Summary
Uma série de métodos para determinar a taxa potencial de DNRA com base em 14NH4+/15NH4+ análises é fornecida em detalhes. NH4+ é convertido em N2O através de várias etapas e analisado usando cromatografia de gás quadrupole-espectrometria de massa.
Abstract
A importância de entender o destino do nitrato (NO3−), que é a espécie N dominante transferida de ecossistemas terrestres para aquáticos, tem aumentado porque as cargas globais de nitrogênio aumentaram drasticamente após a industrialização. A redução do nitrato dissimlatório para o amônio (DNRA) e a denitrificação são processos microbianos que usam o NO3– para respiração. Em comparação com a denitrificação, as determinações quantitativas da atividade DNRA têm sido realizadas apenas em uma medida limitada. Isso levou a uma compreensão insuficiente da importância do DNRA no Nº3– transformações e os fatores reguladores desse processo. O objetivo deste artigo é fornecer um procedimento detalhado para a medição da taxa potencial de DNRA em amostras ambientais. Em suma, a taxa potencial de DNRA pode ser calculada a partir da taxa de acumulação de amônio com rótulo N 15NH (15NH4+) em 15NO3− incubação adicionada. A determinação das concentrações 14NH4+ e 15NH4+ descritas neste artigo é composta pelas etapas a seguir. Primeiro, o NH4+ na amostra é extraído e preso em um filtro de vidro acidificado como sal de amônio. Em segundo lugar, o amônio preso é elucido e oxidado para o Nº3- via oxidação persulfeto. Em terceiro lugar, o NO3− é convertido para N2O através de um N2O reductase denitrifier deficiente. Finalmente, o N2O convertido é analisado usando um sistema de espectrometria de gás quadrúpole previamente desenvolvido. Aplicamos este método aos sedimentos de pântanos salgados e calculamos suas potenciais taxas de DNRA, demonstrando que os procedimentos propostos permitem uma determinação simples e mais rápida em comparação com os métodos descritos anteriormente.
Introduction
A síntese artificial do fertilizante nitrogênio e sua aplicação generalizada têm perturbado muito o ciclo global de nitrogênio. Estima-se que a transferência de nitrogênio reativo de sistemas terrestres para costeiros dobrou desde o pré-industrial1. Uma porção significativa de fertilizantes aplicados a um determinado campo é levada do solo para rios ou águas subterrâneas, principalmente como nº3− 2. Isso pode causar problemas ambientais, como a poluição da água potável, a eutrofização e a formação de hipóxia. NO3− em ambientes hídricos é removido ou retido no ecossistema através de assimilação biológica e vários processos dissimlatórios microbianos. A denitrificação e a anammox são conhecidas por serem os principais processos de remoção microbiana para o NO3−. A denitrificação é a redução microbiana de produtosN− N gasoso (NO, N2O e N2) juntamente com a oxidação de um doador de elétrons, como substâncias orgânicas, reduzindo assim o risco dos problemas acima mencionados. A Anammox também produz N2 a partir de NO2− e NH4+; portanto, remove n inorgânico de um ecossistema. Por outro lado, a DNRA trabalha para reter n em um ecossistema; é geralmente aceito que o DNRA é realizado principalmente por bactérias fermentativas ou quimiotoautotróficas e que reduzem o dissimlatório NO3– à NH 4+4+ biodisponente e menos móvel.
Estudos sobre DNRA têm sido realizados principalmente em ecossistemas marinhos ou estuarinos, como sedimentos oceânicos ou estuarinos e água, solo salgado ou salgado e solo de manguezal. Ecossistemas costeiros ou marinhos são importantes como reservatórios para a remoção do Nº3– dos ecossistemas terrestres, e em estudos anteriores o DNRA tem se mostrado contribuinte em uma gama muito ampla de NO3− remoção (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Além disso, a existência do DNRA tem sido demonstrada em uma ampla gama de ambientes, incluindo ambientes de água doce19,solos de arroz20e solosflorestais 21. Embora esses estudos tenham demonstrado que o DNRA é potencialmente comparável à denitrificação para o NO3− remoção, os estudos que medem a atividade de DNRA ainda são muito limitados em comparação com aqueles que medem a denitrificação.
A taxa de DNRA foi avaliada utilizando-se 15técnicas de rotulagem N em conjunto com a análise de dados por meio de modelos analíticos ou numéricos. Uma solução analítica para calcular a taxa DNRA baseia-se no aumento do enriquecimento de 15N do pool NH4+ após a adição de 15NO3− como rastreador. 15 N-rotulado NO3− é adicionado a uma amostra e incubado, e a taxa de DNRA pode então ser calculada a partir da concentração e da razão isótopo alterações na NH4+ antes e depois de um determinado período de tempo. Neste artigo, um método para quantificar a concentração NH4+ e a razão isótopos, que são necessários para calcular a taxa de DNRA, é descrito em detalhes. Basicamente, o método aqui relatado é uma combinação de várias técnicas relatadas anteriormente22,23,24,25,26 com modificações adicionadas a alguns procedimentos. O método é composto por uma série de cinco procedimentos componentes: (1) incubação de uma amostra ambiental com a alteração de um rastreador de isótopos estáveis, 15NO3−, (2) extração e recuperação de NH4+ utilizando um "procedimento de difusão" com modificações, (3) oxidação persulfato de NH4+ na amostra, constituído por NH4+ e 15NH4+ derivados de 15NO3− via atividade DNRA, em NO3− e 15NO3−, (4) posterior transformação microbiana de NO3− e 1 5NO3− para N2O isotopomers através do método denitrifier modificado, e (5) quantificação dos isotopolímeros N2O usando cromatografia a gás espectrometria de massa (GC/MS). Na seção seguinte, primeiro, a preparação para procedimentos (2) e (4) é descrita e, posteriormente, todos os cinco procedimentos componentes são descritos detalhadamente.
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Protocol
1. Preparação de um envelope PTFE para captura quantitativa de NHgasoso 3
- Coloque uma peça de 60 mm de fita politetrafluoroetileno (PTFE) (25 mm de largura) em uma pequena folha de papel alumínio (aproximadamente 300 mm x 450 mm de tamanho, limpa com etanol).
- Ash um filtro de fibra de vidro (10 mm de diâmetro com um tamanho de poros de 2,7 μm) a 450 °C por 4h em um forno de abafa. Coloque o filtro de fibra de vidro um pouco acima do ponto médio do eixo mais longo da fita(Figura 1a).
- Local 20 μL de 0,9-mol/L H2SO4 no centro de um filtro GF/D, e dobre imediatamente a fita PTFE usando duas pinças: pinças de selo de ponta plana e pinças retas. As etapas a seguir, as etapas 1.4-1.7, são mostradas na Figura 1 e devem ser conduzidas rapidamente.
- Gire a fita PTFE sobre o filtro GF/D na linha pontilhada mostrada na Figura 1a para formar a forma mostrada na Figura 1b.
- Sele ambos os lados dobrando e, em seguida, pressionando firmemente a borda com a pinça(Figura 1c). Não pressione muito forte e não arranhe a fita PTFE.
- Dobre a extremidade aberta com a pinça e, em seguida, pressione a borda com a pinça(Figura 1d).
- Sele a extremidade aberta pressionando firmemente a borda com a pinça(Figura 1e). O filtro GF/D não deve ser pressionado durante este procedimento.
2. Preparando a biomassa de um denitrifier deficiente de óxido nitroso, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, para o método denitrifier
- Reúna um estoque de 20% de glicerol de pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 em 1/4 de força triptona caldo de soja (TSB). Incubar as placas a 25 °C durante 2-3 dias.
- Transfira uma colônia de solteiros de P. clororaphis para um pequeno tubo de ensaio contendo 5 mL de meio TSB autoclavado e cultura aerobicamente (sem tremer) por um dia a 25 °C no escuro até obter o crescimento máximo; isso será usado como a précultura.
- Transfira 3 mL da pré-cultura para uma garrafa 1-L com rolha de borracha de silício contendo 1 L de TSB modificado autoclavado recém-preparado complementado com 10 mmol/L KNO323. Incubar a garrafa enquanto agita usando um agitador em condições escuras a 25 °C. Depois de cultivar por 8h, substitua a rolha de borracha de silicone por uma tampa de parafuso e feche firmemente. Continue o cultivo em anoxia durante a noite.
- Centrifugar a cultura a 18.800 x g por 15 min a 4 °C para obter pelotas de biomassa.
- Lave a biomassa embalada três vezes com 30 mL da solução salina tamponada de fosfato de Dulbecco (D-PBS(-), pH 7.5), para eliminar completamente o Nº3−. As condições da centrifugação são as mesmas do passo 2.3.
- Após a lavagem, suspenda a biomassa embalada com 30 mL de D-PBS(-). Use 1 mL da suspensão para determinar a densidade celular medindo OD600. Alíquotas pipetas de 1 mL da suspensão restante em criovials estéreis contendo 0,8 mL de 45% de glicerol. Preservar os estoques de glicerol preparados a −80 °C até usar (ver seção 6).
3. Eliminação de oxigênio, nitrito e nitrato do sedimento amostral
- Pesar 3,0 g (peso molhado) de sedimento em um frasco de vidro de 20 mL e adicionar 9,0 mL de água superficial para suspendê-lo (25% c/w chorume).
- Sele o frasco com uma rolha de borracha butil preta (lavada com água trocada por íons e esterilizada via autoclaving) e uma tampa de alumínio.
- Purgue a suspensão e substitua o ar do headspace por Ar (>99,99%) a 0,6 L/min por 20 min usando um coletor.
- Substitua o gás ar headspace por ultra-puro (>99,99995%) Ele aspirando por 90 s e cobrando Ele por 30 s. Repita este procedimento quatro vezes. Coloque a pressão do gás na cabeça para 1,5 atm.
- Incubar os frascos a 20 °C durante a noite com agitação a 150 rpm em condições escuras usando um agitador de temperatura constante para eliminar o restante do oxigênio, nitrato e nitrito na suspensão de sedimentos e gás headspace.
4. Experiência de curso de tempo para determinar a taxa de DNRA
- Substitua o gás do espaço da cabeça por ultra-puro fresco Ele usando o mesmo procedimento que na etapa 3.5, mas sem as quatro repetições.
- Adicione substratos rotulados e não rotulados a cada frasco de acordo com a Tabela 1 através da rolha de borracha butil usando uma seringa gastight. Purigue as soluções de substrato previamente preparadas em frascos de vidro de tamanho adequado usando he ultra-puro com a pressão do headspace definida para 1,5 atm para evitar contaminação do ar. Evite a injeção não intencional de qualquer quantidade de ar durante os procedimentos de injeção.
- Incubar frascos a 20 °C com agitação a 150 rpm. Adicione os substratos a cada frasco de acordo com a Tabela 1 e incubar por 1h, 3 h e 5h. Após a paralisação da incubação, sujeito a suspensão de sedimentos nos frascos aos seguintes procedimentos: etapas 4.4-4.9.
- Remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl de cada frasco. Em seguida, adicione KCl (ashed a 450 °C por 4 h) à suspensão de sedimentos até uma concentração final de aproximadamente 2 mol/L para garantir a recuperação de NH4+ do sedimento. Feche os frascos com uma rolha de borracha butyl e um fechamento de alumínio.
- Agite o sedimento a 150 rpm por 1h a 4 °C em condições escuras para extrair o NH4+.
- Transfira toda a suspensão de sedimentos no frasco para um tubo de centrífuga de plástico de 50 mL e centrífuga a 10.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Enxágüe a parede interna de uma seringa descartável de 10 mL recém-aberta e anexe-a a um filtro de membrana de acetato de celulose descartável recém-aberto (tamanho de poros 0,22 μm, 25 mm de diâmetro). Em seguida, enxágue o filtro de membrana com 1 mL de supernasal. Coloque a unidade de filtro de seringa enxaguada em uma garrafa de polipropileno de boca larga (PP) de 20 mL.
- Filtre o restante sobrenante através de um filtro de membrana de acetato na garrafa PP de 20 mL. Armazene os extratos a −20 °C até uma análise mais aprofundada.
5. Captura de NH4+ em 2M H2SO4 absorvido ao filtro GF/D no envelope PTFE e a oxidação persulfato de NH4+ a NO3−
- Prepare soluções padrão de 14NH4Cl com gradientes de concentração de 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L e 500 μmol/L. Para a análise da razão de 15N, fixar a concentração total de NH4+ a 200 μmol/L e preparar as relações de isótopos de 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50, e 10:90 com soluções padrão puras 14NH4Cl e 15NH4Cl.
- Transfira 30 mg de MgO (cinzas a 450 °C por 4 h) para um frasco de vidro de 20 mL e coloque o envelope PTFE no frasco.
- Transfira 5 mL de uma amostra ou padrão para o frasco contendo o MgO e o envelope PTFE, e feche imediatamente com uma rolha de borracha de butyl cinza. Vedação com uma tampa de alumínio. Se a concentração de NH4+ for esperada para exceder 500 μmol/L, diluir a amostra para abaixo de 500 μmol/L.
- Agite os frascos a 150 rpm por 3h a 4 °C em condições escuras.
- Remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl. Tire o envelope PTFE do frasco usando pinças pontiagudas, enxágue completamente o envelope e a pinça com água trocada por íons, limpe-os com um papel de limpeza e, em seguida, coloque o envelope em um papel de limpeza fresco.
- Abra o envelope PTFE com um par de pinças (o uso da pinça de ponta plana e ponta é recomendado) na ordem exata de ordem inversa do dobrável realizado nas etapas 1.4-1.7.
- Segure a área periférica do filtro GF/D, onde o H2SO4 deve ser desvendado, com a pinça de ponta plana, e transfira-a para um tubo de ensaio de tampa de parafuso de 11 mL com uma tampa forrada com PTFE. Enxágüe as pinças com água trocada por íons e limpe-as com papel de limpeza.
- Repita as etapas 5.5-5.7 para os envelopes restantes.
- Adicione 1 mL de água trocada de íons a cada um dos tubos de ensaio, feche a tampa do parafuso e mantenha-a sem tremer por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente para elutar completamente o NH4+ do filtro GF/D. Durante esta etapa, realize a etapa seguinte (etapa 5.10) em paralelo.
- Prepare o reagente persulfate-oxidante (POR)25,26.
- Como não pode ser armazenado, prepare a quantidade exata de POR necessária para o tratamento de um único dia de amostras.
- Para preparar o POR para tratar 50 amostras, despeje 100 mL de água trocada por íons em uma garrafa de tampa de parafuso de 200 mL e adicione 1,52 g de NaOH (grau de análise composto de nitrogênio), 3 g de ácido bórico e 5 g de K2S2O8 (grau de análise de nitrogênio e fósforo) nessa ordem. Imediatamente após adicionar cada reagente, agite a solução até que ela seja completamente dissolvida.
- Se necessário, mergulhe a garrafa em água morna para ajudar na dissolução dos produtos químicos; no entanto, deve-se prestar atenção em relação à contaminação do Nº3– porque a água da torneira normalmente contém o Nº3−.
- Após a etapa 5.8, abra a tampa do parafuso, adicione 2 mL do reagente POR ao tubo de ensaio e feche o tubo firmemente com uma tampa de parafuso para evitar qualquer perda ou contaminação durante as etapas seguintes.
- Coloque os tubos de ensaio em um rack, enrole-os em papel alumínio de duas camadas e autoclave-os por 1h a 121 °C. Mantenha os tubos em posição vertical durante esta etapa e evite mudanças rápidas de temperatura após o término do autoclaving.
6. Determinando o NO3− convertido a partir de NH4+ pelo método denitrifier usando quadrupole GC/MS
- Misture 100 mL de tampão fosfato estéril de 40 mmol/L (pH 7,2) e 100 mL de glicose estéril de 30 mmol/L asepticamente (fosfato de 20 mmol/L e glicose de 15 mmol/L; final).
- Adicione um volume de 1/7,2 volume de estoque de glicerol de C. clororaphis a 200 mL da solução de glicose tamponada com fosfato em um frasco de Erlenmeyer de 300 mL, e purga com um He ultra-puro (>99,995%) fluxo por 1 h.
- Dispense 2,0 mL da suspensão denitrifier em cada frasco de 5 mL. Tampe os frascos com uma rolha de borracha de butyl cinza e um fechamento de alumínio.
- Substitua o ar da cabeça por he ultra-puro, aspirando por 3 minutos e carregando o He por 1 min. Coloque a pressão positiva do gás do headspace para 1,3 atm para evitar contaminação de ar não intencional.
- Injete 1 mL de uma amostra ou padrão através da rolha de borracha butil usando uma seringa descartável de 1 mL. Note a quantidade exata da amostra injetada.
- Incubar os frascos durante a noite a 25 °C em condições escuras.
- Injete 0,3 mL de 6-mol/LL NaOH para parar a denitrificação e absorver o CO2do headspace, o que de outra forma perturbará seriamente a análise N2O por GC/MS porque o CO2 e o N2O têm o mesmo peso molecular.
- Determine as quantidades de 44N2O, 45N2O e 46N2O no gás headspace usando quadrupole GC/MS com uma porta de injeção modificada25. As condições de funcionamento utilizadas para a análise GC/MS estão mostradas na Tabela 2.
7. Análise de dados
- Derivar a curva de calibração para o NH4+ concentração da relação linear entre a concentração conhecida de 14NH4+ e as intensidades de sinal medidos do total produzido 44N2O + 45N2O + 46N2O. Derivar a curva de calibração para o teor de 15N da relação linear entre o átomo conhecido% (ou seja,. 15N/14N+15N) e o átomo calculado% usando uma equação previamente fornecida27. Calcule a concentração de 15NH4+ multiplicando o total de NH4+ pela razão de 15N de NH4+.
- Calcule a taxa potencial de DNRA usando equações fornecidas em outros lugares28,,29,30.
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Representative Results
Os resultados representativos apresentados neste artigo foram derivados de 15experimentos de rastreamento n de sedimentos de pântanos salgados. O pântano de sal amostrado foi recentemente criado após o Grande Terremoto do Japão Oriental de 2011 na área de Moune da cidade de Kesen-numa, na província de Miyagi, japão. Em setembro de 2017, sedimentos superficiais (0-3 cm) foram coletados em dois locais nas zonas subtidal e intertidais. Primeiro, logo após a coleta, o sedimento foi peneirado através de uma malha de 4 mm para remover raízes vegetais, detritos de conchas e entulho e, em seguida, homogeneizado. As amostras foram armazenadas a 4 °C até a análise do DNRA ser realizada.
Os procedimentos de incubação para as 15NO3− e a determinação simultânea das concentrações 14NH4+ e 15NH4+ foram realizados conforme descrito na seção de protocolo. Observou-se aumento na concentração de 15NH4+ ao longo do período de incubação para todos os sedimentos (Figura 2). Calculamos as taxas de DNRA dividindo a taxa de acumulação de 15NH4+ pela razão isótopo do N3− pool29. As taxas calculadas estavam dentro da faixa de 24,8-177 nmol-N g−1 solo seco h−1 (Tabela 3) e eram comparáveis aos valores encontrados em estudos anteriores. Essa faixa de taxas obtidas é maior do que os valores relatados derivados de ambientes semelhantes, incluindo os de sedimentos intertidais17,pântanos de sal5,,16, e outros ambientes estuarinos18,33,,34, bem como de ambientes eutróficos, como um estuário de rios rasos na Carolina do Norte31 e as redes urbanas deRios 32de Xangai. Por outro lado, Fernandes et al.13 relataram taxas potenciais de DNRA mais altas em solos de manguezais organicamente ricos na Índia. Em geral, acredita-se que o DNRA seja favorecido por uma alta proporção de C disponível para os aceitadores de elétrons35,,36,37. As amostras que demonstram os resultados representativos foram retiradas de um pântano de sal recém-criado por um terremoto, que tinha sido originalmente usado como um campo de cultivo. Esta característica particular das amostras pode contribuir para a alta taxa de DNRA observada. Consistente com essa especulação, a taxa de DNRA na zona intertidal, rica em compostos orgânicos (dados não mostrados) em relação à zona subtidal, foi maior do que na zona subtidal(Figura 2, Tabela 3).
Figura 1: Preparação de um envelope PTFE para captura de NHgasoso 3. O envelope PTFE usado no procedimento de difusão é preparado dobrando fita PTFE seguindo as instruções mostradas nos painéis (A)–(E). O filtro acidificado dentro do envelope captura o gasoso NH3. Essas etapas devem ser conduzidas rapidamente. Informações detalhadas são dadas nas etapas 1.2-1.7 na seção protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alteração na concentração de 15NH4+ através da incubação anaeróbica de sedimentos. As incubações de 15N das amostras de sedimentos foram realizadas em duplicata. A concentração de 15N-NH4+ é mostrada em nmol por peso seco de sedimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Um exemplo de curva de calibração de baixa concentração N2O. A área máxima de N2O foi obtida pela soma da área de pico de m/z 44, m/z 45 e m/z 46. As configurações para análise GC/MS são mostradas na Tabela 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 15 Substratos n-rotulados e não rotulados adicionados a cada frasco | ||
| 100mM | 100mM | |
| NH4Cl | K15NO3 | |
| Volume (μL) de solução de estoque de 100 mM adicionada a cada frasco | 24 | 60 |
| Concentração final (μmol/L)* | >230§ | 570 |
| *Os valores mostrados são calculados assumindo que o teor de água do sedimento é de 50% | ||
| §dependendo da concentração de amônio de fundo | ||
Tabela 1: Combinações de substratos alterados para frascos que retêm aproximadamente 11 mL da suspensão dos sedimentos. As amostras foram preparadas em duplicata e submetidas a novas análises após 1h, 3h e 5h de incubação.
| Equipamento | |
| quadrirupole GCMS | Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra |
| Coluna | CP-PoraBONDQ 25m; φ 0,32mm; espessura do filme, 5μm |
| Condições analíticas | |
| temp coluna | 40 °C |
| temporária porta de injeção | 100 °C |
| fluxo de gás transportador | Taxa de fluxo total, 47,1 mL•min-1 taxa de fluxo na coluna, 2,10 mL•min-1 |
| relação sprit | 20 |
| tensão de detecção | 1,5 kv |
| Sensibilidade de N2O | |
| menor limite de detecção (LOD)* | 1,42 pmol |
| menor limite de quantificação (LOQ)* | 4.58 pmol |
| *LOD e LOQ foram determinados por uma relação linear entre uma diluição seriada de N2O (0,97, 1,94, 2,91, 4,75, 9,50, 14,3 ppm) em He, respostas correspondentes na área de pico e razão S/N. LOD e LOQ foram calculados como concentrações equivalentes a S/N=3 e S/N=10, respectivamente. |
Tabela 2: Condições para a análise gc/MS.
| Sedimento | Taxa de DNRA | enriquecimento de NO3- * |
| nmol-N g-1 h-1 | átomo% | |
| Intertidal 1 | 177 | 99.9 |
| Intertidal 2 | 129 | 99.0 |
| Subtidal 1 | 39.3 | 99.9 |
| Subtidal 2 | 24.8 | 99.0 |
| *mesmo que o átomo% do KNOadicionado 3; eliminação completa e nenhuma nitrificação sob condições de incubação utilizadas foi testada anteriormente. |
Tabela 3: Taxas potenciais de DNRA dos sedimentos intertidais e subtida testados.
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Discussion
A razão de concentração e isótopo de NH4+ para a análise DNRA foi quantificada utilizando vários métodos. As concentrações e as relações de isótopos de NH4+ são geralmente medidas separadamente. A concentração NH4+ é tipicamente medida usando métodos colorimétricos, incluindo um autoanalyzer4,10,15,16,17. A medição da razão do isótopo tem grandes variações dependendo do método de NH4+ conversão, trapping e instrumentação para a análise. Os métodos típicos incluem o seguinte:
(1) O NH4+ na amostra é convertido em NH3 através da adição de MgO ou NaOH. Depois de passar da fase líquida para a fase do gás, o NH3 fica preso em um filtro de vidro acidificado ou em uma solução ácida. Após a secagem, o filtro é queimado e analisado como N2 utilizando um espectrômetro de massa analisador elemental/isótopo (EA-IRMS)11,,18,,22,38. Alternativamente, o NH4+ capturado em uma solução ácida é coletado em um adsorbent (por exemplo, zeolite) e é queimado e analisado via EA-IRMS10,12.
(2) NH4+ é oxidado a N2 via oxidação hipobromitita. A composição isotópica do N2 evoluído é medida via IRMS4,,14,39 ou espectrometria de massa de introdução de membrana (MIMS)16,17.
(3) A concentração NH4+ é determinada por meio de cromatografia líquida de alto desempenho sem qualquer conversão. Como o equilíbrio de NH4+ e NH3 é ligeiramente diferente para 15NH4+ e 14NH4+ perto do pH de pHa, as concentrações de 14NH4+ e 15NH4+ podem ser determinadas com base em uma pequena mudança no tempo de retenção6,,19,,40.
O método descrito neste artigo é basicamente o mesmo que a abordagem (1) listada acima, ou seja, a etapa de recuperação NH4+ como NH3 em um filtro de vidro sob condições alcalinas; no entanto, é diferente em relação às seguintes etapas sequenciais NH4+ de conversão. Essas etapas de conversão são baseadas em estudos anteriores com modificações adicionais para encurtar o tempo necessário para uma série de experimentos. Primeiro, fizemos algumas modificações no método original de denitrifier. Depois que a biomassa de P. clororaphis é preparada como descrito anteriormente23,24, cultivamos bactérias e preservamos a suspensão celular concentrada como um estoque de glicerol. Esta suspensão de célula densa pode ser usada diretamente para a análise de isótopos misturando-a com uma solução tampão porque a atividade denitrificante já foi suficientemente induzida. Embora seja necessária uma investigação mais aprofundada, essa modificação pode melhorar a reprodutibilidade da análise, pois o método apresentado permite o cultivo em massa de células denitrifier, que estão diretamente disponíveis para análises. Também modificamos a composição da solução para suspensão das células bacterianas, de um meio baseado em TSB a uma solução de glicose tamponada com fosfato, para excluir os componentes desnecessários, como pepton no meio original. Esta modificação pode reduzir a contaminação em branco N porque a solução de glicose tamponada com fosfato não contém N, ao contrário do meio original utilizado em estudos anteriores; isso deve ser testado através de análises posteriores. Na etapa de coleta NH4+ através do método de difusão, encurtamos o período de incubação e reduzimos a temperatura para minimizar a quebra de N orgânico e qualquer conversão ou perda desfavorável de NH4+. A validade desta modificação foi verificada utilizando-se a linearidade da curva de calibração. Também verificamos que o período de temperatura e incubação modificados não afetou a recuperação do NH4+ (dados não apresentados).
Outra vantagem deste método é que o NH4+ é finalmente convertido em N2O, que tem um baixo fundo atmosférico e pode ser medido usando quadrupole GC/MS, que é menos caro e mais fácil de gerenciar do que o IRMS. Na condição mostrada na tabela 2, CO2 (m/z 44) e N2O (m/z 44) são completamente separados por GC; o tempo de retenção desses gases é de 1,15 e 1,07 min, respectivamente. Uma vez que a concentração atmosférica de N2O está na ordem do ppb, n2O pode ser medido com interferência de ar insignificante mesmo em baixas concentrações. A curva de calibração de N2O passa quase pela origem, demonstrando a influência na concentração de N2O devido à contaminação atmosférica é muito limitada(Figura 3). Este método também tem a vantagem de que pode quantificar as concentrações de 14NH4+ e 15NH4+ juntas; métodos canônicos, exceto a abordagem (3) listada acima, requerem análises individuais para a concentração e a razão isótopos.
No geral, os limites de detecção e quantificação para NH4+ utilizando este método foram de aproximadamente 0,03 μmol e 0,09 μmol, respectivamente, e esses valores são equivalentes a 6 μmol/L e 18 μmol/L, se 5 mL da solução amostral (ou seja, o extrato de sedimentos neste caso) for utilizado para o procedimento de difusão, conforme descrito neste artigo. Embora o uso do método colorimétrico seja recomendado para determinar o NH4+ concentração de amostras que têm baixa NH4+, o método proposto determina efetivamente a razão NH4+ isótopo e a concentração em amostras com concentrações relativamente altas de amônio.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Naoto Tanaka por ajudar na coleta de dados e desenvolver o protocolo. A coleta de amostras foi apoiada pelo JSPS KAKENHI Grant Número 17K15286.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
References
- Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
- Galloway, J. N., et al.
- Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).
- Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
- Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
- An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
- Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
- Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
- Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
- Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
- Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
- Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
- Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
- Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
- Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
- Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
- Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
- Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
- Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
- Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
- Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
- Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
- Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
- Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
- Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
- Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
- Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
- Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
- Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
- Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
- Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
- Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
- Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
- Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
- Tiedje, J. M. Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
- Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
- Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
- Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
- Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
- Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).
