Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Измерение потенциальных показателей сокращения диссимиляций нитратов до аммония на основе 14NH4и/15NH4- Анализы с помощью последовательного преобразования в N2O

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/59562
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 4, 4, 5, 1
1Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

Summary

Подробно представлен ряд методов определения потенциальной скорости DNRA+ на основе анализа 14NH4+и15NH4. NH4 преобразуется+ в N2O через несколько этапов и анализируется с помощью четырехугольной газовой хроматографии-масс-спектрометрии.

Abstract

Важность понимания судьбы нитратов (NO3),которыеявляются доминирующими видами N, перешел из наземных в водные экосистемы, возрастает, поскольку глобальные нагрузки азота резко возросли после индустриализации. Диссимиляция снижения нитратов до аммония (DNRA) и денитрификации являются микробными процессами, которые используют NO3для дыхания. По сравнению с денитрификацией количественные определения деятельности ДНР были проведены лишь в ограниченных масштабах. Это привело к недостаточному пониманию важности DNRA в No3- преобразования и регулирующие факторы этого процесса. Цель настоящего документа заключается в предоставлении подробной процедуры измерения потенциальной скорости DNRA в экологических пробах. Короче говоря, потенциальная ставка DNRA может быть рассчитана из 15N-маркированы аммония (15NH4)скорость накопления в 15No3- добавил инкубации. Определение концентраций 14NH4 и+ 15NH4, описанных в настоящем документе, состоит из следующих шагов. Во-первых, NH4в образце извлекается и в ловушке на подкисленные стеклянный фильтр, как соль аммония. Во-вторых, захваченный аммоний элализован и окисляется до NO3- через окисление персульфата. В-третьих, NO3преобразуется в N2O с помощью N2O редуктазы недостаточного денитрификации. Наконец, преобразованный N2O анализируется с помощью ранее разработанной четырехугольной газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Мы применили этот метод к соляным болотным отложениям и вычислили их потенциальные показатели DNRA, продемонстрировав, что предлагаемые процедуры позволяют просто и быстрее определить по сравнению с ранее описанными методами.

Introduction

Искусственный синтез азотных удобрений и их широкое применение сильно повлияли на глобальный азотный цикл. Подсчитано, что передача реактивного азота из наземных в прибрежные системы удвоилась с доиндустриальных времен1. Значительная часть удобрений, применяемых к данному полю, смывается из почвы в реки или грунтовые воды, в первую очередь в качестве No3и 2. Это может вызвать экологические проблемы, такие как загрязнение питьевой воды, эвтрофикация, и образование гипоксии. NO3- в водной среде удаляется из экосистемы или сохраняется в ней с помощью биологической ассимиляции и различных микробных диссимилятных процессов. Денитрификация и анаммокс, как известно, основные микробные процессы удаления no3. Денитрификация – это микробное сокращение NO3 до− газоистых продуктов N (NO, N2O и N2)в сочетании с окислением донора электронов, таких как органические вещества, тем самым снижая риск вышеупомянутых проблем. Anammox также производит N2 из NO2и NH4+; таким образом, он удаляет неорганические N из экосистемы. И наоборот, DNRA работает над сохранением N в экосистеме; общепризнано, что DNRA выполняется в первую очередь ферментативными бактериями или хемолитоавтотрофными бактериями и что они уменьшают диссимилятивные NO3- до биодоступных и менее мобильных NH4.

Исследования по DNRA в основном проводились в морских или лиманных экосистемах, таких как океанические или лиманные отложения и вода, соляная или солоноватая болотистая почва и мангровые почвы. Прибрежные или морские экосистемы имеют важное значение вкачестве водохранилищ для удаления− NO 3 - из наземных экосистем, и в предыдущих исследованиях DNRA было показано, что вклад в течение очень широкого диапазона No3− - удаление (0-99%)3,4,5,6,,7,,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 , 18.18 Кроме того, существование DNRA было продемонстрировано в широком диапазоне сред, включаяпресноводные среды 19,рисовыерисовые почвы 20,и лесныепочвы 21. Хотя эти исследования показали, что DNRA потенциально сопоставима с денитрификацией для удаления No3,− исследования, измеряя активность DNRA, по-прежнему очень ограничены по сравнению с теми, которые измеряют денитрификацию.

Скорость DNRA была оценена с использованием 15 методовN-маркировки в сочетании с анализом данных с помощью аналитических или численных моделей. Одно аналитическое решение для расчета ставки DNRA основано на увеличении 15N обогащения NH4 и+ пула после добавления 15NO3в качестве трассировщика. 15 Лет N-маркировка No3 добавляется− в образец и инкубируется, и скорость DNRA может быть рассчитана на основе изменений соотношенияконцентрации и изотопов+ в NH 4 до и после определенного периода времени. В настоящем документе подробно описан методколичественной оценки концентрации+ NH 4 и коэффициента изотопов, которые необходимы для расчета скорости DNRA. В основном, метод сообщил здесь представляет собой сочетание нескольких ранеесообщалось методы 22,23,24,25,26 с изменениями, добавленных к некоторым процедурам. Метод состоит из серии из пяти компонентных процедур: (1) инкубация образца окружающей среды с поправкой на стабильный изотопный трассировщик, 15NO3,(2) извлечение и восстановление NH4 -сиспользованием "процедуры диффузии" с модификациями, (3) окислениецинульфата+ NH 4 в образце, состоящий из коренных NH− − − + 4+ и 15NH4, полученных из 15NO3- через деятельность DNRA, в No3 и 15NO3, (4) последующей микробной трансформации No3 и 1 No3- до N2O изотопомеры с помощью модифицированного метода денитрификатора и (5) количественной оценкиизотопомеровN 2 O с использованием газовой хроматографии-масс-спектрометрии (GC/MS). В следующем разделе, во-первых, описана подготовка к процедурам (2) и (4), а затем, впоследствии, подробно описаны все пять компонентных процедур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка конверта PTFE для количественного захвата газичный NH3

  1. Поместите 60-мм кусок полиэтилена (PTFE) ленты (25 мм в ширину) на небольшой лист алюминиевой фольги (примерно 300 мм х 450 мм в размерах, протертый этанолом).
  2. Пепел фильтр стеклянного волокна (10 мм в диаметре с поры размером 2,7 мкм) при 450 градусов по Цельсию на 4 ч в муфте печи. Поместите фильтр стеклянного волокна немного выше середины более длинной оси ленты(рисунок 1a).
  3. Найме 20 л 0,9-мол/л2SO4 по центру фильтра GF/D и сразу же сложите ленту PTFE с помощью двух пинцетов: плоского пинцета и прямого пинцета. Следующие шаги, шаги 1.4-1.7, показаны на рисунке 1 и должны быть проведены быстро.
  4. Переверните ленту PTFE над фильтром GF/D на пунктирной линии, показанной на рисунке 1a, чтобы сформировать форму, показанную на рисунке 1b.
  5. Печать с обеих сторон, складывая, а затем плотно нажав на край с пинцетом (Рисунок 1c). Не нажимайте слишком сильно, и не царапайте ленту PTFE.
  6. Сложите открытый конец пинцетом, а затем нажмите на край пинцетом(рисунок 1d).
  7. Печать открытого конца, плотно нажав на край с пинцетом (Рисунок 1e). Фильтр GF/D не должен нажиматься во время этой процедуры.

2. Подготовка биомассы закиси азота reductase дефицитный денитрификатор, Pseudomonas хлорорафис subsp. aureofaciens ATCC13985, для метода денитрификатора

  1. Streak 20% глицерол запас Pseudomonas хлорорафис subsp. aureofaciens ATCC13985 на 1/4 прочности триптон соевого бульона (TSB) агар пластин. Инкубировать пластины при 25 градусов по Цельсию в течение 2-3 дней.
  2. Передача колонии синглов P. chlororaphis в небольшую пробирку, содержащую 5 мл автоклавной среды TSB и культуры аэробико (без встряхивания) в течение дня при 25 градусах Цельсия в темноте до получения максимального роста; это будет использоваться в качестве прекультуры.
  3. Передача 3 мл прекультуры в бутылку 1-L с силиконовой резиновой пробкой, содержащей 1 л свежеприготовленного автоклавированного модифицированного TSB, дополненного 10 ммоль/Л KNO323. Инкубировать бутылку во время агитации с помощью мешалки в темных условиях при 25 градусов по Цельсию. После культивирования в течение 8 ч, заменить кремниевую резиновую пробку с винтовой крышкой и плотно закрыть. Продолжить культивирование в аноксии на ночь.
  4. Центрифуга культуры на 18800 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию для получения гранул биомассы.
  5. Вымойте упакованную биомассу три раза с 30 мл фосфатного буферного солевого раствора Дулбекко (D-PBS(-), рН 7.5), чтобы полностью устранить NO3. Условия центрифугации такие же, как и в шаге 2.3.
  6. После мытья, повторно приостановить упакованную биомассу с 30 мл D-PBS (-). Используйте 1 мл подвески для определения плотности клеток путем измерения OD600. Pipette 1 мл aliquots оставшейся подвески в стерильные криовиалы, содержащие 0,8 мл 45% глицерол. Сохраняем подготовленные запасы глицерола при 80 градусах Цельсия до использования (см. раздел 6).

3. Удаление кислорода, нитрита и нитрата из пробных отложений

  1. Взвесить 3,0 г (мокрый вес) осадка в стеклянный флакон 20 мл и добавить 9,0 мл поверхностной воды, чтобы приостановить его (25% ж / в суспензии).
  2. Печать флакона с черной бутиловой резиновой пробкой (промытой ионной водой и стерилизованной с помощью автоклавинга) и алюминиевой крышкой.
  3. Очистить подвеску и заменить головной воздух на Ar (nogt;99.99%) при 0,6 л/мин в течение 20 мин с использованием многообразия.
  4. Замените газ Ar headspace ультра-чистым (99.99995%) Он пылесосить для 90 s и поручать его для 30 s. Повторите эту процедуру четыре раза. Установите давление газа в голову до 1,5 3 м.
  5. Инкубировать флаконы при температуре 20 градусов по Цельсию на ночь с встряхивания при 150 об / мин в темных условиях с помощью постоянной температуры шейкер для устранения оставшихся кислорода, нитратов и нитритов в осадочной подвески и головного газа.

4. Эксперимент курса времени для определения скорости DNRA

  1. Замените головной газ свежим ультра-чистым Он, используя ту же процедуру, что и в шаге 3.5, но без четырех повторений.
  2. Добавьте помеченные и не помеченные субстраты к каждому флакону в соответствии с таблицей 1 через пробку из бутиловой резины с помощью газопритягиваного шприца. Очистить ранее подготовленные субстратные растворы в адекватном размере стеклянных флаконов с использованием ультра-чистый Он с давлением головного пространства установлен на 1,5 атома, чтобы избежать загрязнения воздуха. Избегайте непреднамеренной инъекции любого количества воздуха во время процедур инъекций.
  3. Инкубировать флаконы при 20 градусов по Цельсию со тряской при 150 об/мин. Добавьте субстраты к каждому флакону в соответствии с таблицей 1 и инкубировать в течение 1 ч, 3 ч и 5 ч. После того, как инкубация будет остановлена, подвергню подвеску отложений во флаконах следующим процедурам: шаги 4,4-4,9.
  4. Удалите алюминиевую крышку и бутиловую резиновую пробку с каждого флакона. Затем добавьте KCl (золу при 450 градусов по Цельсию в течение 4 ч) в осадочную суспензию до конечной концентрации примерно 2 мол/л, чтобы обеспечить восстановление NH4 ииз отложений. Закройте флаконы с бутиловой резиновой пробкой и алюминиевым замыканием.
  5. Встряхните осадок при 150 об/мин в течение 1 ч при 4 градусах по Цельсию в темных условиях, чтобы извлечь NH4.
  6. Перенесите всю осадочную суспензию во флаконе на трубу из пластиковой центрифуги 50 мл и центрифугу при 10 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  7. Промыть внутреннюю стенку свежеобнаженного одноразового шприца 10 мл и прикрепить его к свежеобнаженной одноразовой целлюлозно-ацетатной мембранной фильтру (размер поры 0,22 мкм, диаметр 25 мм). Затем промыть мембранный фильтр с 1 мл супернатанта. Поместите промытый шприц-фильтр блок на 20-мл широкоугольный полипропилена (PP) бутылку.
  8. Фильтр оставшихся supernatant через ацетат мембранный фильтр в 20-мл PP бутылку. Храните экстракты на уровне 20 градусов по Цельсию до дальнейшего анализа.

5. Захват рассеянного NH4 в+ 2M H2SO− 4, поглощенный фильтром GF/D в конверте PTFE и окисление персульфата NH4и No3

  1. Подготовь стандартные растворы 14NH4Cl с градиентами концентрации 0 ммоль/л, 10 ммоль/л, 40 ммоль/л, 100 ммоль/л, 200 ммоль/л, 400 ммоль/л и 500 ммоль/л. Для анализа соотношения 15N зафиксировать общую концентрацию NH4+ и 200 ммоль/л и подготовить изотопные соотношения 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 и 10:90 с чистыми 14NH4Cl и 15NH4Cl стандартных решений.
  2. Передача 30 мг MgO (зола при 450 градусов по Цельсию для 4 ч) на 20-мл стеклянный флакон, и поместите конверт PTFE во флакон.
  3. Перенесите 5 мл образца или стандарта во флакон, содержащий конверт MgO и PTFE, и немедленно закройте серой бутиловой резиновой пробкой. Печать с алюминиевой крышкой. Если концентрация NH4,как ожидается, превысит 500 мкмоль/л, разбавьте образец ниже 500 ммоль/л.
  4. Встряхните флаконы при 150 об/мин при 3 ч при 4 градусах цельсия в темных условиях.
  5. Удалите алюминиевую крышку и бутиловую резиновую пробку. Возьмите конверт PTFE из флакона с помощью точечных пинцетов, тщательно промойте конверт и пинцет водой, протрите их вытирая бумагой, а затем поместите конверт на свежую вытирая бумагу.
  6. Откройте конверт PTFE парой пинцетов (рекомендуется использовать пинцет плоского и то же конец) в точном обратном порядке складывания, выполненном шагами 1.4-1.7.
  7. Держите периферийную область фильтра GF/D, где H2SO4 должен быть неабсорбирован, с плоским пинцетом, и перенесите его в пробирку с крышкой из винта 11 мл с крышкой PTFE. Промыть пинцетом с ионные воды, и протрите их вытирая бумагу.
  8. Повторите шаги 5.5-5.7 для остальных конвертов.
  9. Добавьте 1 мл ионные воды в каждую из пробирок, закройте крышку винта и поддерживайте ее, не встряхивая в течение по крайней мере 30 минут при комнатной температуре, чтобы полностьювылмитьNH 4из фильтра GF/D. В ходе этого шага параллельно выполнить следующий шаг (шаг 5.10).
  10. Подготовка персульфатно-окисляющий раствор (POR) реагент25,26.
    1. Поскольку он не может храниться, подготовь точное количество POR, необходимое для лечения одного дня образцов.
    2. Чтобы подготовить POR для лечения 50 образцов, залить 100 мл ионные воды в 200-мл винт крышка бутылку и добавить 1,52 г NaOH (азот соединения анализа класса), 3 г борной кислоты, и 5 г K2S2O8 (азот и фосфор анализа класса) в этом порядке. Сразу после добавления каждого реагента встряхните раствор до полного растворения.
    3. При необходимости замочите бутылку в теплой воде, чтобы помочь растворению химических веществ; однако следует обратить внимание на загрязнение No3, посколькуводопроводная вода обычно содержит NO3.−
  11. После шага 5.8 откройте крышку винта, добавьте 2 мл реагента POR в пробирку и плотно закройте трубку винтовой крышкой, чтобы предотвратить потерю или загрязнение в течение следующих шагов.
  12. Стенд пробирки на стойке, оберните их в двухслойной алюминиевой фольги, и автоклав их в течение 1 ч при 121 градусов по Цельсию. Держите трубки в вертикальном положении во время этого шага и избежать быстрых изменений температуры после окончания автоклавирования.

6. Определение NO3,преобразованного из NH4по методу денитрификатора с использованием quadrupole GC/MS

  1. Смешайте 100 мл стерильного 40-ммоль/л фосфатного буфера (рН 7,2) и 100 мл стерильного 30-ммоль/л глюкозы асептически (20 ммоль/л фосфата и 15-ммоль/л глюкозы; финал).
  2. Добавьте 1/7,2 тома глицерола P. chlororaphis до 200 мл фосфатно-буферного раствора глюкозы в колбе 300 мл Erlenmeyer и очистите ультра-чистым He (99,995%) поток в течение 1 ч.
  3. Раздай 2,0 мл подвески денитрификатора в каждый флакон 5 мл. Крышка флаконы с серой бутиловой резиновой пробкой и алюминиевым замыкания.
  4. Заменить headspace воздуха с ультра-чистый Он пылесосом в течение 3 минут и зарядки Он в течение 1 мин. Установите положительное давление на газ в 1,3 3 м, чтобы избежать непреднамеренного загрязнения воздуха.
  5. Ввимите 1 мл образца или стандарта через бутиловую резиновую пробку с помощью одноразового шприца 1 мл. Обратите внимание на точное количество фактически введенного образца.
  6. Инкубировать флаконы на ночь при 25 градусов по Цельсию в темных условиях.
  7. Ввись 0,3 мл 6-мол/ LL NaOH, чтобы остановить денитрификации и поглощать головное пространство CO2, который в противном случаесерьезно нарушитьN 2 O анализ GC / MS, потому что CO2 и N2O имеют тот же молекулярный вес.
  8. Определите количество 44N2O, 45N2O и 46N2O в головной пространстве газа с помощью quadrupole GC/MS с модифицированным портом впрыска25. Условия эксплуатации, используемые для анализа GC/MS, показаны в таблице 2.

7. Анализ данных

  1. Вывести кривую калибровки для концентрации NH4- из линейной связи между известной концентрацией 14NH4 и+ измеренной интенсивности сигнала в общей сложности произведено 44N2O и 45N2O и 46N2O. Получить кривую калибровки для содержания 15N из линейной взаимосвязи между известным атомом% (т.е. 15N/14Nе 15N) и рассчитанным атомом% с использованием ранее предоставленногоi.e.уравнения 27. Рассчитайте концентрацию 15NH4,+ умножение общего NH4+ на коэффициент 15N NH4.
  2. Рассчитайте потенциальную скорость DNRA, используя уравнения,предоставляемые в другом месте 28,,29,,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативные результаты, представленные в настоящем документе, были получены в результате 15экспериментов по отслеживанию отложений соленого болота. Пробое соляного болота было недавно создано после Великого восточно-японского землетрясения 2011 года в районе Мун города Кесен-Нума в префектуре Мияги, Япония. В сентябре 2017 года поверхностные отложения (0-3 см) были собраны на двух участках в подтявной и межтяговой зонах. Во-первых, сразу после сбора, осадок был просеян через 4-мм сетку для удаления корней растений, обломков снарядов и щебня, а затем гомогенизированы. Образцы хранились при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока не был проведен анализ DNRA.

Процедуры инкубации для 15NO3 и− одновременное определение концентраций 14+ NH4 и 15NH4 были+ проведены, как описано в разделе протокола. Увеличение концентрации 15NH4 втечение инкубационного периода наблюдалось для всех отложений(рисунок 2). Мы рассчитали тарифы DNRA, разделив скорость накопления на 15NH4+ на изотопное соотношение No3и пула 29. Расчетные ставки находились в пределах 24,8-177 нмоль-Н−г и 1 сухаяпочвач No 1 (таблица 3)и были сопоставимы со значениями, найденными в предыдущих исследованиях. Этот диапазон полученных ставок выше, чем зарегистрированные значения, полученные из аналогичныхсред,включая те измежтязных отложений 17,соляныеболота 5,16, идругих лиманных средах 18,33,34, а также из эвтрофических средах, таких как мелководный устье реки вСеверной Каролине 31 и Шанхай городских речныхсетей 32., И наоборот, Фернандес и др.13 сообщили о более высоких потенциальных ставках DNRA в органически богатых мангровых почвах в Индии. В целом, DNRA, как полагают, благоприятствует высокое соотношение имеющихся C к электроннымприеморам 35,36,37. Образцы, демонстрирующие репрезентативные результаты, были взяты из соляного болота, недавно созданного землетрясением, которое первоначально использовалось в качестве поля для выращивания. Эта особая характеристика образцов может способствовать наблюдаемому высокому курсу DNRA. В соответствии с этой спекуляцией, скорость DNRA в межтидальной зоне, которая богата органическими соединениями (данные не показаны) по сравнению с субтидальной зоной, была выше, чем в субтидальной зоне(рисунок 2, таблица 3).

Figure 1
Рисунок 1: Подготовка конверта PTFE для захвата газичный NH3. Конверт PTFE, используемый в процедуре диффузии, готовится путем складывания ленты PTFE в соответствии с инструкциями, показанными впанелях(A ) -(E).( Подкисленый фильтр внутри конверта захватывает газичный NH3. Эти шаги должны быть проведены быстро. Подробная информация приводится шагами 1.2-1.7 в разделе протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Изменение концентрации 15NH4+ с помощью анаэробной инкубации отложений. Инкубации проб отложений 15N были проведены в дубликате. Концентрация 15N-NH4 -показана в nmol на сухой вес осадка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Пример кривой калибровки низкой концентрации N2O. Пиковая площадь N2O была получена по сумме пиковой площади м/з 44, м/з 45 и м/з 46. Конфигурации для анализа GC/MS показаны в таблице 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

15 Лет N-помеченные и не помеченные субстраты, добавленные в каждый флакон
100mM 100mM
NH4Cl K15NO3
Объем (ОЛ) 100 мМ запасов решение добавляется к каждому флакону 24 60
Окончательная концентрация (ммоль/л) 230г. 570
Значения вычисляются исходя из того, что содержание воды в отложениях составляет 50%
в зависимости от концентрации фонового аммония

Таблица 1: Комбинации субстратов с изменены на флаконы, сохраняющие примерно 11 мл подвески отложений. Образцы были подготовлены в дубликате и подвергнуты дальнейшему анализу после 1 ч, 3 ч и 5 ч инкубации.

Оборудование
квадруполь GCMS Шимадзу GCMS-ЗП2010 Ультра
Столбца CP-PoraBOND 25м; φ 0,32 мм; толщина пленки, 5 мкм
Аналитические условия
температура столбца 40 КК
инъекционный порт темп 100 кк
перевозчик газового потока Общая скорость потока, 47,1 мл-1
скорость потока в столбце, 2.10 м/мин-1
соотношение sprit 20
обнаружение напряжения 1,5 кв
Чувствительность N2O
нижний предел обнаружения (LOD) 1.42 pmol
нижний предел количественной оценки (ЛОЗ) 4.58 pmol
«LOD и LO» были определены линейными отношениями между серийным разбавлением N2O (0,97, 1,94, 2,91, 4,75, 9,50, 14,3 промилле) в Он, соответствующие ответы в пиковой области и соотношение S/N. LoD и ЛОЗ были рассчитаны как концентрации, эквивалентные S/N-3 и S/N-10, соответственно.

Таблица 2: Условия для анализа GC/MS.

Осадка Курс ДНР обогащение No3-
нмоль-Нг -1 час-1 атом%
Интертидал 1 177 99.9
Интертидаль 2 129 99.0
Субтидаль 1 39.3 99.9
Субтидаль 2 24.8 99.0
Так же, как атом% добавленного KNO3; полная ликвидация и отсутствие нитрификации в условиях использованной инкубации было протестировано ранее.

Таблица 3: Потенциальные показатели DNRA проверенных межтидальных и субтидальных отложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Соотношение концентрации и изотопов NH4 дляанализа DNRA было количественно оценено с помощью нескольких методов. Коэффициенты концентраций и изотопов NH4,как правило, измеряются отдельно. Концентрация NH4 ,как правило, измеряется с помощью колоритных методов, включая автоаналийзер4,,10,,15,,16,,17. Измерение соотношения изотопов имеет широкие вариации в зависимости от метода преобразования NH4,+ захвата и приборов для анализа. Типичные методы включают в себя следующее:

(1) NH4в образце преобразуется в NH3 через добавление MgO или NaOH. После перехода от жидкой фазы к газовой фазе, NH3 оказался в ловушке на подкисленные стеклянный фильтр или в кислотном растворе. После высыхания фильтр сгорает и анализируется как N2 с помощью элементарного анализатора/изотопного соотношения масс-спектрометра (EA-IRMS)11,,18,,22,,38. Кроме того, захваченный NH4 вкислотном растворе собирается на адсорбенте (например, цеолит) и сгорая и анализируется через EA-IRMS10,12.

(2) NH4окисляется до N2 с помощью окисления гипобромита. Изотопный состав эволюционировалого N2 измеряется с помощью IRMS4,,14,,39 или мембранно-интродукционной масс-спектрометрии (MIMS)16,,17.

(3) Концентрация NH4 определяетсяс помощью высокой производительности жидкой хроматографии без какого-либо преобразования. Потому что равновесие NH4 и+ NH3 немного отличается для 15NH4+ и 14NH4 -+ вблизи рН pKa, 14NH4 и+ 15NH4 -+ концентрации могут быть определены на основе небольшого сдвигаво времени удержания 6,19,40.

Метод, описанный в настоящем документе, в основном такой же, как и подход (1), перечисленный выше, т.е. шаг восстановления NH4 ,+ как NH3 на стеклянном фильтре в щелочных условиях; однако, это отличается по отношению к следующим последовательным шагам преобразования NH4.+ Эти шаги преобразования основаны на предыдущих исследованиях с дополнительными изменениями, чтобы сократить необходимое время для серии экспериментов. Во-первых, мы внесли несколько изменений в оригинальный метод денитрификатора. После того, как биомасса P. chlororaphis готовится, как описано ранее 23,24, мы выращиваем бактерии и сохранить концентрированную подвеску клеток в качестве запасов глицерола. Эта плотная клеточная подвеска может быть непосредственно использована для анализа изотопов, смешивая ее с буферным раствором, потому что денитрификационая активность уже достаточно индуцирована. Несмотря на то, что требуется дальнейшее исследование, эта модификация может улучшить воспроизводимость анализа, поскольку представленный метод позволяет массово выращивать клетки денитрификации, которые непосредственно доступны для анализа. Мы также изменили состав раствора для приостановки бактериальных клеток, от среды на основе TSB до фосфатно-буферного раствора глюкозы, чтобы исключить ненужные компоненты, такие как пептон в исходной среде. Эта модификация может уменьшить загрязнение пустым N, потому что фосфат-буферный раствор глюкозы не содержит N, в отличие от первоначальной среды, используемой в предыдущих исследованиях; это должно быть проверено с помощью дальнейших анализов. В шаге сбора NH4 -с помощью метода диффузии, мы сократили инкубационный период и понизили температуру, чтобы свести к минимуму распад органических N и любой неблагоприятной преобразования или потери NH4. Достоверность этой модификации была проверена с использованием линейности кривой калибровки. Мы также проверили, что измененный период температуры и инкубации не повлиял на восстановление NH4(данные не показаны).

Еще одним преимуществом этого метода является то, что NH4 вконечном счете преобразуется в N2O, который имеет низкий атмосферный фон и может быть измерен с помощью четырехугольного GC/MS, который является менее дорогим и более легким в управлении, чем IRMS. При условии, показанной в таблице 2, CO2 (m/z 44) и N2O (m/z 44) полностью разделены ГК; время хранения этих газов составляет 1,15 и 1,07 мин, соответственно. Поскольку концентрация N2O в атмосфере находится на порядке ppb, N2O может быть измерена с незначительными помехами воздуха даже в низких концентрациях. Кривая калибровки N2O проходит почти через происхождение, демонстрируя влияние на концентрацию N2O из-за загрязнения атмосферы очень ограничено(рисунок 3). Этот метод также имеет то преимущество, что он может количественно 14NH4 и+ 15NH4- концентрации вместе; канонические методы, за исключением подхода (3), перечисленного выше, требуют индивидуального анализа концентрации и соотношения изотопов.

В целом, пределы обнаружения и количественной оценки NH4 ,используя этот метод, были приблизительно 0,03 ммоль и 0,09 ммоль, соответственно, и эти значения эквивалентны 6 ммоль/л и 18 ммоль/л, если 5 мл выборочного раствора (т.е. экстракт осадочных пород в данном случае) используется для процедуры диффузии, как описано в настоящем документе. Несмотря на то, что с помощью колоритного метода рекомендуется определить NH+ 4- концентрацию образцов с низким содержанием NH4,+предлагаемый метод эффективно определяет соотношение изотопов NH4 иконцентрацию в образцах с относительно высокими концентрациями аммония.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Наото Танака за помощь в сборе данных и разработке протокола. Сбор образцов был поддержан JSPS KAKENHI Грант номер 17K15286.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M. Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Tags

Экологические науки выпуск 164 цикл азота сокращение диссимиляции нитратов до аммония (DNRA) 15N трассировщик метод диффузии окисление персульфата четырехугольный GC/MS соляное болото
Измерение потенциальных показателей сокращения диссимиляций нитратов до аммония на <sup>основе 14</sup>NH<sub>4</sub><sup>и</sup>/<sup>15</sup>NH<sub>4</sub><sup>-</sup> Анализы с помощью последовательного преобразования в N<sub>2</sub>O
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuroiwa, M., Fukushima, K.,… More

Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter