Summary
详细介绍了基于 14 NH 4+ / 15NH444+分析确定潜在 DNRA 速率的一系列方法。NH4+通过几个步骤转换为 N2O，并使用四极气相色谱法（质谱法）进行分析。
Abstract
由于全球氮负荷在工业化后急剧增加，了解硝酸盐（NO3+）的命运的重要性不断增加，硝酸盐是从陆地向水生生态系统转移的主要N种。异硝酸盐减少至铵（DNRA）和脱硝是使用NO 3的微生物过程，用于呼吸。与否认相比，对DNRA活动的定量测定只进行了有限的程度。这导致对 DNRA 在 NO3中的重要性认识不足 –转换和此过程的调节因素。本文的目的是提供一个详细的程序，用于测量环境样品中潜在的DNRA速率。简言之，潜在的DNRA率可以从15N标铵（15NH154+）+的积累率（15NO3=添加孵化）中计算。本文所述的14NH4+和15NH4°浓度的确定由以下步骤组成。首先，提取样品中的NH4+，+并捕获在酸化玻璃过滤器作为铵盐。其次，通过硫酸盐氧化，将被困的铵洗洗并氧化为NO 3。第三，NO3=通过 N2O 还原酶缺乏除尼器转换为 N2O。最后，使用先前开发的四极气相色谱法-质谱系统对转换后的N2O进行了分析。我们将这种方法应用于盐沼沉积物，并计算了其潜在的DNRA速率，表明与前面描述的方法相比，建议的程序允许简单、更快速地确定。
Introduction
氮肥的人工合成及其广泛应用极大地干扰了全球氮循环。据估计，自工业化前1次以来，活性氮从陆地系统向沿海系统的转移增加了一倍。应用于给定田地的肥料的很大一部分被从土壤中冲走到河流或地下水中，主要为 NO3+ 2。这可能会导致环境问题，如饮用水污染，富营养化，和缺氧的形成。NO3=在水环境中，通过生物同化和各种微生物异化过程，从生态系统中去除或保留。脱硝和麻醉剂是NO3+的主要微生物去除过程。硝化是微生物还原NO3=气态N产物（NO、N2O和2N2）加上电子供体（如有机物质）的氧化，从而降低了上述问题的风险。Anammox 还从 NO 2 + 和NH4+ 生成 N2 ;−因此，它将无机N从生态系统中删除。相反，DNRA 致力于在生态系统中保留 N;人们普遍认为，DNRA主要由发酵细菌或化学营养细菌进行，它们可减少异化NO 3-生物利用和移动性较少的NH4++。
关于DNRA的研究主要在海洋或河口生态系统中进行，如海洋或河口沉积物和水、盐或咸沼泽土壤以及红树林土壤。,沿海或海洋生态系统作为从陆地生态系统中去除NO,− 3+−的蓄水池非常重要，在以前的研究中，DNRA已证明在NO 3 + 清除 （0-99%）,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18,46,7,8,9,10,11,12,15,16,17的范围内13,14做出了贡献18。35此外，DNRA的存在已证明在广泛的环境，包括淡水环境19，稻田土壤20，森林土壤21。虽然这些研究表明，DNRA与NO 3+去除的脱硝具有潜在可比性，但与测量脱硝量相比，测量DNRA活性的研究仍然非常有限。
DNRA 速率通过分析或数值模型与数据分析相结合，使用15种 N 标标技术进行评估。一个用于计算 DNRA 速率的分析解决方案是基于在添加 15NO3=作为示踪剂后 NH4+池的 15N 浓缩量的增加。15N标记的NO3=被添加到样品中孵育，然后可以从NH 4+的浓度和同位素比变化中计算出在一定时期之前和之后。本文详细介绍了计算DNRA速率所需的NH4++浓度和同位素比的量化方法。基本上，这里报告的方法是结合了几个以前报告的技术22，23，24，25，26，修改添加到一些程序。22,23,24,25,26该方法由一系列五个组分程序组成：（1） 利用稳定同位素示踪剂的修正孵育环境−样品，15NO3+，（2） 使用"扩散程序"提取和恢复 NH4+，并修改，（3） 在样品中对 NH4+进行吸气氧化， 由土著 NH4+和 15NH4+从 15No3=通过 DNRA 活性派生为 No 3+和15No3+， （4） 随后的3 号微生物转化和 15NO3= 到N2O 异体通过修改的除色器方法， 和 （5） 使用气相色谱法 （GC/MS） 定量 N2O 异体体。3在以下一节中，首先对程序 （2） 和 （4） 的准备进行了描述，然后详细描述了所有五个组成部分过程。
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Protocol
1. 准备 PTFE 信封，用于定量捕获气态 NH3
- 将一块 60 毫米的聚四氟乙烯 （PTFE） 胶带（25 毫米宽）放在一小块铝箔上（约 300 mm x 450 mm 大小，用乙醇擦拭）。
- 在 450°C 下将玻璃纤维过滤器（直径为 10 mm，孔径为 2.7 μm）灰，在消声炉中为 4 小时。将玻璃纤维过滤器放在胶带长轴的中点上方一点（图 1a）。
- 在 GF/D 过滤器的中心点 20 μL 的 0.9 摩尔/L H2SO4， 并立即使用两个钳子折叠 PTFE 胶带：平端邮票钳和直端钳子。以下步骤（步骤 1.4–1.7） 如图 1 所示 ，应迅速执行。
- 将 PTFE 胶带翻转到图 1a 所示虚线上的 GF/D 滤波器上，形成图 1b 中所示的形状。
- 通过折叠密封两侧，然后用钳子紧按边缘（图1c）。不要按得太硬，不要划伤 PTFE 胶带。
- 用钳子折叠开端，然后用钳子按边（图1d）。
- 用钳子紧按边缘来密封开端（图1e）。在此过程期间，不应按下 GF/D 过滤器。
2. 为除硝酸盐法制备一 氧化 二氮还原酶缺乏除硝酸盐的生物质 ，伪多 多纳氯烃亚香料亚磷酸盐 ATCC13985
- 在 1/4 强度tryptone大豆汤 （TSB）aureofaciens的糖盘上， 将 20% 的伪莫纳斯氯烃亚斯普的甘油库存。在25°C下孵育板2~3天。
- 将一个 单菌群的P.氯虫 转移到一个装有5 mL的自动开把TSB介质和培养（无抖）的小试管，在黑暗中25°C下进行一天，直到获得最大生长;这将用作前文化。
- 将 3 mL 的预栽培转移到 1-L 瓶中，其中含有 1 L 新鲜准备的自动处理 TSB 的硅橡胶塞，并辅以 10 mmol/L KNO323。在25°C的黑暗条件下，在暗条件下使用搅拌器搅拌时孵育瓶子。 培养8小时后，用螺丝帽更换硅橡胶塞，并紧闭。继续种植在阿诺夏过夜。
- 在 4 °C 下以 18，800 x g 离心培养基 15 分钟，以获得生物质颗粒。
- 用30 mL的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS（-），pH 7.5，将包装的生物量洗三次，以完全消除NO 3=。离心条件与步骤 2.3 中相同。
- 洗涤后，用30 mL的D-PBS（-）重新悬浮包装的生物量。使用 1 mL 的悬架通过测量 OD600 来确定电池密度。移液 1 mL 等分，将剩余悬浮液放入含有 0.8 mL 45% 甘油的无菌冷冻液中。将准备好的甘油储存在 +80 °C 下，直到使用（参见第 6 节）。
3. 从样品沉积物中消除氧气、亚硝酸盐和硝酸盐
- 将 3.0 g（湿重）沉积物放入 20 mL 玻璃瓶中，并加入 9.0 mL 的地表水将其悬浮（25% w/w 泥浆）。
- 用黑色丁基橡胶塞（用离子交换水洗涤，通过高压灭菌消毒）和铝盖密封小瓶。
- 清除悬架，用 Ar （>99.99） 更换头部空间空气在0.6升/分钟使用歧管20分钟。
- 用超纯（>99.99995%）取代Ar headspace气体他吸尘 90 年代， 充电他 30 年代。重复此过程四次。将头部空间气体压力设置为 1.5 atm。
- 在20°C下孵育小瓶，在黑暗条件下以150转/分的速度摇晃，使用恒定的温度摇床消除沉积物悬浮液和头空间气体中剩余的氧气、硝酸盐和亚硝酸盐。
4. 确定DNRA速率的时间课程实验
- 用新鲜的超纯气代替头部气体使用与步骤 3.5 相同的程序，但无四次重复。
- 根据表 1， 通过使用气密注射器的丁基橡胶塞将标签基板添加到每个小瓶中。使用超纯 He 将头部空间的压力设置为 1.5 atm，在尺寸合适的玻璃瓶中清除先前准备的基板溶液，以避免空气污染。避免在注射过程中意外注入任何量的空气。
- 在 20°C 下孵育小瓶，在 150 rpm 时摇动。根据表1将基板添加到每个 小瓶中 ，孵育1小时、3小时和5小时。孵育停止后，将小瓶中的沉积物悬浮物悬浮到以下程序：步骤4.4~4.9。
- 从每个小瓶中取下铝盖和丁基橡胶塞。然后，将KCl（在450°C下4小时）加入沉积物悬浮液，最终浓度约为2摩尔/升，以确保从沉积物中回收NH4+。+用丁基橡胶塞和铝封口关闭小瓶。
- 在4°C的黑暗条件下，以150转/分的速度摇动沉积物1小时，提取NH4°。+
- 将小瓶中的整个沉淀物悬浮液转移到 50 mL 塑料离心管中，并在 10，000 x g 下离心，在 4 °C 下 10 分钟。
- 冲洗刚打开的 10 mL 一次性注射器的内壁，并将其连接到刚打开的一次性醋酸纤维素膜过滤器（孔径 0.22 μm，直径 25 mm）。然后，用1 mL的上清液冲洗膜过滤器。将冲洗过的注射器-过滤装置放在20毫升宽口聚丙烯 （PP） 瓶上。
- 通过醋酸膜过滤器将剩余的上清液过滤到 20 mL PP 瓶中。将提取物储存在 +20 °C，直到进一步分析。
5. 捕获扩散的 Nh4+ 在2M H2SO4中吸收到 PTFE 信封中的 GF/D 过滤器和 NH4+ 到No 3− 的说服氧化
- 制备浓度梯度为 0μmol/L、10 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L 和 500 μmol/L 的标准溶液。4对于15N 比率分析，确定 NH4=至 200 μmol/L 的总浓度，并制备 100：0 的同位素比， 99.5：0.5、 99：1、93：7、90：10、50：50 和 10：90，使用纯 14NH4Cl和 15NH4Cl 标准解决方案。
- 将 30 毫克 MgO（在 450°C 下 4 小时）转移到 20 mL 玻璃瓶中，将 PTFE 信封放在小瓶中。
- 将 5 mL 的样品或标准转移到含有 MgO 和 PTFE 包络的小瓶中，并立即用灰色丁基橡胶塞关闭。用铝盖密封。如果NH4+的 浓度预期超过500μmol/L，则将样品稀释至500μmol/L以下。
- 在 4 °C 下，以 150 rpm 转速摇动小瓶 3 小时。
- 拆下铝盖和丁基橡胶塞。使用端点钳子将 PTFE 信封从小瓶中拿出，用离子交换的水彻底冲洗信封和钳子，用擦拭纸擦拭，然后将信封放在新鲜的擦拭纸上。
- 打开PTFE信封与几个钳子（使用平端和点端的钳子）在步骤1.4~1.7执行折叠的确切相反顺序。
- 握住 GF/D 过滤器的外围区域，其中 H2SO4 应不吸收，并配有平端钳子，然后将其传输到带 PTFE 衬里盖的 11 mL 螺钉盖试管中。用离子交换的水冲洗钳子，然后用擦拭纸擦拭。
- 对剩余的信封重复步骤 5.5~5.7。
- 在每个试管中加入 1 mL 的离子交换水，关闭螺钉盖，并在室温下保持至少 30 分钟，以完全从 GF/D 过滤器中检出 NH4+。 在此步骤中，并行执行以下步骤（步骤 5.10）。
- 准备消耗性氧化溶液（POR）试剂25，26。25,
- 由于无法存储，因此请准备处理一天样品所需的确切POR量。
- 为准备POR处理50个样品，将100毫升离子交换水倒入200 mL螺帽瓶中，然后按此顺序加入1.52克NaOH（氮化合物分析等级）、3克玻酸和5克K2S2O8（ 氮和磷分析等级）。添加每个试剂后，立即摇动溶液，直到溶液完全溶解。
- 如有必要，将瓶子浸泡在温水中，以帮助溶解化学品;然而，对于NO3的污染，应当注意，因为自来水通常含有NO3=。−
- 步骤 5.8 后，打开螺钉盖，将 2 mL 的 POR 试剂添加到试管中，用螺钉盖紧闭管，以防止在以下步骤中出现任何损失或污染。
- 将试管放在机架上，用双层铝箔包裹，并在 121 °C 下将其解处理 1 小时。 在此步骤中，保持管子直立位置，避免在完成高压灭管后温度快速变化。
6. 使用四极化GC/MS 的除尼器方法确定从 NH4+转换的 NO3− =
- 混合100 mL无菌40-mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）和100 mL无菌30mmol/L葡萄糖无菌（20mmol/L磷酸盐和15mmol/L葡萄糖;最终）。
- 在 300 mL Erlenmeyer 烧瓶中加入 200 mL 磷酸盐缓冲葡萄糖溶液中的 1/7.2 体积的 P. 氯甲酸酯，然后用超纯 He （>99.995%）流 1 小时。
- 将 2.0 mL 的除尼器悬浮液分配到每个 5 mL 小瓶中。用灰色丁基橡胶塞和铝封口盖住小瓶。
- 用超纯的 He 代替头部空间空气，吸尘 3 分钟，为 He 充电 1 分钟。将头部空间气体正压设置为 1.3 atm，以避免无意的空气污染。
- 使用 1 mL 一次性注射器通过丁基橡胶塞注入 1 mL 的样品或标准。请注意实际注入的样品的确切数量。
- 在黑暗条件下在25°C下孵育小瓶过夜。
- 注入0.3 mL的6-mol/LL NaOH，以停止脱硝并吸收头部空间CO 2，否则将严重干扰GC/MS的N2O分析，因为CO 2和N 2 O具有相同的分子量。2
- 使用经过修改的喷射端口25确定头空间气体中的2 44N 2 O、45N 2 O 和 46 N2O的量。 45GC/MS 分析的工作条件见表2。
7. 数据分析
- 从已知浓度 14NH 4+与所生成总44N 2 O =.45 N2O = 46+ N 452O 之间的线性关系2派生NH4+ 浓度的校准曲线。 使用先前提供的方程27从已知原子%（即 15 N/ 14N+15N）与计算原子%之间的线性关系派生15N 含量的校准曲线。15通过将总NH 4=乘以 NH44+的15N 比率来计算浓度 15 NH4=。
- 使用其他地方提供的方程 28 、29、30计算潜在的DNRA 速率。
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Representative Results
本文提出的代表性结果来自 盐沼沉积物的15个N-跟踪实验。采样盐沼是在2011年日本东部大地震后在日本宫城县Kesen-numa市的Moune地区新建的。2017年9月，在部下和部间区的两个地点收集了地表沉积物（0~3厘米）。首先，在收集后，沉积物立即通过4毫米网状，清除植物根、贝壳碎片和碎石，然后均质化。样品储存在4°C，直到DNRA分析进行。
15NO3的孵育程序以及 14NH4+和15NH4+浓度的同步测定，都按照协议部分进行了说明。观察到所有沉积物在整个孵化期浓度增加15NH4+ （图2）。我们计算DNRA速率，通过将15 NH 4+4的累积率除以NO3= 池29的同位素比。计算速率在 24.8–177 nmol-N g=1干土 h=1 （表 3） 范围内，与先前研究中发现的值相当。这一获得的速率范围高于来自类似环境（包括潮间,沉积物17、盐沼,5、16和其他河口环境18、33、34）以及来自富营养化环境（如33,34北卡罗来纳州31个浅河口和上海城市河流16网32）的富营养化环境。31相反，Fernandes等人13报告说，印度有机富饶的红树林土壤的潜在DNRA率较高。一般来说，DNRA被认为受到高比例的可用C与电子接受器35，36，37,36,的青睐。证明具有代表性结果的样本取自地震新形成的盐沼，该沼泽地最初被用作种植田。样品的这一特殊特性可能有助于观察到的高DNRA率。与这种推测一致，与次波动区相比，表明地间区富含有机化合物（未显示数据）的 DNRA 速率高于次打区（图2，表3）。
图1：准备一个PTFE信封，用于捕获气态NH3。扩散过程中使用的PTFE包络是按照面板（A）=（E）中显示的说明折叠PTFE胶带来准备的。信封内的酸化过滤器捕获气态NH3。这些步骤应迅速执行。详细信息在协议部分的步骤 1.2~1.7 中提供。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：通过沉积物的厌氧孵化改变15 NH4++浓度。沉积物样品的15N示踪物孵化是重复进行的。15N-NH4+ 的浓度以每干重沉积物的 nmol 表示。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：低浓度N2O的校准曲线示例。N2O 的峰值面积是通过 m/z 44、m/z 45 和 m/z 46 的峰值面积之和获得的。GC/MS 分析的配置见表2。请单击此处查看此图的较大版本。
| 15添加到每个小瓶中的 N 标签和非标记基板 | ||
| 100mM | 100mM | |
| NH4Cl | K15否3 | |
| 添加到每个小瓶的 100 mM 库存溶液的体积 （μL） | 24 | 60 |
| 最终浓度（μmol/L）* | >230| | 570 |
| *通过假设沉积物的含水量为 50% 来计算显示的值 | ||
| ・取决于背景铵浓度 | ||
表1：修正为小瓶的基板组合保留了约approximately11mL的沉积物悬浮液。样品是重复的，在1小时、3小时和5小时孵育后进行进一步分析。
| 设备 | |
| 四极性 Gcms | 石马祖 GCMS-QP2010 超 |
| 列 | CP-波拉邦德Q 25m;φ 0.32毫米;薄膜厚度，5μm |
| 分析条件 | |
| 列温度 | 40 °C |
| 喷射端口温度 | 100 °C |
| 载气流 | 总流量，47.1 mL=min-1 列中的流速，2.10 mL=min-1 |
| 精神比率 | 20 |
| 检测电压 | 1.5 kv |
| N2O 的灵敏度 | |
| 检测的下限 （LOD）* | 1.42 pmol |
| 量化下限（LOQ）* | 4.58 pmol |
| *LOD 和 LOQ 由 He 中 N 2 O（0.97、1.94、2.91、4.75、9.50、14.3 ppm）的序列稀释之间的线性关系、峰值区域和 S/N 比率之间的线性关系确定。2LOD 和 LOQ 的计算浓度分别相当于 S/N+3 和 S/N=10。 |
表 2：GC/MS 分析的条件。
| 泥沙 | DNRA 率 | 浓缩的 No3- * |
| nmol-N g-1 小时-1 | 原子% | |
| 间部 1 | 177 | 99.9 |
| 间部 2 | 129 | 99.0 |
| 子点 1 | 39.3 | 99.9 |
| 子点 2 | 24.8 | 99.0 |
| *与添加的 KNO 3 的原子百分比相同;在用过的孵化条件下完全消除和没有硝化，之前已经过测试。 |
表3：经测试的地间和子部沉积物的潜在DNRA速率。
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Discussion
DNRA分析NH4+的浓度和同位素比用几种方法进行量化。NH4+的浓度和同位素比通常单独测量。NH4+浓度通常使用色度测量方法测量，包括自动分析仪4、,10、15、16、17。同位素比测量具有很大的变化，取决于其NH4+转换、陷印和仪器分析方法。典型方法包括：
（1） 样品中的 NH4+通过添加 MgO 或 NaOH 转换为 NH3。从液相移动到气相后，NH3被困在酸化玻璃过滤器或酸溶液中。干燥后，使用元素分析仪/同位素比质谱仪2（EA-IRMS）11、18、22、38将11,18,过滤器燃烧并分析为,N2。22或者，在酸溶液中捕获的NH4++被收集在吸附剂（例如沸石）上，并通过EA-IRMS10， 12进行燃烧和分析。
（2）NH 4+通过低溴米特氧化氧化为N 2。进化N2的同位素组成通过 IRMS4、14、39,14,39或膜引入质谱仪 （MIMS）16、 17,进行测量。
（3） NH4+ 浓度使用高性能液相色谱确定，无需任何转换。由于 NH4+ 和NH3的均衡对于15NH4+和14NH4+ 接近 pKa的pH 值略有不同，因此14NH4+和15NH4+浓度可以根据保留时间6、19、40中的小移位确定。,
本文中描述的方法与上面列出的方法（1）基本相同，即碱性条件下玻璃过滤器上将NH4++恢复为NH3的步骤;但是，与以下顺序 NH 4 +转换步骤不同。这些转换步骤基于以前的研究，并进行了额外的修改，以缩短一系列实验所需的时间。首先，我们对原始的诋毁器方法进行了一些修改。在像前面描述的23、24号那样准备P.氯,气的量量后，我们生长细菌，并保留浓缩细胞悬浮液作为甘油。这种致密细胞悬浮液可以通过与缓冲液混合直接用于同位素分析，因为诋毁活性已经充分诱导。即使需要进一步调查，这种修改可能会提高分析的可重复性，因为所提出的方法能够大规模培养除尼的细胞，直接可用于分析。我们还修改了用于悬浮细菌细胞的溶液的组成，从基于TSB的培养基到磷酸盐缓冲葡萄糖溶液，以排除原始介质中不必要的成分，如肽。这种修饰可以减少空白N的污染，因为磷酸盐缓冲葡萄糖溶液不含N，不像以前研究中使用的原始介质;这应该通过进一步分析进行测试。在通过扩散法收集NH4++的步骤中，我们缩短了孵育周期，降低了温度，以尽量减少有机N的分解和NH4+的任何不利转换或损失。使用校准曲线的线性度检查此修改的有效性。我们还检查了修改后的温度和潜伏期是否不影响NH4+的恢复（未显示数据）。
此方法的另一个优点是，NH4+ 最终转换为 N2O，它具有低大气背景，可以使用四极体 GC/MS 进行测量，这比 IRMS 更便宜且更易于管理。在表2所示的条件下，CO2（m/z 44）和N2O（m/z 44）由GC完全分离;这些气体的保留时间分别是1.15分钟和1.07分钟。由于大气中的 N2O 浓度按 ppb 的顺序排列，因此即使在低浓度下，也可以以微不足道的空气干扰来测量 N2O。N2O 的校准曲线几乎穿过原点，表明由于大气污染对 N2O 浓度的影响非常有限（图3）。该方法还具有将14 NH 4 +和15NH+ 4+浓度一15量化的优点;除上述方法（3）外，规范方法要求对浓度和同位素比进行单独分析。
总体而言，使用这种方法的NH4+ 检测和定量限值分别约为0.03μmol和0.09μmol，如果将5 mL的样品溶液（即本例中的沉积物提取物）用于扩散过程，则这些值相当于6μmol/L和18μmol/L。即使建议使用色度法来确定NH4+ 低浓度样品的NH4+ 浓度，但该方法有效地确定了NH4+同位素比和浓度相对较高的铵的样品。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢田中真纪子帮助数据收集和开发协议。样本收集由JSPS KAKENHI赠款编号17K15286支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
References
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- Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
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