Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Mätning av de Dissimilatory Nitratminskningens potentiella frekvenser till ammonium Baserat på 14NH4+/15NH4+ Analyser via Sekventiell omvandling till N2O

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/59562
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 4, 4, 5, 1
1Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

Summary

En serie metoder för att fastställa den potentiella DNRA-frekvensen baserat på 14NH4+/15NH4+ analyser tillhandahålls i detalj. NH4+ omvandlas till N2O via flera steg och analyseras med hjälp av quadrupole gaskromatografi–masspektrometri.

Abstract

Vikten av att förstå nitrats öde (NO3−), som är den dominerande N-arten som överförs från terrestra till akvatiska ekosystem, har ökat eftersom de globala kvävebelastningarna har ökat dramatiskt efter industrialiseringen. Dissimilerande nitratreduktion till ammonium (DNRA) och denitrifikation är båda mikrobiella processer som använder NO3− för respiration. Jämfört med denitrifikationen har kvantitativa bestämningar av DNRA-verksamheten endast genomförts i begränsad omfattning. Detta har lett till en otillräcklig förståelse för DNRA:s betydelse i NO3− transformationer och de reglerande faktorerna i denna process. Målet med detta dokument är att tillhandahålla ett detaljerat förfarande för mätning av den potentiella DNRA-satsen i miljöprover. I korthet kan den potentiella DNRA-takten beräknas från den 15N-märkta ammonium (15NH4+) ackumulationshastighet i 15NO3− tillsatt inkubation. Fastställandet av de 14NH4+ och 15NH4+ koncentrationer som beskrivs i detta dokument består av följande steg. Först extraheras NH4+ i provet och fastnar på ett surt glasfilter som ammoniumsalt. För det andra eluteras och oxideras den fångade ammonium till NO3− via persulfatoxidation. För det tredje omvandlas NO3− till N2O via en N2O-reduktas-bristfällig denitrifier. Slutligen analyseras den konverterade N2O med hjälp av en tidigare utvecklad quadrupole gaskromatografi–masspektrometri system. Vi tillämpade denna metod på saltkärrsediment och beräknade deras potentiella DNRA-satser, vilket visar att de föreslagna förfarandena möjliggör en enkel och snabbare bestämning jämfört med tidigare beskrivna metoder.

Introduction

Den artificiella syntesen av kvävegödselmedel och dess utbredda tillämpning har kraftigt stört den globala kvävecykeln. Man uppskattar att överföringen av reaktivt kväve från land- till kustsystem har fördubblats sedan förindustriella tider1. En betydande del av gödselmedel som tillämpas på ett visst fält tvättas bort från jorden till floder eller grundvatten, främst som NO3− 2. Detta kan orsaka miljöproblem såsom dricksvattenföroreningar, övergödning, och bildandet av hypoxi. NO3− i vattenmiljöer avlägsnas från eller behålls i ekosystemet via biologisk assimilering och olika mikrobiella dissimilatoriska processer. Denitrification och anammox är kända för att vara stora mikrobiella borttagningsprocesser för NO3−. Denitrifikation är den mikrobiella reduktionen på NO3− till gasformiga N-produkter (NO, N2O, och N2) i kombination med oxidation av en elektrondonator, såsom organiska ämnen, och därigenom minska risken för de ovan nämnda problemen. Anammox producerar också N2 från NO2− och NH4+; därför tar den bort oorganiskt N från ett ekosystem. Omvänt arbetar DNRA för att behålla N i ett ekosystem; det är allmänt accepterat att DNRA utförs främst av fermentativa bakterier eller kemolithoautotrofa bakterier och att de minskar dissimilatoriska NO3− till biotillgängliga och mindre rörliga NH4+.

Studier på DNRA har främst utförts i marina eller flodmynningsekosystem, såsom oceaniska eller flodmynningssediment och vatten, salt eller bräckt kärr jord, och mangrove jord. Kust- eller havsekosystem är viktiga som reservoarer för att avlägsnaNO 3− från terrestra ekosystem, och i tidigare studier har DNRA visats bidra över ett mycket brett spektrum av NO3− borttagning (0–99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Vidare har förekomsten av DNRA visats i ett brett spektrum av miljöer inklusive sötvatten miljöer19, ris paddy jordar20, och skogsjordar21. Medan dessa studier har visat att DNRA är potentiellt jämförbart med denitrifikation för NO3− borttagning, är studier som mäter DNRA-aktiviteten fortfarande mycket begränsade jämfört med dem som mäter denitrifikation.

DNRA-frekvensen har utvärderats med hjälp av 15N-märkningstekniker i samband med dataanalys via analytiska eller numeriska modeller. En analytisk lösning för att beräkna DNRA-räntan baseras på ökningen av 15N-anrikningen av NH4+ poolen efter tillsats av 15NO3− som spårämne. 15 år N-märkt NO3− läggs till ett prov och inkuberas, och DNRA-satsen kan sedan beräknas utifrån koncentrations- och isotopkvotens förändringar i NH4+ före och efter en viss tidsperiod. I detta dokument beskrivs en metod för att kvantifiera NH4+ -koncentrationen och isotopförhållandet, som krävs för att beräkna DNRA-satsen, i detalj. I grund och botten, den metod som rapporteras här är en kombination av flera tidigare rapporteradetekniker 22,23,24,25,26 med ändringar läggas till vissa förfaranden. Metoden består av en serie av fem komponentförfaranden: (1) inkubering av ett miljöprov med ändring av en stabil isotopspårare, 15NO3−, (2) utvinning och återvinning av NH4+ med hjälp av ett "diffusionsförfarande" med ändringar, (3) persulfat oxidation av NH4+ i provet, bestående av inhemska NH4+och 15NH4+ som härrör från 15NO3− via DNRA-aktivitet, till NO3− och 15NO3−, (4) efterföljande mikrobiell omvandling av NO3− och 1 15NO3− till N2O isotopomerer via den modifierade denitrifiermetoden, och (5) kvantifiering av N2O-isotopomerna med hjälp av gaskromatografi–masspektrometri (GC/MS). I följande avsnitt beskrivs först förberedelserna för förfarandena (2) och (4) och därefter beskrivs därefter alla fem komponentförfarandena i detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av ett PTFE-kuvert för kvantitativt fångande av gasformiga NH3

  1. Placera en 60-mm bit polytetrafluoreten (PTFE) tejp (25 mm i bredd) på ett litet ark aluminiumfolie (cirka 300 mm x 450 mm i storlek, torkas av med etanol).
  2. Aska ett glasfiberfilter (10 mm i diameter med en porstorlek på 2,7 μm) vid 450 °C i 4 h i en muffleugn. Placera glasfiberfiltret lite ovanför mittpunkten på tejpens längre axel (Bild 1a).
  3. Spot 20 μL av 0,9-mol/L H2SO4 på mitten av ett GF/D-filter, och vik omedelbart PTFE-tejpen med hjälp av två pincetter: flat-ended stamp pincett och rakslutad pincetten. Följande steg, steg 1.4–1.7, visas i figur 1 och bör föras snabbt.
  4. Vänd PTFE-bandet över GF/D-filtret vid den streckade linjen som visas i figur 1a för att bilda formen som visas i figur 1b.
  5. Täta båda sidor genom att vika och sedan tätt trycka på kanten med pincetten (Bild 1c). Tryck inte för hårt, och repa inte PTFE-bandet.
  6. Vik den öppna änden med pincetten och tryck sedan på kanten med pincetten (Bild 1d).
  7. Täta den öppna änden genom att tätt trycka på kanten med pincetten (Bild 1e). GF/D-filtret bör inte tryckas in under denna procedur.

2. Förbereda biomassan av en dikväveoxid reduktas felrör, Pseudomonas klororafer subsp. aureofaciens ATCC13985, för denitrifier metoden

  1. Strimmig en 20% glycerol lager av Pseudomonas klororaferera subsp. aureofaciens ATCC13985 på 1/4 styrka tryptone soja buljong (TSB) agar plattor. Inkubera plattorna vid 25 °C i 2–3 dagar.
  2. Överför en singelkoloni av P. klororafer till ett litet provrör som innehåller 5 mL autoklaverat TSB-medium och kultur aerobt (utan omskakning) under en dag vid 25 °C i mörker tills det erhåller maximal tillväxt; detta kommer att användas som prekultur.
  3. Överför 3 mL av prekulturen till en 1-L-flaska med en silikongummipropp som innehåller 1 L nyberedda autoklaverade modifierade TSB kompletterat med 10 mmol/L KNO323. Inkubera flaskan medan du agiterar med hjälp av omrörare under mörka förhållanden vid 25 °C. Efter odling i 8 h, byt ut silikongummiproppen med en skruvlock och stäng tätt. Fortsätt odlingen i anoxi över natten.
  4. Centrifugera kulturen vid 18 800 x g i 15 min vid 4 °C för att erhålla biomassapellets.
  5. Tvätta den packade biomassan tre gånger med 30 mL av Dulbeccos fosfatbuffrade koksaltlösning (D-PBS(-), pH 7,5), för att helt eliminera NO3−. Förhållandena för centrifugeringen är samma som i Steg 2.3.
  6. Efter tvättningen, åter avbryta den packade biomassan med 30 mL D-PBS(-). Använd 1 mL av suspensionen för att bestämma celltätheten genom att mäta OD600. Pipett 1 mL alikvoter av återstående suspension till sterila kryoceller som innehåller 0,8 mL av 45% glycerol. Bevara de beredda glycerollagren vid −80 °C tills användning (se avsnitt 6).

3. Eliminering av syre, nitrit och nitrat från provsedimentet

  1. Väg in 3,0 g (våtvikt) sediment i en 20 mL glasflaska och tillsätt 9,0 mL ytvatten för att suspendera den (25% w/w flytgödsel).
  2. Täta injektionsflaskan med en svart butylgummipropp (tvättad med jonbyts vatten och steriliseras via autoklavering) och en aluminiumlock.
  3. Rensa upphängningen och ersätt headspace luften med Ar (>99,99%) vid 0,6 L/min i 20 min med hjälp av ett grenrör.
  4. Ersätt Ar-huvudutrymmesgasen med ultraren (>99,99995%) Han genom att dammsuga i 90 s och ladda Han för 30 s. Upprepa den här proceduren fyra gånger. Ställ in gastrycket från headspace till 1,5 atm.
  5. Inkubera injektionsflaskan vid 20 °C över natten med skakning vid 150 rpm under mörka förhållanden med hjälp av en skaksäckare med konstant temperatur för att eliminera kvarvarande syre, nitrat och nitrit i sedimentupphängningen och luftvägsgasen.

4. Tidskurs experiment för att fastställa DNRA takt

  1. Byt ut headspace-gasen mot färsk ultrarent Han med samma procedur som i steg 3.5 men utan de fyra upprepningarna.
  2. Tillsätt märkta och icke-märkta substrat till varje injektionsflaska enligt tabell 1 genom butylgummiproppen med hjälp av en gastät spruta. Rensa de tidigare beredda substratlösningarna i tillräckligt stora glasflaskor med hjälp av ultrarent Han med trycket från headspace-uppsättningen till 1,5 atm för att undvika luftförorening. Undvik oavsiktlig injektion av någon mängd luft under injektionsprocedurerna.
  3. Inkubera injektionsflaska vid 20 °C med skakning vid 150 rpm. Tillsätt substraten till varje injektionsflaska enligt tabell 1 och inkubera i 1 h, 3 h och 5 h. Efter att inkuberingen har stoppats, betvingar sedimentupphängningen i injektionsflaskan följande förfaranden: steg 4.4–4.9.
  4. Ta bort aluminiumlocket och butylgummiproppen från varje injektionsflaska. Tillsätt sedan KCl (försaskad vid 450 °C i 4 h) till sedimentupphängningen upp till en slutkoncentration på cirka 2 mol/L för att säkerställa återvinning av NH4+ från sedimentet. Stäng injektionsflaskan med en butylgummipropp och en aluminiumförslutning.
  5. Skaka sedimentet vid 150 varv/min i 1 h vid 4 °C under mörka förhållanden för att extrahera NH4+.
  6. Överför hela sedimentupphängningen i injektionsflaskan till ett 50 mL-plastcentrifugrör, och centrifug vid 10 000 x g under 10 min vid 4 °C.
  7. Skölj den inre väggen i en nyöppnad engångsspruta på 10 mL, och fäst den på ett nyöppnat engångsmembranfilter för cellulosaacetat (porstorlek 0,22 μm, 25 mm i diameter). Skölj sedan membranfiltret med 1 mL supernatant. Placera den sköljda sprutan–filterenheten på en 20-mL bred mun polypropylen (PP) flaska.
  8. Filtrera resterande supernatant genom ett acetatmembranfilter i 20-mL PP-flaskan. Förvara extrakten extrakt vid −20 °C tills vidare analys.

5. Fånga diffust NH4+ i 2M H2SO4 absorberas till GF/D-filtret i PTFE-kuvertet och persulfatoxidationen av NH4+ till NO3−

  1. Bered standardlösningar på 14NH4Cl med koncentrationsgradienter på 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L och 500 μmol/L. För 15N-relationsanalysen, fastställa den totala koncentrationen av NH4+ till 200 μmol/L och förbereda isotopförhållanden på 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 och 10:90 med rena 14NH4Cl och 15NH4Cl standardlösningar.
  2. Överför 30 mg MgO (försaskad vid 450 °C i 4 h) till en 20-mL glasflaska, och placera PTFE-kuvertet i injektionsflaskan.
  3. Överför 5 mL av ett prov eller standard i injektionsflaskan som innehåller MgO och PTFE-kuvertet, och stäng omedelbart med en grå butylgummipropp. Tätning med en aluminiummössa. Om koncentrationen av NH4+ förväntas överstiga 500 μmol/L, späd provet till under 500 μmol/L.
  4. Skaka injektionsflaskan vid 150 rpm i 3 h vid 4 °C under mörka förhållanden.
  5. Ta bort aluminiumlocket och butylgummiproppen. Ta ut PTFE-kuvertet ur injektionsflaskan med hjälp av spetsslutad pincetten, skölj kuvertet och pincetten med jonbyts vatten, torka dem med ett torkande papper och placera sedan kuvertet på ett nytt avtorkningspapper.
  6. Öppna PTFE-kuvertet med ett par pincetter (användning av både flat-ended och point-ended pincetten rekommenderas) i exakt omvänd ordning på den fällbara fällningen som utförs i steg 1.4–1.7.
  7. Håll det perifera området av GF / D-filtret, där H2SO4 är tänkt att vara oabsorberad, med den platta-ended pincetten, och överföra den till en 11-mL skruvlock provrör med en PTFE -fodrad lock. Skölj pincetten med jonbyts vatten och torka dem med torka papper.
  8. Upprepa steg 5.5–5.7 för de återstående kuverten.
  9. Tillsätt 1 mL jonbyts vatten till vart och ett av provrören, stäng skruvlocket och bibehåll det utan att skaka i minst 30 min vid rumstemperatur för att helt eluera NH4+ från GF/D-filtret. Under detta steg genomför du följande steg (steg 5.10) parallellt.
  10. Bered persulfat-oxiderande lösning (POR) reagens25,26.
    1. Eftersom den inte kan lagras, förbereda den exakta mängden POR som behövs för behandling av en enda dag av prover.
    2. För att förbereda POR för att behandla 50 prover, häll 100 mL jonbyts vatten i en 200-mL skruvlocksflaska och tillsätt 1,52 g NaOH (kväveföreningsanalysgrad), 3 g borsyra och 5 g av K2S2O8 (kväve och fosforanalysgrad) i den ordningen. Omedelbart efter tillsats av varje reagens, skaka lösningen tills den är helt upplöst.
    3. Om det behövs, blöt flaskan i varmt vatten för att hjälpa upplösningen av kemikalierna; bör dock uppmärksamhet ägnas med avseende på kontaminering av NO3− eftersom kranvatten normalt innehåller NO3−.
  11. Efter Steg 5.8, öppna skruvlocket, tillsätt 2 mL av POR-reagensen till provröret, och stäng röret tätt med ett skruvlock för att förhindra förlust eller kontaminering under följande steg.
  12. Stå provrören på ett rack, linda in dem i dubbelskiktad aluminiumfolie, och autoklav dem för 1 h vid 121 °C. Håll rören i upprätt läge under detta steg och undvik snabba temperaturförändringar efter avslutad autoklavering.

6. Fastställande av NO3− konverterad från NH4+ genom denitrifiermetoden med quadrupole GC/MS

  1. Blanda 100 mL steril 40-mmol/L fosfatbuffert (pH 7.2) och 100 mL steril 30-mmol/L glukos aseptiskt (20-mmol/L fosfat och 15-mmol/L glukos; slutlig).
  2. Tillsätt en 1/7,2 volym glycerollager av P. klororafer till 200 mL av den fosfatbuffrade glukoslösningen i en 300-mL Erlenmeyerkolv, och utrensning med en ultraren He (>99.995%) ström i 1 h.
  3. Dispensera 2,0 mL av denitrifierupphängningen i varje 5-mL injektionsflaska. Cap injektionsflaskan med en grå butylgummi propp och en aluminium förslutning.
  4. Byt ut headspaceluften mot ultraren He genom att dammsuga i 3 min och ladda He i 1 min. Ställ in headspace gas positivt tryck till 1,3 atm för att undvika oavsiktlig luftförorening.
  5. Injicera 1 mL av ett prov eller standard genom butylgummiproppen med hjälp av en engångsspruta på 1 ml. Notera den exakta mängden av provet som faktiskt injiceras.
  6. Inkubera injektionsflaskan över natten vid 25 °C under mörka förhållanden.
  7. Injicera 0,3 mL 6-mol/LL NaOH för att stoppa denitrifikationen och absorbera headspace CO2, som annars allvarligt kommer att störa N2O-analysen genom GC/MS eftersom CO2 och N2O har samma molekylvikt.
  8. Bestäm mängderna 44N2O, 45N2O och 46N2O i gasen för headspace med hjälp av quadrupole GC/MS med en modifierad injektionsport25. De driftsförhållanden som används för GC/MS-analysen framgår av tabell 2.

7. Dataanalys

  1. Härled kalibreringskurvan för NH4+ koncentrationen från det linjära förhållandet mellan den kända koncentrationen 14NH4+ och de uppmätta signalintensiteterna för den totala producerade 44N2O + 45N2O + 46N2O. Härled kalibreringskurvan för halten 15N från det linjära förhållandet mellan den kända atomen% ( dvs., 15N/14N+15N) och den beräknade atomen% med hjälp av en tidigaretillhandahållenekvation27. Beräkna koncentrationen av 15NH4+ genom att multiplicera den totala NH4+ med 15N-förhållandet av NH4+.
  2. Beräkna den potentiella DNRA-räntan med hjälp av ekvationer somtillhandahålls på andra ställen 28,29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representativa resultat som presenteras i detta dokument härstammar från 15N-tracing experiment av salt kärr sediment. Den provade saltkärret var nyskapat i efterdyningarna av 2011 Great East Japan Jordbävning i Moune området Kesen-numa stad i Miyagi prefektur, Japan. I september 2017 samlades ytsediment (0–3 cm) upp på två platser i deltidal- och intertidalzonerna. Först, omedelbart efter insamlingen, var sedimentet siktas genom en 4-mm maska för att ta bort växtrötter, skal skräp och spillror och sedan homogeniseras. Proverna förvarades vid 4 °C tills DNRA-analysen genomfördes.

Inkubationsprocedurerna för 15NO3− och samtidig bestämning av koncentrationerna 14NH4+ och 15NH4+ genomfördes enligt beskrivningen i protokolldelen. En ökning av koncentrationen 15NH4+ under hela inkubationstiden observerades för alla sediment (Figur 2). Vi beräknade DNRA-satserna genom att dividera ackumulationsgraden på 15NH4+ med isotopförhållandet för NO3− pool29. De beräknade kurserna låg inom intervallet 24,8–177 nmol-N g−1 torr jord h−1 (tabell 3) och var jämförbara med värden som funnits i tidigare studier. Detta intervall av erhållna priser är högre än de rapporterade värdena som härrör från liknande miljöer inklusive de från tidvattenssediment17, salta våtmarker5,16, och andra flodmynningarmiljöer 18,33,34, samt från eutrofa miljöer såsom en grund flodmynning i North Carolina31 och Shanghai urbana flodnät32. Omvänt, Rapporterade Fernandes et al.13 högre potentiella DNRA priser i organiskt rika mangrove jordar i Indien. I allmänhet är DNRA tros gynnas av en hög andel av tillgängliga C till elektron acceptorer35,36,37. De prover som visar de representativa resultaten togs från ett saltkärr som nyligen skapats av en jordbävning, som ursprungligen hade använts som odlingsfält. Denna särskilda egenskap hos proverna kan bidra till den observerade höga DNRA-takten. I överensstämmelse med denna spekulation var DNRA-frekvensen i tidvattenzonen, som är rik på organiska föreningar (data som inte visas) jämfört med subtidalzonen, högre än den i subtidalzonen (figur 2, tabell 3).

Figure 1
Bild 1: Beredning av ett PTFE-kuvert för fångning av gasformiga NH3. DET PTFE-kuvert som används i diffusionsproceduren bereds genom att fäll ptfe-tejpen följer anvisningarna som visas i paneler (A)–(E). Det försurade filtret inuti kuvertet fångar upp det gasformiga NH3. Dessa steg bör genomföras snabbt. Detaljerad information ges i steg 1.2–1.7 i protokollsektionen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Förändring i koncentrationen 15NH4+ via den anaeroba inkuberingen av sediment. Sedimentprovens 15N-spårinkubationer utfördes i två exemplar. Koncentrationen av 15N-NH4+ visas i nmol per torrvikt av sediment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Ett exempel på kalibreringskurva av låg koncentration N2O. Topparea på N2O erhölls genom summan av topparean på m/z 44, m/z 45 och m/z 46. Konfigurationer för GC/MS-analys visas i tabell 2. Var god klicka här för att visa en större version av denna figur.

15 år N-märkta och icke-märkta substrat som tillsätts till varje injektionsflaska
100mM 100mM
NH4Cl K15NEJ3
Volym (μL) på 100 mM stamlösning som tillsätts till varje injektionsflaska 24 60
Slutlig koncentration (μmol/L)* >230§ 570
*visade värden beräknas genom att anta att vattenhalten i sedimentet är 50%
§beroende på bakgrunds ammoniumkoncentrationen

Tabell 1: Kombinationer av substrat som ändrats till injektionsflaska som behåller cirka 11 mL av sedimentupphängningen. Prover utarbetades i två exemplar och underkastades ytterligare analyser efter 1 h, 3 h och 5 h inkubation.

Utrustning
quadrupole GCMS Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra
Kolumn CP-PoraBONDQ 25m; φ 0,32mm; filmtjocklek, 5μm
Analytiska förhållanden
kolumn temp 40 °C
injektion port temp 100 °C
transportör gasström Total flöde, 47,1 mL•min-1
flödeshastighet i kolonn, 2,10 mL•min-1
sprit-förhållande 20
detektion spänning 1,5 kv
Känslighet för N2O
nedre gränsen för detektion (LOD)* 1,42 pmol
nedre gräns för kvantifiering (LOQ)* 4,58 pmol
*LOD och LOQ bestämdes av ett linjärt förhållande bland en serieutspädning på N2O (0,97, 1,94, 2,91, 4,75, 9,50, 14,3 ppm) i He, motsvarande svar i toppområde och S/N-förhållande. LOD och LOQ beräknades som koncentrationer motsvarande S/N=3 respektive S/N=10.

Tabell 2: Villkor för GC/MS-analysen.

Sediment DNRA-kurs anrikning av NO3- *
nmol-N g-1 timme-1 atom%
Intertidal 1 177 99.9
Tidvatten 2 129 99.0
Deltidal 1 39.3 99.9
Deltidal 2 24.8 99.0
*samma som atom% av tillsatta KNO3; fullständig eliminering och ingen nitrifikation under använda inkubationsförhållanden testades tidigare.

Tabell 3: Potentiella DNRA-satser för de testade tidvattens- och subtidala sedimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Koncentrationen och isotopförhållandet av NH4+ för DNRA-analysen kvantifierades med hjälp av flera metoder. Koncentrationerna och isotopkvoterna på NH4+ mäts i allmänhet separat. Koncentrationen NH4+ mäts typiskt med hjälp av koloromiska metoder inklusive en autoanalyzer4,10,15,16,17. Isotopkvotmätningen har stora variationer beroende på dess metod för NH4+ konvertering, svällning, och instrumentering för analysen. Typiska metoder är bland annat följande:

(1) NH4+ i provet konverteras till NH3 via tillägg av MgO eller NaOH. Efter att ha flyttat från vätskefasen till gasfasen fastnar NH3 på ett surt glasfilter eller i en syralösning. Efter torkning förbränns och analyseras filtret som N2 med hjälp av en elementanalysator/isotopförhållande masspektrometer (EA-IRMS)11,18,22,38. Alternativt samlas den infångade NH4+ i en syralösning upp på en adsorbent (t.ex. zeolit) och förbränns och analyseras via EA-IRMS10,12.

(2) NH4+ oxideras till N2 via hypobromitoxidation. Den isotopiska sammansättningen av den utvecklade N2 mäts via IRMS4,14,39 ellermembran-introduktion masspektrometri (MIMS)16,17.

(3) Koncentrationen NH4+ bestäms med hjälp av högpresterande vätskekromatografi utan någon konvertering. Eftersom jämvikten för NH4+ och NH3 är något annorlunda för 15NH4+ och 14NH4+ nära pH av pKa, de 14NH4+ och 15NH4+ koncentrationer kan fastställas baserat på en liten förskjutning i retentionstiden6,19,40.

Den metod som beskrivs i detta papper är i grunden densamma som tillvägagångssätt (1)4som anges3 ovan, dvs.+ emellertid, Det är annorlunda med avseende på följande sekventiella NH4+ omvandling steg. Dessa konverteringssteg baseras på tidigare studier med tillagda modifieringar för att förkorta den tid som krävs för en serie experiment. Först gjorde vi några ändringar i den ursprungliga denitrifiermetoden. Efter biomassan av P. klororafer framställs som tidigare beskrivits23,24, vi odlar bakterier och bevara den koncentrerade cell suspension som ett glycerol lager. Denna täta cellfjädring kan direkt användas för isotopanalysen genom att blanda den med en buffertlösning eftersom den denitrifying-aktiviteten redan har inducerats tillräckligt. Även om det krävs ytterligare undersökningar kan denna modifiering förbättra analysens reproducerbarhet eftersom den presenterade metoden möjliggör massodling av denitrifierceller, som är direkt tillgängliga för analyser. Vi modifierade också lösningens sammansättning för att suspendera bakteriecellerna, från ett medium baserat på TSB till en fosfatbuffrad glukoslösning, för att utesluta de onödiga komponenterna som pepton i det ursprungliga mediet. Denna modifiering kan minska kontamineringen med blank N eftersom den fosfatbuffrade glukoslösningen inte innehåller N, till skillnad från det ursprungliga medium som använts i tidigare studier; detta bör testas via ytterligare analyser. I steget samla NH4+ via diffusion metoden, förkortade vi inkubationstiden och sänkte temperaturen för att minimera nedbrytningen av organiska N och eventuella ogynnsamma omvandling eller förlust av NH4+. Giltigheten av denna modifiering kontrollerades med hjälp av kalibreringskurvans linjäritet. Vi kontrollerade också att den modifierade temperaturen och inkubationstiden inte påverkade återhämtningen av NH4+ (data som inte visas).

En annan fördel med denna metod är att NH4+ slutligen omvandlas till N2O, som har en låg atmosfärisk bakgrund och kan mätas med hjälp av quadrupole GC/MS, som är billigare och lättare att hantera än IRMS. Under det tillstånd som visas i tabell 2 skiljs CO2 (m/z 44) och N2O (m/z 44) helt åt av GC; retentionstiden för dessa gaser är 1,15 respektive 1,07 min. Eftersom atmosfärisk koncentration av N2O är på order av PPB, N2O kan mätas med försumbar luft störningar även i låga koncentrationer. Kalibreringskurvan för N2O passerar nästan genom ursprunget, vilket visar påverkan på koncentrationen av N2O på grund av förorening av atmosfären är mycket begränsad (Figur 3). Denna metod har också fördelen att den kan kvantifiera de 14NH4+ och 15NH4+ koncentrationerna tillsammans; kanoniska metoder, utom tillvägagångssätt (3) som anges ovan, kräver individuella analyser för koncentrationen och isotopförhållandet.

Totalt sett var gränserna för detektion och kvantifiering för NH4+ med denna metod ungefär 0,03 μmol respektive 0,09 μmol, och dessa värden motsvarar 6 μmol/L och 18 μmol/L, om 5 mL av provlösningen (dvs. sedimentextraktet i detta fall) används för diffusionsproceduren enligt beskrivningen i detta dokument. Även om användning av den koloriska metoden rekommenderas för att bestämma NH4+ koncentrationen av prover som har låg NH4+, den föreslagna metoden bestämmer effektivt NH4+ isotopförhållandet och koncentrationen i prover med relativt höga koncentrationer av ammonium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Naoto Tanaka för att ha hjälpt till att datainsamling och utveckla protokollet. Insamlingen av prover stöddes av JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M. Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Tags

Miljövetenskap kvävecykel dissimilatorisk nitratreduktion till ammonium (DNRA) 15N spårämne diffusionssätt persulfatoxidation quadrupole GC/MS saltkärr
Mätning av de Dissimilatory Nitratminskningens potentiella frekvenser till ammonium Baserat <sup>på 14</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup>/<sup>15</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup> Analyser via Sekventiell omvandling till N<sub>2</sub>O
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuroiwa, M., Fukushima, K.,… More

Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter