Summary
内分泌破壊物質(EDC)は、生物および自然環境にとって深刻な問題を表します。ショウジョウバエメラノガスターは、生体内のEDC効果を研究するための理想的なモデルを表します。ここでは、ショウジョウバエにおける内分泌破壊を調査する方法を紹介し、胎児、生殖能力、発達時期、ハエの寿命に対するEDCの影響に対処する。
Abstract
近年、すべての生物と環境が内分泌破壊物質(EDC)として知られているホルモンのような化学物質にさらされているという証拠が増えています。これらの化学物質は、内分泌系の正常なバランスを変更し、副作用につながる可能性があります, だけでなく、人間の集団内のホルモン障害の増加や成長を妨げ、野生生物種の繁殖を減少.一部の EDC では、健康への影響と使用に関する制限が文書化されています。しかし、それらのほとんどのために、この意味ではまだ科学的証拠がありません。完全な生物における化学物質の潜在的な内分泌効果を検証するためには、適切なモデルシステム、ならびにフルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターでテストする必要があります。ここでは、ショウジョウバエにおける内分泌破壊を研究するために生体内プロトコルで詳細に報告し、ハエの胎児/生殖能力、発達時期、寿命に対するEDCの影響に対処する。ここ数年、これらのショウジョウバエの生命特性を用いて、17-α-エチニルエストラジオール(EE2)、ビスフェノールA(BPA)、ビスフェノールAF(BPA F)への曝露の影響を調べた。全体として、これらのアッセイは、すべてのショウジョウバエのライフステージをカバーし、すべてのホルモン媒介プロセスにおける内分泌破壊を評価することを可能にしました。胎児/不妊症および発達タイミングアッセイは、それぞれ、ハエの生殖性能および発達段階におけるEDCの影響を測定するのに有用であった。最後に、寿命アッセイは、成人への慢性EDC暴露を伴い、その生存者を測定した。しかし、これらの生命特性はまた、慎重に制御されなければならなかったいくつかの実験因子の影響を受ける可能性があります。したがって、この作業では、これらのアッセイの正しい結果に合わせて最適化した一連の手順を提案します。これらの方法は、科学者が任意のEDCまたはドロソフィラの異なるEDCの混合物のために内分泌破壊を確立することを可能にするが、効果を担当する内分泌機構を同定するためには、さらなるエッセイが必要になる可能性がある。
Introduction
人間の活動は、生物と自然生態系の深刻な問題を表す大量の化学物質を環境に放出しています1.これらの汚染物質のうち、約1,000種類の化学物質が内分泌系の正常なバランスを変える可能性があると推定されています。この特性によると、それらは内分泌破壊化学物質(EDC)として分類される。具体的には、内分泌学会による最近の定義に基づいて、EDCは「外因性化学物質、または化学物質の混合物であり、ホルモン作用のあらゆる側面を妨害する可能性がある」2.過去30年間にわたり、EDCが動物や植物の生殖と発達に影響を与える可能性があるという科学的証拠が増えてきた3、4、5、6、7、 8.また、EDC曝露は、癌、肥満、糖尿病、甲状腺疾患、および行動障害9、10、11を含む一部のヒト疾患の有病率の増加に関連している。
EDCの一般的なメカニズム
その分子特性のために、EDCはホルモンまたはホルモン前駆体3、4、5、6、7、8、9のように振る舞う10、11、12.この意味で, 彼らはホルモンの受容体に結合し、ホルモン活性を模倣することによって、または内因性ホルモンの結合をブロックすることによって内分泌系を破壊することができます。.最初のケースで, 受容体に結合した後, 彼らは、その自然なホルモンが行うようにそれを活性化することができます。.他のケースでは、受容体へのEDCの結合は、その天然ホルモンの結合を防ぐので、受容体はブロックされ、もはやその天然ホルモン3の存在下でも活性化されなくなる。その結果、EDCは、恒常性、生殖、発達、および/または行動の維持を担う内因性ホルモンの合成、分泌、輸送、代謝、または末梢作用などのいくつかのプロセスに影響を与える可能性があります。生物。受容体結合は、EDCのためにこれまでに説明した唯一の作用方法ではありません。酵素経路でコアクティベーターやコアプレッサを募集したり、遺伝子発現10、11、12、13を調節するエピジェネティックマーカーを改変したりすることで、彼らも行動できることが明らかになりました。 、14は、現在の世代のためだけでなく、8来る世代の健康のためにも影響を与えます。
ショウジョウバエホルモン
選択されたEDCの潜在的な効果は、野生生物種と内分泌機構が合理的によく知られているいくつかのモデルシステムの両方で広く研究されている。無脊椎動物の場合、成長、発達、生殖に影響を与える内分泌系は、生物学的研究の分野での広範な使用、その経済的重要性、およびいくつかの理由から昆虫に広く特徴付けられてきた。最後に、害虫のホルモン系に特異的に干渉することができる殺虫剤の開発。
特に、昆虫の中で、フルーツフライD.メラノガスターは、EDCの潜在的な内分泌効果を評価する非常に強力なモデルシステムであることが証明されています。D. メラノガスターでは、脊椎動物と同様に、ホルモンはライフサイクル全体を通じて重要な役割を果たします。この生物には、ステロイドホルモン20-ヒドロキシエキシダイソン(20E)15、16、セシテルペノイド若年ホルモン(JH)17、および神経ペプチドおよびペプチド/タンパク質を含む3つの主要なホルモン系があります。ホルモン18.この3番目のグループは、より最近発見されたいくつかのペプチドから成りますが、長寿、恒常性、代謝、生殖、記憶、およびロコモータ制御などの生理学的および行動過程の膨大な多様性に明らかに関与しています。20Eは、エストラジオールなどのコレステロール由来のステロイドホルモンと相同であり、JHはレチノイン酸といくつかの類似点を共有している。それらの両方は、ショウジョウバエ19、20のよく知られているホルモンです。そのバランスは、モルティングと変態を調整するだけでなく、再生、寿命、行動21などのいくつかの発達後プロセスを制御する上で重要であり、内分泌をテストするための異なる可能性を提供します。ショウジョウバエの破壊。また、エジステロイドホルモンおよびJHは、いわゆる第三世代殺虫剤の主な標的であり、昆虫における発達および生殖内分泌媒介プロセスを妨害するために開発される。これらの化学物質のアゴニストまたはアンタゴニストモードはよく知られており、したがって、昆虫の成長、生殖、および発達に及ぼす潜在的なEDCの影響を評価するための基準として役立つことができる22。例えば、蚊や他の水生昆虫23、24の制御に広く使用されているメトプレンは、JHアゴニストとして働き、20E誘発遺伝子転写および変態を抑制する。
ホルモンに加えて, ショウジョウバエの核受容体 (NR) スーパーファミリーもよく知られています。;それは、ホルモン依存性発達経路の制御に関与する18の進化的に保存された転写因子、ならびに生殖および生理学25から成っている。これらのホルモンNRは、神経伝達26に関与するもの、レチノイン酸NR用の2つ、および脊椎動物においてEDC27の主要な標的の1つを表すステロイドNR用のサブタイプを含む、6つのNRスーパーファミリーサブタイプすべてに属する。
EDCを研究するためのモデルシステムとしてのショウジョウバエ
現在、分子特性に基づいて、世界中のいくつかの環境機関は、異なる人工化学物質に内分泌系を妨害する可能性に起因しています。EDCが環境と生物にとって世界的かつユビキタスな問題であることを考えると、この分野の研究の全体的な目標は、病気の負担を軽減し、生物をその悪影響から保護することです。化学物質の潜在的な内分泌効果についての理解を深めるためには、生体内でそれをテストする必要があります。この目的のために、D.メラノガスターは有効なモデルシステムを表す。今日まで、フルーツフライは、いくつかの環境EDCの効果を評価するために、生体内モデルとして広く使用されてきました。ジブチルフタル酸エステル(DBP)28、ビスフェノールA(BPA)、4-ノニルフェノール(4-NP)、4-テルオクチルフェノール(4-テルト-OP)29、メチルパラベン(MP)30、エチルパラベン(EP)31などのいくつかのEDCへの暴露が報告されています。32、ビス-(2-エチルヘキシル)フタル酸エステル(DEHP)33、および17−α-エチニルエストラジオール(EE2)34は、脊椎動物モデルのように代謝および内分泌機能に影響を与える。いくつかの理由は、研究のこの分野でモデルとしての使用につながっています.内分泌系に関する優れた知識を超えて、その短いライフサイクル、低コスト、簡単に実行可能なゲノム、研究の長い歴史、およびいくつかの技術的な可能性が含まれます(FlyBaseのウェブサイト、http://flybase.org/参照)。D. メラノガスターはまた、環境要因8に対する世代間の影響と集団応答を容易に研究するための強力なモデルを提供し、高等動物の生体内研究に関連する倫理的な問題を回避する。さらに、フルーツフライは、ヒトと高度な遺伝子保全を共有しており、ショウジョウバエEDCアッセイがヒトの健康に対するこれらの化学物質の潜在的な影響を予測または示唆するのに役立つ可能性があります。ショウジョウバエは、人間の健康への影響に関する理解を深めるだけでなく、生物多様性の喪失や環境の劣化など、環境へのEDC曝露のリスクを評価するのに役立ちます。最後に、フルーツフライは、その開発、生殖、寿命に影響を与える可能性のある要因が、試験される物質に任意のバリエーションを帰属させるために制御下に保つことができる実験室で使用されるという付加的な利点を提供します。
この念頭に置いて、我々は、例えば、性欲/生殖能力、発達のタイミング、成人の寿命など、いくつかのショウジョウバエホルモン特性に対するEDC効果を決定するためのシンプルで堅牢なフィットネスアッセイを最適化しました。これらのアッセイは、一部のEDC23、24、25、26、27に広く使用されています。特に、合成エストロゲンEE234への曝露の影響を評価し、BPAおよびビスフェノールAF(BPA F)(未発表データ)への影響を評価するために、以下のプロトコルを使用した。これらのプロトコルは、一度に所定のEDCの効果、ならびにD.メラノガスターにおける複数のEDCの組み合わせ効果を調べるために容易に変更することができる。
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Protocol
1. 食品の準備
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ストックメンテナンスおよび幼虫増殖のために、3%粉末酵母、10%ショ糖、9%のコーンミール、0.4%寒天、その後コーンミール培地(CM)を含むコーンミール培地を使用する。
- 100mLの水道水に30gの酵母を入れ、沸騰させ、15分間沸騰させます。
- 別に、調理済みコーンミール90g、砂糖100g、寒天4gを900mLの水道水に混ぜます。
- 溶液を沸騰させ、火を弱め、5分間連続的に撹拌する。
- 5分後、熱い酵母溶液を追加し、別の15分間煮ます。
- 熱源をオフにし、溶液を約60°Cに冷却することができます。
- エタノールに10%メチル4-ヒドロキシ安息香酸10%の5mL/Lを加え、十分に混ぜ、10分間座らせます。
注:高濃度の殺菌剤が幼虫に致死する可能性があることを考えると、メチル4-ヒドロキシ安息香酸塩の量に注意してください。 - 媒体をバイアル/ボトルに分配する:各フライバイアルに8 mL(25 mm x 95 mm)、各フライバイアルに3 mL(22 mm x 63 mm)、各フライボトル(250 mL)に60 mLを分配します。
- チーズクロスでバイアルをカバーし、保存前に室温(RT)で24時間乾燥させます。
- 寒天の使用量や冷却/乾燥時間を変更して、CMの一貫性と水分補給を実験的に正しく調整します。
注:プラグを抜き、箱詰めされ、包まれたバイアルは4°Cで約15日間安定しています。
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ショウジョウバエ成人の場合は、10%粉末酵母、10%ショ糖、2%寒天を含有する培地を用い、その後成人培地(AM)と呼ばれる。
- 粉末酵母10g、ショ糖10g、寒天2gを蒸留水100mLに混ぜます。
- この混合物を3分間隔で2回沸騰させるか、または寒天が溶けるまで、電子レンジを使用して。
- 溶液が60°Cに冷却したら、エタノールに10%メチル4-ヒドロキシベンゾ酸塩の5 mL/Lを加え、よく混ぜ、バイアル(バイアル当たり10mL)で分配します。
- チーズクロスでバイアルをカバーし、保存する前にRTで24時間乾燥させます。
注:プラグを抜き、箱詰めされ、包まれたバイアルは4°Cで約15日間安定しています。
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フェクシティ/不妊アッセイには、ショウジョウバエトマトジュース-コーンミール培地を使用します。
- 100 mLビーカーに70 mLの温かいコーンミール食品を注ぎ、30 mLのトマトジュース(30%v/v)を加えます。
- フードプロセッサーとピペ3 mLを小さなバイアルで十分に混ぜます。
- チーズクロスでバイアルをカバーし、保存前に24時間RTで乾燥させます。
注:プラグを抜き、箱詰めされ、包まれたバイアルは4°Cで約15日間安定しています。
- 胚の採取には、寒天3%、トマトソース3%、砂糖3%を含む寒天プレートを使用します。
注:プレートに媒体を注ぐときに気泡を作らないように注意してください。
2. ショウジョウバエ EDC ドージング
- 選択したEDCを適切な溶媒に溶解する適切なストック溶液を調剤する。EE2(分子量296.403)の場合は、100%エタノールの10mLで1.48gを溶解し、0.5Mのストック溶液を作り、-80°Cで保存します。
注意:EDCは環境汚染物質とみなされ、取り扱いには注意が必要です。 - 100 mM溶液を得るために、10%エタノール(v/v)でEE2ストック溶液を希釈します。CM食品の次の希釈(0.1mM、0.5mMおよび1mM)を、最も低い濃度から始め、各治療群に同じ最終濃度の溶媒を使用して作ります。コントロールバイアルは、溶媒単独で同じ体積を使用する。
注:エタノールの最終濃度がフライフードで2%を超えてはならないことを念頭に置いて、溶媒の最終濃度を可能な限り低くしておくことをお勧めします。 - 固化前にコーンミールベースの食品に選択したEDCの右希釈を含む溶液を追加し、フードプロセッサーと完全に混合し、バイアルに10mLを分配し、綿ガーゼで覆い、使用する前にRTで16時間乾燥させます。
注:準備直後にこのメディアを使用してください。 -
成人飼育の場合、EE2(0.1mM)の所望濃度を得るために、水中10%エタノール(v/v)と層100μLの異なる働くEE2溶液(それぞれ10mM、50mM、100mMM)をAMの表面に準備します。、0.5 mM および 1 mM)。制御のために単独で溶媒の同じ容積を使用する。
注:または、選択したEDCの右希釈を含む溶液を50 mL円錐管に少量のAMに加え、渦を徹底的に加え、AMバイアルの表面に1mLを層状にする。- 綿ガーゼでバイアルをカバーし、穏やかな攪拌の下で12-16時間RTで乾燥を可能にし、すぐにそれらを使用します。
注:乾燥プロセスは、周囲の湿度に依存しているので、実験的に調整する必要があります。
- 綿ガーゼでバイアルをカバーし、穏やかな攪拌の下で12-16時間RTで乾燥を可能にし、すぐにそれらを使用します。
- 給餌アッセイの場合、選択したEDC(EE2 0.1 mM、0.5mMおよび1mM)の右希釈を含む溶液と着色食品(例えば、赤色染料第40号(1mg/mL)35を固化前にCMに加え、フードプロセッサーと強く混合し、分配するバイアルにe。
3. ハエの飼育
- 実験室で複数の世代によって維持されるオレゴンRのような強い同性ひずみを使用する。
- 自然な12時間の光で加湿された、温度制御されたインキュベーターでハエを保つ:CM食品を含むバイアルで25°Cで12時間暗い光周期。
- 各アッセイでは、RTでバイアルを使用します。
4. 給餌アッセイ
注:このアッセイは、媒体中に選択されたEDCの存在がハエの摂食に影響を与える可能性があるかどうかをテストすることをお勧めします。
- 選択したEDCと着色食品の異なる濃度を補うCMを含むバイアルに15の若いハエを入れてください。ハエが1日間メディアに餌を与えることを許可します。
注:例えば、赤色染料第40号35号(1mg/mL)を使用してください。 - 15の若いハエを、溶媒単独で補充したCMを含むバイアルに入れ、コントロールのための着色食品を入れてください。ハエが1日間メディアに餌を与えることを許可します。
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ハエの各グループをエーテルで個別に麻酔する。
- 各群のハエを円筒形のガラス容器(エーテライザー)に移し、漏斗の上にバイアルを反転させ、2つの容器を軽く叩いてハエをエーゼ器に落とします。
注: 漏斗は、彼らがエーテサイザーから抜け出すのを防ぎます。 - マウスパッドなどの柔らかい表面のエーザライザーを軽く叩いてノックダウンし、漏斗をエーテル浸した綿とガーゼプラグに素早く交換します。
- ハエが底に落ちて動くのを止めるまで、約1分待ちます。
注:時間を超えないか、ハエが死んでしまいます。
- 各群のハエを円筒形のガラス容器(エーテライザー)に移し、漏斗の上にバイアルを反転させ、2つの容器を軽く叩いてハエをエーゼ器に落とします。
- 固定化されたハエをステレオ顕微鏡の下に置き、対照群に対して各治療群の腹部着色を比較する。
5. 生殖能力/不妊アッセイ
- EDC濃度ごとに、ハエの3バイアルを準備し、その後、10 mL CM/EDC食品に8人の女性と4人の男性と、その後、親のバイアルと呼ばれています。コントロールのために溶媒を補充した10 mL CM食品で8雌と4オスとハエの6バイアルを準備します。後部は25°Cのインキュベーターで飛ぶ。
注:発達中に幼虫の過密化を避け、治療全体で一貫した幼虫密度を使用してみてください。 - 4日後、両親を取り出し、さらに5日間インキュベーターにバイアルを戻します。
- 9日目の午後遅くに、バイアルから新たに飛ぶすべてのハエを取り除き、一晩18°Cのインキュベーターにバイアルを入れます。
注:この除去は、媒体の表面をよくチェックし、非常に慎重に行う必要があります。- 10日目の朝、各治療群について、軽いCO2麻酔下で、処女雌と若い雄を2つのグループに集める。新鮮な対応するCMで満たされた独立したバイアルで、小さなサブグループ(10人の女性と20人の男性)にハエの各グループをランダムに細分化します。
- ステップ5.3.1を繰り返し、収集前にバイアル8-10hからすべてのハエを慎重に取り除き、18°Cでバイアルを残し、各EDC濃度に対して少なくとも30人の処女女性と30人の男性と、コントロールのために少なくとも90人の処女女性と90人の男性を得るまで、両方の注意を払います。
- これらのハエの群を25°Cで飼育し、4日後に老化するまで、新鮮な対応する媒体を2日ごとに含む新しいバイアルに移します。
注:4日はハエが成熟した大人になるのに十分な時間ですが、老化の始まりからは非常に遠いです。 - 2日後、雌のバイアルに幼虫がないことを確認します。もしそうなら、ハエは処女ではなく、廃棄しなければならないので、使用できません。
- 10日目の朝、各治療群について、軽いCO2麻酔下で、処女雌と若い雄を2つのグループに集める。新鮮な対応するCMで満たされた独立したバイアルで、小さなサブグループ(10人の女性と20人の男性)にハエの各グループをランダムに細分化します。
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以下に説明するように、各治療群に対して各性別の20個の単一のハエを使用して、EDCを含まない新鮮なCM-トマト培地を含む小さなバイアルに20個の単一の十字架を設定します。
- 各治療グループに異なる連続番号を割り当て、それを一意に識別し、それぞれのバイアルにラベルを付けます。例えば、グループ1(溶媒単独)は1から20、グループ2(EDC濃度x)は20から40などである。
- 異なる系列を記録する不妊スプレッドシートを作成し、それぞれが治療グループに対応します。
- 各性別について、光CO2の下で各治療群に属するすべてのハエを麻酔し、次のようにランダムに移動させる。
- EDCを含まない新鮮なCMトマト培地を含む小さなバイアルに1つの溶媒処理された女性を移し、コントロールクロスに溶媒処理されたオスを1つ加えます。
注:暗い媒体は白い胚とのコントラストを増加させるので、トマトジュースは、その調製中に培地に添加する必要があります。 - EDCを含まない新鮮なCMトマトを含む小さなバイアルに1つのEDC処理された女性を移し、各治療に1つの溶媒処理された男性を加える。
- EDCを含まない新鮮なCMトマト培地を含む小さなバイアルに1つのEDC処理された男性を移し、各治療に1つの溶媒処理された女性を加える。
- EDCを含まない新鮮なCMトマト培地を含む小さなバイアルに1つの溶媒処理された女性を移し、コントロールクロスに溶媒処理されたオスを1つ加えます。
- これらすべての単一の十字架を25°Cで収容してください。
- その後の10日間、EDCなしで毎日新鮮なCMトマトバイアルに各嵌合ペアを転送します。各系列の複製されたバイアルに順番にラベルを付けます。例えば1-a,1b,1c...20a、20b、20cと不妊スプレッドシートにこれらの数字を報告します。
- 視覚的に卵のために毎日各バイアルを検査し、不妊スプレッドシートに自分の番号を報告します。
- 各バイアルを保存し、新たにハエが出現し始めると、また、10日間の期間にわたって成人の子孫の毎日の数を記録します。最初の交配から10日後に、親を削除します。
注:一方または両方の両親が死亡したバイアルを廃棄します。一方または両方の親の脱出の場合は、それらが失われる日まで、すべてのデータを分析に含めます。 - 各処理群の1日の卵数と成人子孫の1日数を合計し、総生殖能力/生殖能力、10日間のハエによる平均卵及び成人子孫産生、及び産卵の総数に対する総子孫の比率を得る。コントロールに対する各治療値のパーセンテージの差を計算します。
- 各治療群に最低10匹のハエを使用して、ハエの各グループに対して3つの独立した実験を行います。
- 統計分析を実行して、さまざまなグループを比較します。
6. 発達のタイミング
注:次の2つの代替プロトコルでは、発達のタイミングは、1日あたりに形成される子犬の数と1日あたりの成人子孫の数の両方をカウントすることによって評価される。
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エクロシオンアッセイプロトコル1
- 各治療群のために、若い(<2日)の10バイアルを設定し、健康なハエ、それぞれEDCなしで10 mLコーンミール食品に6人の女性と3人の男性を持つ。
- 24時間食べ物を飛ばして、交尾させましょう。
- 異なるEDC濃度または溶媒単独で補う新鮮なコーンミール食品のそれぞれ10 mLを用いた治療群当たり10並列バイアルを調べる。これらの新しいバイアルに合致ハエを転送します。
注:各治療グループに対して、異なる連続番号を割り当て、それを一意に識別し、それぞれのバイアルにラベルを付けます。 - 異なる系列を記録する開発スプレッドシートを作成します。
- ハエが16時間卵を産むことを許可します。その後、バイアルから親を削除します。
注:親ハエは、他の対応するバイアルに転送することにより、ステップ6.1.5を繰り返すために使用することができます。 - バイアルを25°Cで3~4日間インキュベートするか、それ以上の子犬の形がなくなるまでインキュベートする。毎日、各バイアルに新しい子犬の数をカウントし、発達スプレッドシート上でそれを報告します。同じ子犬を2回数えないようにするには、バイアルの外側に永久マーカーを付けて、各子犬に順番に数字を書きます。
- 9日目からは、成人が出なくなるまで毎日新成人の数を数え、発達スプレッドシートに報告します。
- これらの生データから、幼虫の平均期間、平均プパル期間、ならびに対照に対する各治療のパーセンテージの差を計算する。
- 各治療群に最低5本のバイアルを用いて、ハエのグループごとに3つの独立した実験を行う。
- 統計分析を実行して、さまざまなグループを比較します。
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エクロシオンアッセイプロトコル2
- 若くて健康な女性(約150人)とオス(約50人)は、新鮮なパン屋の酵母ペースト(5mLのパン酵母の3g)を補いた寒天トマト培地(材料のテーブル)の上を飛び、その後2日間、敷きトレイと呼ばれる。25 °Cで。
- この2日間、ハエは卵の採取を開始する前に、暗くて静かな場所でケージに順応し、1日2回敷設トレイを変更することができます。
- 3日目は、早朝に敷き分トレイを交換します。1時間後、これらの産卵卵を廃棄し、敷設トレイを交換します。
- ハエが卵を2時間産み、新鮮な敷設トレイに置き換えることができます。
注:3日目までに、良い敷設トレイは2時間で100〜200個の卵を生産する必要があります。 - 各治療群について、対応するEDC濃度または溶媒単独で補充されたトマトコーンミール食品を含む3つの60mm皿を一連用意し、各シリーズを発達タイミングスプレッドシートで報告する。または、好ましい場合は、料理の代わりにバイアルを使用してください。
- ペンキブラシやプローブを使って顕微鏡で卵をそっと拾い、各皿/バイアルの媒体の上部に移します。カウントを容易にするために、敷設トレイに、それぞれ10の5つのグループに卵を配置し、一度に1つずつ転送します。
注:十分な胚を得るために必要な回数のステップ6.2.4を繰り返します。 - これらすべての料理/バイアルを25°Cで収容してください。また、各敷設トレイを25°Cで保存し、産卵の総数をカウントします。
- 24-30 hの後、立体顕微鏡の下で各皿/バイアルをチェックし、白い、未受精卵の数と暗い死んだ胚の数の両方を数えます。
- 食器/バイアルあたりの「総胚」値を得るために、50個の転移した卵の値から白い未受精卵の数を減算します。暗い死んだ胚の数は、胚発生時の潜在的なEDC毒性効果を決定するために使用することができる。
- エクロシオンアッセイプロトコル1の手順6.1.6-6.1.10を繰り返します。
7. 寿命プロトコル
- 20の雌と4人の男性とCM(それぞれ10 mL)で25 °Cでハエのバイアルを設定します。
- 4日後にハエを捨て、バイアルをインキュベーターに戻します。
注:これらのハエは、ハエの他の年齢同期コホートを得るために再び開始するために使用することができます。 - 9日目の午後遅くに、バイアルから新たに飛ぶすべてのハエを取り除き、バイアラーをインキュベーターに戻します。
注:少数の大人は、9日目の早い時期に閉じ始めるべきです。これらのハエを廃棄すると、同期ハエの最大数を収集することができ、早期出現の不注意な選択を回避します。 - 16-24時間後、男女の成虫ハエ(1日齢)を、3つの異なるEDC濃度と溶媒単独で補充したAM食品を含む250mLボトルの4群に移す。必要に応じて、翌日に別のバッチを収集します。
- ハエを2~3日間2~3日間維持し、合致できるようにします。
注:AM食品バイアルへの移送日は成人期の最初の日に相当します。 - 2〜3日後、ハエの各コホートを軽いCO2麻酔下の2つのグループにセックスでソートします。各性別を、各治療ごとに性別ごとに5つの平行バイアルの3回の複製があるまで、1回の治療につき20個の密度で5つのバイアルにランダムに細分化します。
注:CO2への長時間の暴露時間による長期的な健康問題を防ぐために、ハエの小さなグループと協力してください。 - 死んだハエの数を、生き残ったハエの数から前回の転送まで差し引く寿命スプレッドシートを準備し、各転送で生存者の数を自動的に取得します。
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3日おきに対応する食品を含む新しいバイアルにハエを移し、死亡を確認します。
注:転送は、フライの長寿に長期的な悪影響を及ぼす可能性のある麻酔なしで行われなければなりません。- 各転送で、ハエの年齢と死んだハエの数を記録します。
注:生き残ったハエの数はスプレッドシートで自動的に計算されますが、視覚的に確認することをお勧めします。転送中に誤って脱出または死亡するハエは考慮されるべきではありません。スプレッドシートでこのメモを報告する新しいバイアルに運ばれた2回の死んだハエを数えないように注意してください。 - すべてのハエが死ぬまで、手順7.8と7.8.1を繰り返します。
- 各転送で、ハエの年齢と死んだハエの数を記録します。
- 各治療群について、図6に示すように生存曲線を作成し、特定の時点におけるハエの生存確率を表示する。
- 各実験に100匹の新たに閉じ込められたハエを使用して、ハエの各治療群に対して3つの独立した実験を行う。
- 平均寿命(各群のハエの平均生存日数)、半分の死亡時間(死亡率50%に達するために必要な日数の期間)、および最大寿命(90%の死亡率に達するために必要な最大日数)を報告するテーブルを準備します。
- 対照群に対する各治療群間のパーセンテージの差を計算する。
- 統計分析を実行して、異なる治療グループを比較します。
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Representative Results
このセクションでは、上記のプロトコルの主要な手順を簡略化されたスキームの形式で報告します。ハエは不快な化合物を避ける傾向があることを考えると、最初に行うことは、選択されたEDCの味をアッセイすることです。これは、食品着色料(例えば、赤色食品染料第40号)35を様々な用量で、または溶媒単独で選択されたEDCを補充した食品と混合することによって行うことができる。これらの培養物に餌を与えられたハエは立体顕微鏡下で調べられ、食物摂取量は腹部着色によって推定される(図1)。典型的な望ましい状況は、2人の成人女性を持つ図1に示されています:選択されたEDCを含む培地に1匹、EDCを含まない培地上に1匹、腹部に同じ着色を示す。
EDCは、天然ホルモンのような、非常に低用量で効果があり、用量と効果29の間に単純な線形関係がないことは広く受け入れられており、高用量は必ずしも大きな効果を有するとは限らない36、 37.したがって、用量応答アプローチではなく、その影響を完全に評価するために、環境または他の生物に関連する濃度から始めて、より多くの用量を使用することをお勧めします。いずれにせよ、各治療群で同等の量のEDCをハエが消化することを確認するために、使用される各濃度でEDC味をアッセイすることが重要です(図2)。
内分泌破壊は、不妊、長寿、発達などの動物生理学の多くの重要な特徴に影響を与え、したがって、EDCをテストするのに有用なエンドポイントである。これらのショウジョウバエの生命特性に対するEDC効果を測定するために最適化された上記のプロトコルについては、主な考慮事項は、テスト前に正しく操作されるべき若くて健康なハエを使用することが不可欠であることです。このことを念頭に置いて、使用済み食品の生産、取り扱い、保管に大きな注意を払う必要があります。また、適切な最終濃度で選択されたEDCに対して最適な溶媒を使用する場合には注意が必要です(すなわち、ジメチルスルホキシド[DMSO]の場合は1%未満、エタノールでは2%未満)30。
生殖能力と不妊症は、D.メラノガスターの生殖の成功を評価するために使用されています。図 3は、使用されるプロトコルのスキームを示しています。生殖能力は、産卵の総数として実験的に測定され、出生率は総成人の子孫として測定される。成人生活の最初の10日間の卵生産は、生物38、39の全成人生活の卵/子孫生産のための良好な基準であるという考察に基づいて、不妊および不妊アッセイは10日間行うことができる露出した幼虫から孵化した4日前のハエを使用して。各グループの並列バイアルで同様の値を取得しようとすることが重要です。それ以外の場合は、分析から取り外すチューブを想像することは困難です。したがって、乾燥食品や液化食品などのストレスの多い環境を避けるために、毎日各複製バイアルを調べることをお勧めします。20の単一の十字架から始まり、両方の両親が10日間生きていた良好な状態で少なくとも10バイアルを得ることをお勧めします。毎日収集された卵と成人の子孫の数は、図3に示すように表に報告され、ハエの平均卵と成人子孫の生産を10日間計算するために使用されなければなりません。そして、コントロールハエと比較したEDC処理ハエの生殖能力/生殖能力変化率は、次の式を適用して得ることができる:fecundity/不妊変化% = [(対照-治療)/対照]x 100。グループごとに少なくとも 3 つの独立した反復を取得する必要があります。
ホルモンは、D. メラノガスター40の生活の発達転移に重要な役割を果たします, 成長のこれらの段階は、EDC の副作用に特に脆弱である可能性が高い.25°Cでは、幼虫の成長と子犬期の両方がそれぞれ約4日間に及ぶ。EDC暴露後、これらの段階の平均持続時間は41に影響を受ける可能性がある。この考慮に基づいて、発達タイミングプロトコルは、未処理のハエに関してEDC暴露後に幼虫から子犬への移行のパーセンテージと時間を決定するために最適化されました。2つの代替プロトコルは、このアッセイを実行することができます。いずれも有効であり、4日間にわたる幼虫へのEDC慢性暴露に基づいている。この幼虫治療に基づいて、最初のプロトコルは、16-18時間(一晩)にわたって収集された胚の年齢を考慮に入れなかった。しかし、幼虫間の結果的な年齢変動は、各治療のすべてのバイアルに存在するべきであり、したがって、治療内の分散を増加させるが、治療を通じて発達的タイミングの推定に大きな影響を与えることなく。その代わりに、第2のプロトコルは、一定数の同期初期胚を用い、胚発生時に選択されたEDCの潜在的な効果も評価することを可能にする42,43。さらに、幼虫間の年齢差を最小限に抑えるため、治療内の差異が減少し、治療間の真の差異を推定する能力が向上した。図4は、エクロジョンアッセイのスキームを報告する。どちらのプロトコルでも、プレート/バイアルは毎日チェックする必要があり、EDCにさらされたものから、そしてEDCに露出していないものから、子犬と成人の両方の数は、図4のようにテーブル上で別々に報告される予定でした。すべての形成された子犬と大人のハエは、死んでいるか生きているかにかかわらず数えなければなりませんでした。次に、これらの生データを用いて、幼虫から子犬への移行のパーセンテージと時間、および子犬から成虫への移行の割合と時間を計算し、コントロールハエと比較してEDC処理ハエのこれらの値の変化率を計算した。EDC暴露に続いて、制御ハエに関する全体的な発達の進歩または遅延が予想された。選択したプロトコルは、ハエの各グループに対して三分の一で実行する必要がありました。eclosionアッセイプロトコル2の場合、EDC濃度全体の胚ステージングの信頼性と正確性を維持するために、所定のEDC濃度に対する反復の各シリーズを同じ敷設トレイルから胚に播種することをお勧めします。
最後に、図 5は、寿命を測定するための主要な手順を示しています。このプロトコルでは、分析対象のすべてのハエが年齢と性別によって同期し、結合され、自由な循環を可能にするのに十分低い密度に保たれすることが不可欠でした。男女44の間に有意な差があることはよく知られているので、男女ともに寿命の実験を別々に行うことが重要である。
健康な人口を維持するためには3日ごとに食べ物を交換し、死亡率も3日ごとに評価されなければならなかった。ライフスパンスプレッドシートでは、図5のように、死んだハエの数が報告され、その数は前回の転送から生き残ったハエの数から自動的に差し引かされます。EDC濃度ごとに、および溶媒単独について、累積生残存日と経過日数をプロットして寿命曲線を得た。典型的なサバイバーシップ曲線は図 6で報告されています。サバイバーシップ曲線が比較的高いままであった長い初期期間の後、それは約60日後に指数関数的に減少しました。EDC暴露後、処理されたハエのサバイバーシップ曲線が大きな影響を受ける可能性があります。この効果が選択されたEDCによるものであるかどうかを判断するために、少なくとも2つ、またはより良い、3つの独立した、非同時期の反復実験を行うことがお勧めでした。
上記の各プロトコルでは、異常なバイアル(例えば、卵や異常死なし)を持つことが可能でした。これらのバイアルは、食品の品質の悪さや感染など、さまざまな原因によって発生する可能性があり、対策の値を大幅に変更する可能性があります。これらの異常な状況を管理する最良の方法は、良い実験的な練習を通じてそれらを避けることでした。したがって、上記のすべてのプロトコルのために、バイアルを複製し、ハエを健康に保ち、一度EDCにさらされたハエを扱う際に、大きくて注意深い作業が必要であり、したがって、死亡のリスクが高まる可能性があることを強調する必要があります。操作。
図1:給餌アッセイ。成虫は、選択したEDC(上)または溶媒単独(下)を補充したCM/色素を含むバイアルに24時間放置する。EDC(上)または溶媒単独(下)を補充した媒体で供給された2匹のハエは、腹部に同様の着色を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:EDCのドージング。食事によるショウジョウバエに対するEDC投与の概略図。同位種分株からの成有ハエは、EDC(上)または溶媒単独(下)の異なる濃度に曝露される。N= EDCの基準濃度。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:不妊アッセイ。プロトコルの概略図は、適切なメディアでのフライ成長から処女コレクション、および単一の十字架までのステップを描写する。ステップ1:同位種菌株から成人(10バイアルと4人の男性)は、CM/EDC(上)またはCM/溶媒単独(下)を持つバイアルに移される。(単純にするために、スキームは 3 つのバイアルのうちの 1 つだけを指す点に注意してください。ステップ2:4日後、成虫は廃棄され、産卵卵は成人期まで9日間発症する。ステップ3:新たに閉鎖された成人は性別で分類され、バイアル(最大20人の男性/バイアルと10人の処女女性/バイアル)で収集されます。ステップ4:成人は、幼虫の成長の対応する培地上で4日間の年齢に残される。ステップ5:EDCなしでCMトマト培地でEDC処理ハエのための40のシングルクロスのセットアップ、1コントロールメスと20x 1つのEDC処理された男性(上)を持つEDC処理された男性。コントロールハエのための20の単一の十字架のセットアップ、1つのコントロールメス(下)を持つ20x 1コントロールオス。黄色媒体は、対照(下)としてEDC(上)または溶媒を補うCMであり、赤色媒体はEDCまたは溶媒を含まないトマト/CMである。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:発達タイミング(エクロシオンアッセイプロトコル2)。左の図は、成人(約150人の女性と50人の男性)が沈着ステップの前に暗闇の中で順応し、交尾するコレクションケージのスキームを示しています(プロトコルを参照)。2日後、古いスライドトレイは生鮮食品と交換され、次の1hで処分された卵は非同期であるため廃棄されます。以下、卵は新しいスライドトレイに2時間ごとに集められ、数えられ、EDCまたは溶媒だけで補充されたトマト/CMを含む皿に置かれる。データ(産卵総数、未公開卵、子犬、閉じ込められた成人)は、一連の発達タイミングスプレッドシート(右)で報告される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:寿命アッセイ。1日同期ハエは、EDC(上)または溶媒(下)をコントロールとして補充した成人食(AM)を含む250mLボトルに移され、給餌(スキームに残)を可能にする。2-3日後、ハエは性別でソートされ、20個/バイアルのグループで、各性別の5つのバイアル(開始ボトルの対応する媒体を含む)に移されます。3日ごとに、大人はもはや必要となくなるまで新鮮なバイアルに移されます(スキームの中央部)。右側には、データが各日に記録されるテーブルのスキームがあります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 寿命曲線。左側には、処置群(培地+EDC[0.05 mM EE2])と対照群(培地+溶媒)の両方について、実験期間全体を通じて、死んだハエの数が3日ごとに記録された代表的な表が報告されている。各グループの平均寿命は、MATRIX SUM を使用して計算されています。製品;処理されたグループは、対照群と比較して平均寿命を短くした。右側には、典型的な生存曲線が、EE2(0.05 mM)またはコントロール用のエタノールのみを含む培地で供給されるオスのハエを示す。サバイバーシップカーブは、コントロールグループよりも処理されたハエに対してより急速に減少し、早期の旋点降下点を伴う。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
フルーツフライD.メラノガスターは、DBP28、BPA、4-NP、4-tert-OP29、MP30、EP31などの環境EDCの潜在的な影響を調査するインビボモデルシステムとして広く採用されています。32、DEHP33、および EE234.いくつかの理由は、研究のこの分野のモデルとしての使用をリードしています。モデルシステムとしての議論の余地のない利点とは別に、ショウジョウバエはヒトと高度な遺伝子保全を共有しており、ショウジョウバエEDCアッセイは人間の健康に対する潜在的な影響を予測または示唆するのに役立つ可能性があります。さらに、ショウジョウバエは、すべての生態系で広く表され、EDCの有害な影響に対するより大きな保護措置を必要とする無脊椎動物に属しています。無脊椎動物は、食物連鎖の基部に位置し、彼らが住んでいる環境のために非常に重要な機能を果たしています。環境に放出されたいくつかのEDCは、いくつかの動物種の発達と繁殖に有害な影響を及ぼす可能性があることが報告されている。ショウジョウバエは、開発、生殖、寿命に影響を与える可能性のある要因が、試験対象物質に対する変動を帰属させるために制御下に置くことができる実験室で使用されるという付加的な利点を提供します。
ここでは、このモデルシステムにおけるEDC暴露が、胎児/生殖能力、発達速度、寿命などのホルモン調節寿命に及ぼす影響を調べた詳細なプロトコルを提供する。これらのプロトコルを最適化し、EE2 34、BPA、BPAF(未発表データ)暴露の影響を調査することを可能にしましたが、他のEDCの影響を研究するために容易に適応することができます。特に、これらのアッセイは、純粋なEDCと異なるEDCの組み合わせの両方を調査するために使用することができ、自然界で起こることをより密接に再現します。明らかに、それらは単純な成長アッセイのように見えるかもしれませんが、適切なガイドラインに従って作業することが重要であり、精度と再現性を確保する45.D.メラノガスターの不妊症、発達時期、長寿は、外的および内部的要因の影響を受ける可能性があることはよく知られています。光周期、温度、湿度、栄養、集団密度、遺伝構造、年齢などのこれらの重要な要因は、報告されたプロトコルの結果を慎重に制御する必要があります。遺伝的変動の成分を最小限に抑えるために、同種株を使用する必要があります。この株は、25°Cで自然な12時間光:12h暗い光周期で、加湿された、温度制御されたインキュベーターで慎重に飼育する必要があります。
制御された環境の維持に加えて、幼虫および飛行過密は避けなければならない。幼虫の過密状態は発達のタイミングに影響を与え、ヒートショックや免疫関連遺伝子を含むいくつかの遺伝子の発現を誘発し、成人ハエの総適合性に影響を与える46を引き起こすことが報告されている。また、大人のハエは、大人のストレスを最小限に抑えるために自由な動きを可能にするために十分に低い密度で維持する必要があります。また、ハエは不快な食べ物を避ける傾向があるため、異なる濃度で化合物の味を考慮して、各処理群で同等の量のEDCを消費することが重要です。これらのプロトコルのもう一つの重要な側面は、食品の品質です。食品はまた、気泡、細菌の亀裂などを欠いて、良く見える必要があります47,48.また、ハエの実験には同期、交配状況、性別同棲を念頭に置く必要があります。報告されたすべてのプロトコルでは、分析下の並列バイアルが非常に類似している必要があります。それ以外の場合は、最大の注意と良い実験実践が必要とられるように、どちらを破棄するのかを理解することは困難です。最後に、これらのプロトコルを使用して選択されたEDCの内分泌効果を評価することにより、メチル4−ヒドロキシベンゾエートまたはプラスチックバイアルのBPAなどの媒体に存在する他のEDCとの相互作用を考慮することが重要である。この意味で、抗真菌剤を変更したり、ガラスバイアルを使用したり、可能な汚染物質の有無にかかわらずパイロットアッセイを行ったりすると便利です。
報告されたショウジョウバエアッセイは、生殖、発達、寿命などのホルモン調節寿命に及ぼす潜在的な影響を評価することにより、EDCなどの化学物質または化学物質の混合物の評価に非常に有効です。しかしながら、これらのアッセイは、EDCの有害作用を引き起こす内分泌機構を明確に同定するのに役立ちません。この制限を克服するために、昆虫内分泌系上の特定の作用様式を代表する応答を呼び出す参照EDCを使用して同じプロトコルを実行することができる(例えば、JHまたはecdysteroidとして働く第三世代の殺虫剤)アゴニスト/アンタゴニスト)22.あるいは、分子エンドポイントを用いて、ホルモン調節され、内分泌破壊34に対する予測および特異的バイオマーカーと考えられる特定の遺伝子に関する分子解析を行うこともできる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者は、技術サポートのためのオルソリナペティロに感謝します。著者らは、書誌のサポートのためにマリアロサリア・アレッタ博士(CNR)に感謝しています。著者らは、EDCの世界にそれらを紹介してくれたグスタボ・ダミアーノ・ミタ博士に感謝しています。著者らはライカ・マイクロシステムズとパスクアレ・ロマーノの支援に感謝している。この研究は、プロジェクトPON03PE_00110_1によってサポートされました。「スヴィルッポ・ディ・ナノテクノロジー・オリエンテート・アッラ・リジェネラツィオーネ・エ・リコストルツィオーネ・ティスタレ、オドントニアトリア/オキュリスティカのインプラントロジアeセンシスティカ」アクロニモ「SORRISO」;コミットメント: PO FESR 2014-2020 カンパニア;プロジェクトPO FESRカンパニア2007-2013 「IL RILASCIOコントロールラートディモレコールバイオ熱性ナノテクノロジロジーあたりナノテクノロジー」。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α-Ethinylestradiol | Sigma | E4876-1G | |
| Agar for Drosophila medium | BIOSIGMA | 789148 | |
| Bisphenol A | Sigma | 239658-50G | |
| Bisphenol AF | Sigma | 90477-100MG | |
| Cornmeal | CA' BIANCA | ||
| Diethyl ether | Sigma | ||
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789008 | 25 mm x 95 mm |
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789009 | 29 mm x 95 mm |
| Drosophila Vials | Kaltek | 187 | 22 mm x 63 mm |
| Embryo collection cage | Crafts | Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying | |
| Ethanol | FLUKA | 2860 | |
| Etherizer | Crafts | cylindrical glass container with a cotton plug | |
| Glass Bottle | 250 mL Bottles | ||
| Glass Vials | Microtech | ST 10024 | Flat bottom tube 100 x 24 |
| Hand blender Pimmy | Ariete | food processor | |
| Instant Success yeast | ESKA | Powdered yeast | |
| Laying tray | Crafts | plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying | |
| Methyl4-hydroxybenzoate | SIGMA | H5501 | |
| Petri Dish | Falcon | 351016 | 60x5 |
| Red dye no. 40 | SIGMA | 16035 | |
| Stereomicroscope with LED lights | Leica | S4E | |
| Sucrose | HIMEDIA | MB025 | |
| Tomato sauce | Cirio |
References
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