci लक्ष्य. EGFR T790 समीपस्थ क्षेत्र में प्वाइंट उत्परिवर्तन ईजीएफआर टायरोसिन किनेस इनहिबिटरों को गैर-छोटी कोशिका फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) के रोगियों में प्रतिरोध प्रदान करते हैं जो ईजीएफआर13के उत्परिवर्तनों को सक्रिय करते हैं। Mybpc3 में एक्सन 16 में एक frameshift उत्परिवर्तन hypertrophic cardiomyopathy14में फंसा हुआ है . HBB जीन में E6V बिंदु उत्परिवर्तन सिकल सेल रोग15की ओर जाता है .
विशिष्ट sgRNA डिजाइन चित्र 3कमें सचित्र हैं। लक्षित क्षेत्रों को बढ़ाना करने के लिए प्रयुक्त प्राइमर तालिका 3में सूचीबद्ध हैं। सारणी 1में sodNs के अनुक्रम दिखाए गए हैं। जीन संपादन दर ों द्वारा निर्धारित की गई थी (चित्र 3ख) EGFR लोकपथ पर, alleles के 15.68% सटीक बिंदु उत्परिवर्तन किया (6,315 पढ़ता है), 22.75% indel उत्परिवर्तन किया (9,162 पढ़ता है), और शेष 61.57% जंगली प्रकार थे (24,797 पढ़ता है). Mybpc3 स्थानों पर, 37.92% सटीक 4-बीपी TGAA विलोपन किया (11,654 पढ़ता है), 2.24% indel उत्परिवर्तन किया (410 पढ़ता है) और शेष 59.84% जंगली प्रकार थे (18,692 पढ़ता है). HBB टिड्डी में, 11.65% सटीक E6V उत्परिवर्तन किया (6,565 पढ़ता है), 23.35% इनडल उत्परिवर्तन किया (13,163 पढ़ता है) और शेष 65% जंगली प्रकार थे (36,644 पढ़ता).
चित्र 1: Cas9 RNP की ट्यूब इलेक्ट्रोपोट्रेशन का प्रवाह चार्ट.
चित्र 2 : खरगोश फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के जीन संपादन. (क) लक्ष्य अनुक्रमों का चित्रण। बक्से लक्षित loci संकेत मिलता है. रेखांकित पत्र GRNA दृश्यों से मेल खाते हैं. लाल रंग के पत्र पीएएम दृश्यों का संकेत देते हैं। (ख) जीन संपादन घटनाओं के टीए क्लोनिंग परिणाम। बक्से ठीक उत्परिवर्तित लोसी से संकेत मिलता है। दिखाया गया इन्डेल अनुक्रम एक एलीले प्रकार का केवल प्रतिनिधि होता है। अन्य indel अनुक्रम नहीं दिखाए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : मानव iPSCs के जीन संपादन. (क) लक्ष्य अनुक्रमों का चित्रण। बक्से लक्षित loci संकेत मिलता है. रेखांकित पत्र GRNA अनुक्रम से मेल खाते हैं. लाल रंग के पत्र पीएएम दृश्यों का संकेत देते हैं। (ख) जीन संपादन की घटनाओं के दीपसेक परिणाम। बक्से ठीक उत्परिवर्तित लोसी से संकेत मिलता है। लाल रंग के पत्र मूक उत्परिवर्तनों कि दाता टेम्पलेट्स में पेश किए गए संकेत मिलता है. दिखाया गया इन्डेल अनुक्रम एक एलीले प्रकार का केवल प्रतिनिधि होता है। अन्य indel अनुक्रम नहीं दिखाए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| ठिकाना |
ओलिगो अनुक्रम |
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| (लक्षित उत्परिवर्तन) | ||||||||
| खरगोश IL2RG (C231Y) | एजीजीजीजीजीजीजीजीएजीजीएजीजीएजीएजीजीएजीजीएजीजीएसीटीसीसीटीसीजीजीजीसीजीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीटीसीटीसीटीटीजीटीटीजीटीजीजीजीसीटीकेटीजीजीजीजीजीजीटीजीजीजीटीजीजीजीटीजीगटगट GAATGAGCCACCATCACTGGGAGCAAAACTCAAAATGGGCCT |
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| खरगोश IL2RG (Q235X) | एजीजीजीजीजीजीजीजीजीसीएजीजीएजीएजीसीकेटीसीजीजीजीसीजीटीटीटीटीसीटीसीजीटीटीटीटीटीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीटीगटीगगट GAATGAGCCACCATCACTGGGAGCAAAACTCAAAATGGGCCT |
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| खरगोश एसपीआर | gacctccatgctgcctgcctcctgctcctcgcgctgccgctcgcccggggtgggtggtcgggtgacatcgcggtcggtgtgtgtgcgtgtgctcggtgtgctcggtcggtcggtcggtcgccccccccccctcgcctcacgctcgcgcgcgcgcgcgcgtcgcggtgtcggtgtcggtcggtcggtcggtcggtcggtcggtgtgtcgcgcgtgtcgcggtgtcggtcggtgtcggtcggtcgcgtcggtcggtcggtcggtcgtcggtcggtgtcgcgcggtgtcggtcggtgtcggtgtcggtgtcggtgtgtcggtgtcggtgtgtgtcggtgtgtgtgtgtgtcggtgtgtgtcg cgctgtac |
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| (R150G) | ||||||||
| मानव EGFR | ACGTGATGGCCAGCGTGGACACCCCCCCGTGCCCTGCTGCCTCTCCTCACTACAGTGATACCC AGCTCATGCCCTCGCCTGCCCTGTGTGTGTGTCCGGGAACAAGAAATGCCCCAGTAC |
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| (बिंदु उत्परिवर्तन T790 के निकट) | ||||||||
| मानव Mybpc3 | GCCCCTGTGCTCATCACGCCCCTTGGAGGCCGCGTGGTGGGCGCGCGCGCGCGGGGGGTTGCGAGGTGATCGGA GGAGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTCAGAGAGGGGGTGTGGGGGCAT |
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| (4-बीपी विलोपन) | ||||||||
| मानव HBB | टीसीटीजीएजीजीटीटीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीकाकाकाकाकाकाकागकाकागगगगटगगगगगगगटगटगगटगगटगगटगगटगगगगगगगगगगगगगगटगगगटगगटगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगटगगगगगगगगगगगगटगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगग सीटीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजी |
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| (E6V) | ||||||||
तालिका 1: ssODNs के अनुक्रम.
| चरण | समस्या | संभावित कारण | समाधान |
| 2.1 | कम indel दर | गरीब गाइड आरएनए डिजाइन, गाइड आरएनए स्टॉक और 6 महीने, कम गाइड आरएनए एकाग्रता | डिजाइन गाइड आरएनए, उत्पादन / आदेश नई गाइड आरएनए। |
| 2.3 | कम पीजीई दक्षता | गरीब दाता डीएनए डिजाइन, कम कुशल गाइड आरएनए, दाता डीएनए या गरीब गुणवत्ता डीएनए की गलत राशि | होमोलोजी हाथ की लंबाई बढ़ाएँ, पीएएम उत्परिवर्तन का परिचय दें, दाता डीएनए में मूक उत्परिवर्तनों का परिचय दें, अधिक कुशल गाइड आरएनए का उपयोग करें, गाइड आरएनए पर Cas9 प्रोटीन के अनुपात को अनुकूलित करें। |
| 3.4 | विफल ट्रांसफेक्शन | विद्युत ीय ट्यूब, गलत वोल्टेज / | हवा के बुलबुले के गठन से बचने की कोशिश करो, वोल्टेज समायोजित / |
| 3.6 | विद्युतपोट्रन के बाद निम्न कोशिका व्यवहार्यता | एकल मानव ipsc के कम अस्तित्व | इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद रॉक अवरोध करनेवाला जोड़ें, कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि। |
| 4.1 | विफल PCR | उच्च GC सामग्री, या दोहराए जाने वाले अनुक्रम | पीसीआर हालत का अनुकूलन, पीसीआर प्रणाली के लिए DMSO जोड़ें। |
तालिका 2: बार-बार समस्याओं के लिए समस्या निवारण मार्गदर्शिकाएँ।
| प्राइमर नाम | अनुक्रम | नोट |
| आरबी-आईएल2आरजी-एफ | CATGACAGGAGGGTCCC | बढ़ाना खरगोश IL2RG डीएनए टुकड़ा के लिए |
| आर बी-आईएल2आरजीआर | टीजीसीसीएगागाकाकाजीजीगाएसी | |
| आरबी-एसपीआर-एफ | GTACTTTGGGACAGAGE | बढ़ाना खरगोश एसपीआर डीएनए टुकड़ा के लिए |
| आरबी-एसपीआर-आर | सीटीसीएजीसीसीटीसीटीसीटीजीजीजी | |
| एच-ईजीएफआर-एफ | TGATGGCCAGCGTGGACAAC | मानव EGFR डीएनए टुकड़ा बढ़ाना के लिए |
| एच-ईजीएफआर-आर | ACCAGTTGAGGTACTGGG | |
| एच-मायबपीसी3-एफ | ATGCCCCGCTTGTGGGAAC | मानव Mybpc3 डीएनए टुकड़ा बढ़ाना के लिए |
| एच-मायबपीसी3-आर | TCAGGGGAGCCACAT | |
| एच-एचबीबी-एफ | TAACCTTGATACCAACCTGC | मानव HBB डीएनए टुकड़ा बढ़ाना के लिए |
| एच-एचबीबी-आर | कैटTTGCTTGACACAACT |
तालिका 3: प्राइमर चरण 4.3 में इस्तेमाल किया।
Discussion
ट्यूब इलेक्ट्रोपोर्नेशन विधि CRISPR/Cas9 RNP और खरगोश और मानव कोशिकाओं को ssODNs देने में प्रभावी था, मजबूत सटीक जीन संपादन के लिए अग्रणी (पीजीई). टीई और अन्य पारंपरिक इलेक्ट्रोपोरोनेशन उपकरणों के बीच प्राथमिक अंतर एक ट्यूब का उपयोग है, जिसमें दो इलेक्ट्रोड ट्यूब के ऊपर और नीचे हैं और नमूना पूर्ण में लोड किया जाता है तो इलेक्ट्रोपोरेशन पर बंद कर दिया जाता है (चित्र 1)। इसके विपरीत, एक पारंपरिक cuvette में, इलेक्ट्रोड पक्षों पर हैं और नमूना पूरी तरह से विद्युत पोरेटेशन के दौरान बंद नहीं है. इस नए डिजाइन हवा बुलबुला पीढ़ी को कम कर देता है और हवा बुलबुला आकार है, जो फलस्वरूप बिजली वोल्टेज के भी वितरण में सुधार, और एक परिणाम के रूप में कम सेल मौत और उच्च transfection दक्षता9की ओर जाता है compresses. वर्तमान कार्य में, उच्च पीजीई दरें (15%-37%) मानव iPSCs में EGFR, Mybpc3 और HBB जीन को लक्षित हासिल किया गया. ये परिणाम एक पूर्व रिपोर्ट के अनुरूप हैं जिसमें मानव स्टेम कोशिकाओं9में उच्च पीजीई दर प्राप्त की गई थी .
रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तनों को खरगोश कोशिकाओं में आईएल2आरजी और एसपीआर जीनों में लक्षित किया गया था। हाल ही में, आईएल2आरजी-नॉकआउट खरगोशों को मानव एक्स से जुड़े गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशियेंसी (एससीआईडी-एक्स 1)16,17के लिए मॉडल के रूप में तैयार किया गया है। वर्तमान काम से पता चलता है कि रोगी IL2RG उत्परिवर्तनों (उदा., C231Y और Q235X) कुशलतापूर्वक खरगोश कोशिकाओं में उत्पन्न किया जा सकता है, रोगी उत्परिवर्तनले जाने वाले SCID-X1 खरगोश मॉडल बनाने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन. यह भी दिखा दिया गया था कि एसपीआर R150G उत्परिवर्तनों कुशलतापूर्वक खरगोश कोशिकाओं में बनाया जा सकता है. इस उत्परिवर्तन से 12 बच्चोंमें मोटर और संज्ञानात्मक कमी होती है . इन IL2RG और एसपीआर उत्परिवर्तन खरगोश मॉडल, एक बार उत्पन्न, translational अध्ययन के लिए मूल्यवान पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं. वे भी इन मोनोजेनिक रोगों के लिए जीन संपादन आधारित चिकित्सकीय स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीन संपादन अनुप्रयोगों के लिए एक चिंता का विषय है ऑफ-लक्ष्य संपादन घटनाओं. पहले वर्णित विधियों का उपयोग करते हुए इस अध्ययन ( तालिकाS1)में प्रयुक्तsgRNAs के लिए अनुमानित शीर्ष ऑफ-लक्ष्य स्थलों पर इनडेल दरों का विश्लेषण किया गया . कुल में, सात संभावित शीर्ष ऑफ-लक्ष्य loci sg-rb-IL2RG-01 के लिए विश्लेषण किया गया, एसजी-आरबी-एसपीआर के लिए पांच, एसजी-hEGFR के लिए सात, एसजी-hMybpc3 के लिए पांच, और sg-HHBB के लिए सात, तालिका S2में सूचीबद्ध प्राइमर का उपयोग कर. T7E1 परख (चित्र S1)द्वारा कोई ऑफ-लक्ष्य indels का खुलासा नहीं किया गया था, जो इन sgRNAs का उपयोग करके CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीन संपादन के लिए न्यूनतम ऑफ-लक्ष्य जोखिमों को दर्शाता है। यह यह भी इंगित करता है कि ट्यूब इलेक्ट्रोपोयोजन विधि स्वयं के कारण या ऑफ-लक्ष्य संपादन में वृद्धि नहीं करता है। फिर भी, अवांछनीय ऑफ-लक्ष्य संपादनों को कम करने या समाप्त करने के लिए प्रयास ों को समर्पित किया जाना चाहिए। पूरे जीनोम अनुक्रमण नैदानिक अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए इरादा कर रहे हैं कि कोशिकाओं के लिए ऐसी घटनाओं को बाहर करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
तकनीकी स्तर पर, CRISPR/Cas9 RNP ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा कुशल सटीक जीनोम संपादन प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित प्रमुख कारक माना जाता है। सबसे पहले, यह भविष्यवाणी कम बंद लक्ष्य क्षमता के साथ एक कुशल sgRNA का चयन करने के लिए सलाह दी जाती है. यह खूंटी अनुप्रयोगों के लिए उपयोग करने से पहले चयनित sgRNA की indel दक्षता को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह दुर्लभ नहीं है कि एक सॉफ्टवेयर की भविष्यवाणी अच्छा sgRNA सत्यापन चरण में विफल रहता है.
दूसरा, उच्च PGE प्राप्त करने के लिए, यह जब भी संभव हो ssODN दाता के लिए एक पीएएम उत्परिवर्तन प्रेरित करने के लिए सिफारिश की है. तर्क यह है कि ऐसा करके, CRISPR/Cas9 दाता टेम्पलेट एकीकरण के बाद फिर से काटने को रोका है. कुछ मामलों में, पीजीई ही पीएएम उत्परिवर्तनों का परिचय देता है। अन्य मामलों में, पीएएम अनुक्रम में मूक उत्परिवर्तनों को पेश करना संभव है। अगर एक पीएएम उत्परिवर्तन संभव नहीं है, तो यह सलाह दी जाती है कि दाता में कई मूक उत्परिवर्तनों को शामिल करने का प्रयास करें जो sgRNA अनुक्रम से मेल खाती है।
तीसरे, विशेष रूप से टीई के लिए प्रासंगिक, यह महत्वपूर्ण है हवा बुलबुले के गठन से बचने के लिए जब कोशिकाओं और RNP मिश्रण विद्युत नली को स्थानांतरित. जबकि एक टीई ट्यूब के डिजाइन पहले से ही हवा बुलबुला गठन को कम करता है, सावधान हैंडलिंग आगे कम हो जाएगा और यहां तक कि हवा बुलबुला गठन से बचने के पूरा कर सकते हैं। CRISPR/Cas9 ribonucleoप्रोटीन मध्यस्थता सटीक जीन संपादन के लिए ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन के अनुप्रयोग में सामना किया जा सकता है कि लगातार समस्याओं के लिए एक मुसीबत शूटिंग गाइड तालिका 2में प्रदान की गई है।
अंत में, यह यहाँ का प्रदर्शन किया है कि ट्यूब इलेक्ट्रोपोरिओशन CRISPR/Cas9 RNP और स्तनधारी कोशिकाओं को ssODNs के वितरण के लिए एक प्रभावी साधन है उच्च PGE दरों को प्राप्त करने के लिए. इस नए TE transfection तकनीक और अपनी मजबूत सटीक जीन संपादन दर जीन संपादन अनुप्रयोगों के विकास की सुविधा हो सकती है.
Disclosures
जे.सी. सेलेट्रिक्स LLC, ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेटर के निर्माता में काम करता है। एल एम, एल जे, जे एस, डी वाई, जे जेड, वाई ई सी, और जे एक्स कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा.
Acknowledgments
यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R21OD023194 से JX के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था. यह काम मिशिगन मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय में अनुवाद विज्ञान और चिकित्सा (CAMTraST) के लिए उन्नत मॉडल के लिए केंद्र द्वारा समर्थित कोर सेवाओं का उपयोग किया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
| Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
| DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
| Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
| Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
| Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
| Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
| mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
| PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
| Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
| Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
| Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
| Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
| Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
| Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
| Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |
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