Summary
14 एनएच 4+/15एनएच4+विश्लेषणों के4आधार पर संभावित DNRA दर का निर्धारण करने के लिए कई तरीकों का विस्तार से प्रावधान किया गया है ।15 एनएच4+ को कई चरणों के माध्यम से एन2ओ में परिवर्तित किया जाता है और क्वाड्रपोल गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है।
Abstract
नाइट्रेट (एन3−)के भाग्य को समझने का महत्व, जो स्थलीय से जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में स्थानांतरित प्रमुख एन प्रजातियां हैं, बढ़ रही हैं क्योंकि औद्योगिकीकरण के बाद वैश्विक नाइट्रोजन भार में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई है । अमोनियम (डीएनआरए) और डेनिट्रिफिकेशन में विघटन नाइट्रेट कमी दोनों माइक्रोबियल प्रक्रियाएं हैं जो श्वसन के लिए एनओ3− का उपयोग करती हैं। डेनिट्रिफिकेशन की तुलना में, DNRA गतिविधि के मात्रात्मक निर्धारण केवल एक सीमित सीमा तक किए गए हैं। इसके कारण एनई3− परिवर्तनों में डीएनआरए के महत्व और इस प्रक्रिया के विनियमन कारकों की अपर्याप्त समझ हुई है। इस पत्र का उद्देश्य पर्यावरणीय नमूनों में संभावित DNRA दर की माप के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करना है। संक्षेप में, संभावित DNRA दर की गणना 15 एन-लेबल अमोनियम (15एनएच4+)संचय दर से15नंबर3− जोड़ा इनक्यूबेशन में की जा सकती है। 15 इस पत्र में वर्णित 14एनएच4++ और 15एनएच4+ सांद्रता का निर्धारण निम्नलिखित चरणों में शामिल है। सबसे पहले, नमूने में एनएच4++ निकाला जाता है और अमोनियम नमक के रूप में एक अम्लीय ग्लास फिल्टर पर फंस जाता है। दूसरा, फंसे हुए अमोनियम को नातान ऑक्सीकरण के माध्यम से NO 3− पर ऑक्सीकरण कियाजाताहै। तीसरा, एन3− एन2ओ के माध्यम से एन2ओ में परिवर्तित हो जाता है। अंत में, परिवर्तित एन2ओ का विश्लेषण पहले से विकसित क्वाड्रपोल गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके किया जाता है। हम नमक मार्श तलछट के लिए इस विधि लागू किया और उनके संभावित DNRA दरों की गणना, प्रदर्शन है कि प्रस्तावित प्रक्रियाओं पहले वर्णित तरीकों की तुलना में एक सरल और अधिक तेजी से दृढ़ संकल्प की अनुमति देते हैं ।
Introduction
नाइट्रोजन उर्वरक के कृत्रिम संश्लेषण और इसके व्यापक अनुप्रयोग ने वैश्विक नाइट्रोजन चक्र को बहुत परेशान किया है। यह अनुमान लगाया गया है कि पूर्व औद्योगिक समय1के बाद से प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन का स्थलीय से तटीय प्रणालियों में अंतरण दोगुना हो गया है । किसी दिए गए खेत पर लागू उर्वरकों का एक महत्वपूर्ण हिस्सा मिट्टी से नदियों या भूजल में बह जाता है, मुख्य रूप से NO3− 2के रूप में । इससे पेयजल प्रदूषण, यूट्रोफिकेशन और हाइपोक्सिया बनने जैसी पर्यावरणीय समस्याएं हो सकती हैं। पानी के वातावरण में एन3− जैविक आत्मसात और विभिन्न माइक्रोबियल विघटनकारी प्रक्रियाओं के माध्यम से पारिस्थितिकी तंत्र में हटा या बनाए रखा जाता है। डेनिट्रिफिकेशन और एनामॉक्स को एन 3−के लिए प्रमुख माइक्रोबियल हटाने की प्रक्रिया के रूप में जानाजाताहै । डेनिट्रिफिकेशन जीओ3− गैसीय एन उत्पादों (एन, एन 2 ओ और एन2)की माइक्रोबियल कमी है, जो कार्बनिक पदार्थ जैसे इलेक्ट्रॉन दाता के ऑक्सीकरण के साथ मिलकर होती है, जिससे उपरोक्त समस्याओं का खतरा कम हो जाता है ।2 एनामॉक्स भी एन2 − और एनएच4− +से एन2का उत्पादन करता है ; इसलिए, यह एक पारिस्थितिकी तंत्र से अकार्बनिक एन को हटा देता है। इसके विपरीत, DNRA एक पारिस्थितिकी तंत्र में एन बनाए रखने के लिए काम करता है; आम तौर पर यह स्वीकार किया जाता है कि डीएनआरए मुख्य रूप से किण्वित बैक्टीरिया या केमोलिथोटोट्रोफिक बैक्टीरिया द्वारा किया जाता है और वे असंतुलन संख्या3− को जैव उपलब्ध और कम मोबाइल एनएच4+में कम करते हैं ।
DNRA पर अध्ययन मुख्य रूप से समुद्री या मुहाना पारिस्थितिकी प्रणालियों में किया गया है, जैसे महासागरीय या मुहाना तलछट और पानी, नमक या खारा मार्श मिट्टी, और सदाबहार मिट्टी । स्थलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों से कोई3− हटाने के लिए जलाशयों के रूप में तटीय या समुद्री पारिस्थितिक तंत्र महत्वपूर्ण हैं, और पिछले अध्ययनों में DNRA को NO 3− निष्कासन,,(0-99%) 3,4,,5,6,,,7,,8,9,10,,,11, 12,,,,713,1014,,15,1516,17,,18की एक बहुत विस्तृत श्रृंखला में योगदान करनेकेलिए दिखाया गया है ।, इसके अलावा, DNRA के अस्तित्व को मीठे पानी के वातावरण19,चावल धान की मिट्टी20और वन मिट्टी21सहित विभिन्न वातावरणों में प्रदर्शित किया गया है । हालांकि इन अध्ययनों से पता चला है कि DNRA संभावित रूप से NO3− हटाने के लिए denitrification के बराबर है, DNRA गतिविधि को मापने वाले अध्ययन अभी भी बहुत सीमित हैं, जो डेनिट्रिफिकेशन को मापने वालों की तुलना में बहुत सीमित हैं।
डीएनआरए दर विश्लेषणात्मक या संख्यात्मक मॉडल के माध्यम से डेटा विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में 15एन लेबलिंग तकनीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया है । डीएनआरए दर की गणना करने के लिए एक विश्लेषणात्मक समाधान एक ट्रेसर के रूप में 15नंबर3− के अलावा एनएच4+ पूल के 15एन संवर्धन में वृद्धि पर आधारित है। 15 एन-लेबल एन3− को एक नमूने में जोड़ा जाता है और इनक्यूबेटेड किया जाता है, और डीएनआरए दर की गणना एनएच4+ में एकाग्रता और आइसोटोप अनुपात परिवर्तन से पहले और एक निश्चित अवधि के बाद की जा सकती है। इस पेपर में एनएच4++ एकाग्रता और आइसोटोप अनुपात को निर्धारित करने की एक विधि, जो DNRA दर की गणना करने के लिए आवश्यक है, विस्तार से वर्णित है। असल में, यहां रिपोर्ट की गई विधि कुछ प्रक्रियाओं में जोड़े गए संशोधनों के साथ कई पहले से रिपोर्ट की गईतकनीकों,22, 23, 24, 25, 26 का संयोजन है।23,24,25, विधि में पांच घटक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला शामिल है: (1) एक स्थिर आइसोटोप ट्रेसर के संशोधन के साथ एक पर्यावरणीय नमूने की इनक्यूबेशन, 15नहीं3−( 2) निष्कर्षण और एनएच4+ की वसूली संशोधनों के साथ एक "प्रसार प्रक्रिया" का उपयोग कर, (3) नमूने में एनएच4+ के अनुनाद ऑक्सीकरण, जिसमें स्वदेशी एनएच4+ और 15एनएच4+ से डीएनआरए गतिविधि के माध्यम से 15नंबर3− से प्राप्त, NO 3− और 15NO3− (4) के बाद में माइक्रोबियल परिवर्तन NO 3 − और10− संशोधित डिनिट्राइफायर विधि के माध्यम से एन 2 ओ आइसोटोपोमर्स3को 15नंबर23− और गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी/एमएस) का उपयोग करके एन2ओ आइसोटोपोमर्स का (5) मात्राकरण। निम्नलिखित अनुभाग में, सबसे पहले, प्रक्रियाओं (2) और (4) के लिए तैयारी का वर्णन किया गया है और फिर, बाद में, सभी पांच घटक प्रक्रियाओं का विस्तार से वर्णन किया गया है।
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Protocol
1. मात्रात्मक रूप से गैसीय एनएच3 पर कब्जा करने के लिए एक पीएफई लिफाफा तैयार करना
- एल्यूमीनियम पन्नी की एक छोटी शीट (आकार में लगभग 300 मिमी x 450 मिमी, इथेनॉल के साथ मिटा दिया) पर पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) टेप (चौड़ाई में 25 मिमी) का 60-मिमी टुकड़ा रखें।
- एक ग्लास फाइबर फिल्टर (2.7 माइक्रोन के पोर आकार के साथ व्यास में 10 मिमी) मफल भट्टी में 4 घंटे के लिए 450 डिग्री सेल्सियस पर राख करें। ग्लास फाइबर फ़िल्टर को टेप की लंबी धुरी(चित्रा 1a)के मध्य बिंदु से थोड़ा ऊपर रखें।
- एक GF/D फिल्टर के केंद्र पर 0.9-मोल/एल एच 2 एसओ4 के20माइक्रोन स्पॉट, और तुरंत दो चिमटी का उपयोग कर PTFE टेप गुना: फ्लैट समाप्त स्टांप चिमटी और सीधे समाप्त चिमटी । निम्नलिखित चरण, चरण 1.4-1.7, चित्र 1 में दिखाए गए हैं और तेजी से आयोजित किए जाने चाहिए।
- चित्रा 1बीमें दिखाए गए आकार को बनाने के लिए चित्रा 1ए में दिखाए गए बिंदीदार लाइन पर GF/D फिल्टर पर पीटीएफई टेप फ्लिप करें ।
- तह द्वारा दोनों पक्षों को सील और फिर चिमटी(चित्रा 1c)के साथ किनारे कसकर दबाने । बहुत मुश्किल प्रेस मत करो, और PTFE टेप खरोंच नहीं है ।
- चिमटी के साथ खुले छोर को मोड़ें, और फिर चिमटी(चित्रा 1d)के साथ किनारे दबाएं।
- चिमटी(चित्रा 1e)के साथ किनारे को कसकर दबाकर खुले छोर को सील करें। इस प्रक्रिया के दौरान जीएफ/डी फिल्टर नहीं दबाया जाना चाहिए।
2. नाइट्रस ऑक्साइड के बायोमास को तैयार करना कमी वाले डेनिट्रिफायर, स्यूडोमोनास क्लोरैफिस सबएसपी के बायोमास तैयार करना। औरोफासियंस एटीसीसी13985, डेनिट्रिफायर विधि के लिए
- स्ट्रीक 1/4 स्ट्रेंथ ट्राइप्टोन सोया शोरबा (टीएसबी) आगर प्लेटों पर स्यूडोमोनास क्लोरैफिस सबएसपी का 20% ग्लिसरोल स्टॉक। प्लेटों को 2-3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- पी क्लोरोफिस के एक एकल उपनिवेश को एक छोटे से टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल ऑटोक्लेव टीएसबी माध्यम और संस्कृति एरोबिकली (बिना मिलाने के बिना) एक दिन के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम वृद्धि प्राप्त करने तक; यह प्रीकल्चर के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।
- प्रीकल्चर के 3 एमएल को सिलिकॉन रबर डाट के साथ 1-एल बोतल में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एल हौसले से तैयार ऑटोक्लेव संशोधित टीएसबी 10 mmol/L KNO323के साथ पूरक है । 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे परिस्थितियों में एक उभारने वाला का उपयोग करते हुए बोतल को इनक्यूबेट करें। 8 घंटे के लिए खेती करने के बाद, सिलिकॉन रबर डाट को स्क्रू कैप से बदलें और कसकर बंद करें। रात भर एनोक्सिया में खेती जारी रखें।
- बायोमास छर्रों को प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 18,800 x ग्राम पर संस्कृति को सेंट्रलाइज करें।
- 3−को पूरी तरह से खत्म करने के लिए दुलबेक्को के फॉस्फेट-बफर खारा (डी-पीबीएस (-), पीएच 7.5 के30एमएल के साथ पैक किए गए बायोमास को तीन बार धोएं । अपकेंद्रित्र की स्थिति चरण 2.3 के समान है।
- धोने के बाद, डी-पीबीएस (-) के 30 एमएल के साथ पैक किए गए बायोमास को फिर से निलंबित करें। आयुध डिपो600को मापकर कोशिका घनत्व निर्धारित करने के लिए निलंबन के 1 एमएल का उपयोग करें । 45% ग्लाइसरोल के 0.8 एमएल वाले बाँझ क्रायोवियल्स में शेष निलंबन के पिपेट 1 एमएल एलिकोट्स। उपयोग होने तक तैयार ग्लिसरोल स्टॉक को −80 डिग्री सेल्सियस पर सुरक्षित रखें (धारा 6 देखें)।
3. नमूने तलछट से ऑक्सीजन, नाइट्राइट और नाइट्रेट का उन्मूलन
- तलछट के 3.0 ग्राम (गीला वजन) को 20 एमएल ग्लास शीशी में तौलें और इसे निलंबित करने के लिए 9.0 एमएल सतही पानी जोड़ें (25% w/w घोल)।
- एक काले ब्यूटिल रबर डाट के साथ शीशी सील (आयन के साथ धोया-पानी का आदान प्रदान किया और ऑटोक्लेविंग के माध्यम से निष्फल) और एक एल्यूमीनियम टोपी ।
- निलंबन शुद्ध और एआर के साथ हेडस्पेस हवा की जगह (>99.99%) 0.6 एल/मिनट पर 20 मिनट के लिए एक कई गुना का उपयोग कर ।
- एआर हेडस्पेस गैस को अल्ट्रा-प्योर (>99.99995%) वह 90 एस के लिए वैक्यूमिंग और 30 एस के लिए वह चार्ज करके। इस प्रक्रिया को चार बार दोहराएं। 1.5 एटीएम में हेडस्पेस गैस प्रेशर सेट करें।
- तलछट निलंबन और हेडस्पेस गैस में शेष ऑक्सीजन, नाइट्रेट और नाइट्राइट को खत्म करने के लिए निरंतर तापमान शेखर का उपयोग करके अंधेरे परिस्थितियों में 150 आरपीएम पर मिलाते हुए रात भर 20 डिग्री सेल्सियस पर शीशियों को इनक्यूबेट करें।
4. DNRA दर का निर्धारण करने के लिए समय पाठ्यक्रम प्रयोग
- हेडस्पेस गैस को ताजा अल्ट्रा-प्योर के साथ बदलें वह चरण 3.5 के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर रहा है लेकिन चार पुनरावृत्ति के बिना।
- गैसटाइट सिरिंज का उपयोग करके ब्यूटिल रबर डाट के माध्यम से टेबल 1 के अनुसार प्रत्येक शीशी में लेबल और गैर-लेबल किए गए सब्सट्रेट्स जोड़ें। हवा के संदूषण से बचने के लिए हेडस्पेस सेट के दबाव के साथ अल्ट्रा-प्योर वह का उपयोग करके पर्याप्त आकार के ग्लास शीशियों में पहले से तैयार सब्सट्रेट समाधानों को शुद्ध करें। इंजेक्शन प्रक्रियाओं के दौरान हवा की किसी भी मात्रा के गैर इरादतन इंजेक्शन से बचें।
- 150 आरपीएम पर मिलाते हुए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट शीशियां। तालिका 1 के अनुसार प्रत्येक शीशी में सब्सट्रेट्स जोड़ें और 1 घंटे, 3 घंटे और 5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन रोके जाने के बाद, शीशियों में तलछट निलंबन को निम्नलिखित प्रक्रियाओं के अधीन करें: चरण 4.4-4.9।
- प्रत्येक शीशी से एल्यूमीनियम टोपी और ब्यूटिल रबर डाट निकालें। फिर, तलछट से एनएच 4+ की वसूली सुनिश्चित करने के लिए लगभग 2 मोल/एल की अंतिम एकाग्रता तक तलछट निलंबन के लिए केसीएल(4घंटे के लिए 450 डिग्री सेल्सियस पर ashed) जोड़ें। एक ब्यूटिल रबर डाट और एक एल्यूमीनियम बंद करने के साथ शीशियों को बंद करें।
- एनएच 4 + निकालने के लिए अंधेरे परिस्थितियों में 4 डिग्री4सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 150 आरपीएम पर तलछटहिलाएं।
- शीशी में पूरे तलछट निलंबन को 50 एमएल प्लास्टिक सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
- एक हौसले से खोला 10-एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज की आंतरिक दीवार कुल्ला, और यह एक हौसले से खोला डिस्पोजेबल सेल्यूलोज एसीटेट झिल्ली फिल्टर (ताकना आकार 0.22 माइक्रोन, व्यास में 25 मिमी) से देते हैं। फिर, सुपरनैंट के 1 एमएल के साथ झिल्ली फिल्टर कुल्ला। कुल्ला सिरिंज-फिल्टर यूनिट को 20-एमएल चौड़े मुंह वाली पॉलीप्रोपाइलीन (पीपी) बोतल पर रखें।
- 20-एमएल पीपी बोतल में एक एसीटेट झिल्ली फिल्टर के माध्यम से शेष सुपरनेट को फ़िल्टर करें। अर्क अर्क को आगे के विश्लेषण तक −20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
5. 2एम एच 2एसओ 4में डिफ्यूज एनएच4+ कैप्चरिंग पीटीएफई लिफाफे में जीएफ/डी फिल्टर में अवशोषित और एनएच 4+ के अनुनाद ऑक्सीकरण को नंबर33−
- 0 माइक्रोमोल/एल, 10माइक्रोमोल/एल, ४० माइक्रोमोल/एल, १०० माइक्रोमोल/एल, २०० माइक्रोमोल/एल, ४०० माइक्रोमोल/एल, और ५०० माइक्रोमोल/एल की एकाग्रता ढाल के साथ 14एनएच4 सीएल के मानक समाधान तैयार करें । 15एन अनुपात विश्लेषण के लिए, एनएच4+ की कुल एकाग्रता को 200 माइक्रोमोल/एल तक ठीक करें और 100:0 के आइसोटोप अनुपात तैयार करें, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50, और शुद्ध 14एनएच4सीएल और 15 एनएच4सीएल मानक समाधान के साथ 10:90। 15
- 30 मिलीग्राम एमजीओ (4 घंटे के लिए 450 डिग्री सेल्सियस पर राख) को 20-एमएल ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें, और पीएफई लिफाफे को शीशी में रखें।
- एमजीओ और पीएफई लिफाफे वाली शीशी में एक नमूना या मानक के 5 एमएल स्थानांतरित करें, और तुरंत ग्रे ब्यूटिल रबर डाट के साथ बंद करें। एक एल्यूमीनियम टोपी के साथ सील। यदि एनएच4++ की सांद्रता 500 माइक्रोमोल/एल से अधिक होने की संभावना है, तो नमूने को 500 माइक्रोमोल/एल से नीचे तक पतला करें।
- अंधेरे परिस्थितियों में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए 150 आरपीएम पर शीशियों को हिलाएं।
- एल्यूमीनियम कैप और ब्यूटिल रबर डाट निकालें। बिंदु-समाप्त चिमटी का उपयोग करके शीशी से पीटीएफई लिफाफा लें, लिफाफे और चिमटी को आयन-एक्सचेंज किए गए पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें, उन्हें पोंछते हुए कागज से पोंछें, और फिर लिफाफे को एक ताजा पोंछते हुए कागज पर रखें।
- 1.4-1.7 चरणों में किए गए तह के सटीक रिवर्स क्रम में चिमटी (फ्लैट-एंडेड और पॉइंट-एंडेड चिमटी दोनों का उपयोग) के साथ पीटीएफई लिफाफा खोलें।
- GF/D फिल्टर के परिधीय क्षेत्र पकड़ो, जहां एच2एसओ 4 को फ्लैट-एंडेड चिमटी के साथ, अशोभनीय मानाजाता है, और इसे पीटीएफई-लाइन वाली टोपी के साथ 11-एमएल स्क्रू कैप टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें। आयन-आदान-प्रदान पानी के साथ चिमटी कुल्ला, और उन्हें पोंछते कागज के साथ पोंछ।
- शेष लिफाफों के लिए 5.5-5.7 चरण दोहराएं।
- प्रत्येक टेस्ट ट्यूब में आयन-एक्सचेंज किए गए पानी का 1 एमएल जोड़ें, स्क्रू कैप को बंद करें, और इसे जीएफ/डी फिल्टर से एनएच 4+ को पूरी तरह से elute करने के लिए कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए मिलातेहुएबिना बनाए रखें। इस चरण के दौरान, समानांतर रूप से निम्नलिखित चरण (चरण 5.10) को पूरा करें।
- 25, 26,,26अनुनाद-ऑक्सीकरण समाधान (पीओआर) रिएजेंट तैयार करें।
- क्योंकि इसे संग्रहीत नहीं किया जा सकता है, नमूनों के एक दिन के इलाज के लिए आवश्यक पीओआर की सटीक मात्रा तैयार करें।
- 50 नमूनों के इलाज के लिए पीओआर तैयार करने के लिए, 200-एमएल स्क्रू कैप बोतल में आयन-एक्सचेंज किए गए पानी के 100 एमएल डालें और 1.52 ग्राम नाओएच (नाइट्रोजन यौगिक विश्लेषण ग्रेड), 3 ग्राम बोरिक एसिड, और 5 ग्राम के2एस2ओ8 (नाइट्रोजन और फास्फोरस विश्लेषण ग्रेड) को जोड़ें। प्रत्येक अभिवाक को जोड़ने के तुरंत बाद, समाधान को हिलाएं जब तक कि यह पूरी तरह से भंग न हो जाए।
- यदि आवश्यक हो, तो रसायनों के विघटन में मदद करने के लिए बोतल को गर्म पानी में भिगो दें; हालांकि, NO3के प्रदूषण के संबंध में ध्यान दिया जाना चाहिए− क्योंकि नल के पानी में सामान्य रूप से NO3−होता है ।
- चरण 5.8 के बाद, स्क्रू कैप खोलें, पॉर्स रिएजेंट के 2 एमएल को टेस्ट ट्यूब में जोड़ें, और निम्नलिखित चरणों के दौरान किसी भी नुकसान या प्रदूषण को रोकने के लिए ट्यूब को स्क्रू कैप के साथ कसकर बंद करें।
- एक रैक पर परीक्षण ट्यूब खड़े हो जाओ, उन्हें डबल स्तरित एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें, और उन्हें 121 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ऑटोक्लेव। इस स्टेप के दौरान ट्यूब्स को एक ईमानदार स्थिति में रखें और ऑटोक्लेविंग खत्म करने के बाद तापमान में तेजी से बदलाव से बचें।
6. क्वाड्रपोल जीसी/एमएस का उपयोग करके डीनिरिफियर विधि द्वारा एनएच4+ से परिवर्तित नंबर3− का निर्धारण करना
- बाँझ ४०-mmol/L फॉस्फेट बफर (पीएच ७.२) और बाँझ 30 के १०० मिलीएल के १०० मिलीएल मिश्रण 30-mmol/L ग्लूकोज aseptically (20-mmol/L फॉस्फेट और 15-mmol/L ग्लूकोज; अंतिम) ।
- 300-एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में फॉस्फेट-बफर ग्लूकोज सॉल्यूशन के 200 एमएल में पी क्लोरैफिस के ग्लिसरोल स्टॉक की 1/7.2 मात्रा जोड़ें, और अल्ट्रा-प्योर वह (>99.995%) 1 घंटे के लिए स्ट्रीम करें।
- प्रत्येक 5-एमएल शीशी में 2.0 एमएल डिनिरिफायर सस्पेंशन बांटें। एक ग्रे ब्यूटिल रबर डाट और एक एल्यूमीनियम बंद करने के साथ शीशियों टोपी ।
- हेडस्पेस हवा को अल्ट्रा-प्योर के साथ बदलें वह 3 मिनट के लिए वैक्यूमिंग करके और 1 मिनट के लिए उसे चार्ज करके। गैर इरादतन हवा संदूषण से बचने के लिए 1.3 एटीएम पर हेडस्पेस गैस सकारात्मक दबाव निर्धारित करें।
- 1-एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग करके ब्यूटिल रबर डाट के माध्यम से एक नमूना या मानक के 1 एमएल इंजेक्ट करें। वास्तव में इंजेक्शन किए गए नमूने की सही मात्रा पर ध्यान दें।
- अंधेरे परिस्थितियों में 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर शीशियों को इनक्यूबेट करें।
- 6 के 0.3 एमएल इंजेक्ट-मोल/एलएल NaOH denitrification को रोकने के लिए और हेडस्पेस सीओ2को अवशोषित2 करने के2लिए, जो अंयथा गंभीरता से जीसी द्वारा एन2ओ विश्लेषण परेशान/
- एक संशोधित इंजेक्शन पोर्ट25के साथ क्वाड्रपोल जीसी/एमएस का उपयोग करके हेडस्पेस गैस में ४४ एन 2ओ,४५एन2ओ और ४६एन 2 ओ की मात्रा निर्धारित करें । 44 45 जीसी/एमएस विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली ऑपरेटिंग स्थितियां तालिका 2में दिखाई गई हैं ।
7. डेटा विश्लेषण
- 14 एनएच 4 + की ज्ञात एकाग्रता और कुल उत्पादित44एन 2 ओ+ 45 एन 2 ओ2+ . 46 14एन2ओ2के मापा संकेत तीव्रता के बीच रैखिक संबंधों से एनएच 4+ एकाग्रता के लिए अंशांकन वक्र प्राप्त करें। ज्ञात परमाणु%2 (यानी , 15एन/ 14 एन + 15 एन) और गणना परमाणु% के बीच रैखिक संबंध से 46i.e15एन सामग्री के लिए अंशांकन वक्र प्राप्त करें27। 1514 कुल एनएच 4+ को एनएच4+ के 15एन अनुपात से गुणा करके15एनएच 44+की एकाग्रता की गणना करें .
- 28 , 29,29,30अन्य जगहों पर दिए गए समीकरणों का उपयोग करके संभावित DNRA दर की गणना करें ।
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Representative Results
इस पत्र में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम नमक मार्श तलछट के 15एन-ट्रेसिंग प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे । नमूना नमक मार्श २०११ ग्रेट ईस्ट जापान भूकंप के बाद मियागी प्रांत, जापान में केसेन-Numa शहर के Moune क्षेत्र में बनाया गया था । सितंबर 2017 में, उप-नीचे और इंटरटीडल जोन में दो स्थलों पर सतह तलछट (0-3 सेमी) एकत्र किए गए थे। सबसे पहले, संग्रह के तुरंत बाद, तलछट को पौधों की जड़ों, गोले मलबे और मलबे को हटाने के लिए 4-मिमी जाल के माध्यम से छलनी किया गया था और फिर समरूप। डीएनआरए विश्लेषण किए जाने तक नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया था।
15नंबर3− के लिए इनक्यूबेशन प्रक्रियाएं और प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित 14एनएच4+ और 15एनएच4+ सांद्रता के एक साथ दृढ़ संकल्प किए गए थे। इनक्यूबेशन अवधि में 15एनएच4+ एकाग्रता में वृद्धि सभी तलछट(चित्र 2)के लिए देखी गई । हमने 15एनएच 4+ की संचय दर को एन3− पूल29के आइसोटोप अनुपात से विभाजित करके डीएनआरए दरों की गणना की ।4 गणना की गई दरें 24.8-177 nmol-N g−1 सूखी मिट्टी एच−1 (तालिका 3)के दायरे में थीं और पिछले अध्ययनों में पाए गए मूल्यों के बराबर थीं। प्राप्त दरों की यह सीमा समान वातावरण से प्राप्त मूल्यों से अधिक है जिसमें अंतरतील तलछट17, नमक दलदल5,16और अन्य एस्टुरीन वातावरण18,33,,34के साथ - साथ यूट्रोफिक वातावरण जैसे उत्तरी कैरोलिना में उथली नदी मुहाना और शंघाई शहरी नदी नेटवर्क32 शामिल हैं ।32 इसके विपरीत, फर्नांडीस एट अल13 ने भारत में जैविक रूप से समृद्ध मैंग्रोव मिट्टी में उच्च संभावित DNRA दरों की सूचना दी । सामान्य तौर पर, डीएनआरए को इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ताओं 35 ,36,,37,के लिए उपलब्ध सी के उच्च अनुपात के पक्ष में मानाजाताहै। प्रतिनिधि परिणामों का प्रदर्शन नमूने एक नमक मार्श नव एक भूकंप है, जो मूल रूप से एक खेती के खेत के रूप में इस्तेमाल किया गया था द्वारा बनाई गई से लिया गया । नमूनों की यह विशेष विशेषता देखी गई उच्च DNRA दर में योगदान दे सकती है। इस अटकलों के अनुरूप, इंटरटिडल जोन में डीएनआरए दर, जो सबटिडल जोन की तुलना में कार्बनिक यौगिकों (डेटा नहीं दिखाए गए) से समृद्ध है, सबटिडल जोन(चित्रा 2, तालिका 3)की तुलना में अधिक थी।
चित्रा 1: गैसीय एनएच3पर कब्जा करने के लिए पीएफई लिफाफा तैयार करना । प्रसार प्रक्रिया में उपयोग किया जाने वाला पीएफई लिफाफा पैनलों (ए) (ई)में दिखाए गए निर्देशों का पालन करतेहुएपीएफई टेप को तह करके तैयार कियाजाताहै। लिफाफे के अंदर अम्लीय फिल्टर गैसीय एनएच3को कैप्चर करता है . ये कदम जल्दी से चलाए जाने चाहिए। विस्तृत जानकारी प्रोटोकॉल अनुभाग में चरण 1.2-1.7 में दी गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: तलछट के अवायवीय इनक्यूबेशन के माध्यम से 15एनएच4+ एकाग्रता में परिवर्तन। तलछट के नमूनों के 15एन ट्रेसर इनक्यूबेशन डुप्लीकेट में किए गए थे । 15एन-एनएच4++ की एकाग्रता तलछट के शुष्क वजन के प्रति nmol में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: कम एकाग्रता एन2ओ के अंशांकन वक्र का एक उदाहरण। एन2ओ का पीक एरिया एम/जेड ४४, एम/जेड ४५ और एम/जेड ४६ के पीक एरिया की राशि से प्राप्त किया गया था । जीसी/एमएस विश्लेषण के लिए विन्यास तालिका 2 में दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| 15 प्रत्येक शीशी में एन-लेबल और गैर-लेबल किए गए सब्सट्रेट्स जोड़े गए | ||
| 100mM | 100mM | |
| एनएच4सीएल | कश्मीर15नहीं3 | |
| प्रत्येक शीशी में 100 mm स्टॉक समाधान की मात्रा (μL) जोड़ा गया | 24 | 60 |
| अंतिम एकाग्रता (μmol/L)* | >230§ | 570 |
| * दिखाए गए मानों की गणना यह मानकर की जाती है कि तलछट की पानी की मात्रा 50% है | ||
| § पृष्ठभूमि अमोनियम एकाग्रता के आधार पर | ||
तालिका 1: तलछट निलंबन के लगभग 11 एमएल को बनाए रखने वाली शीशियों में संशोधित सब्सट्रेट्स के संयोजन। नमूने डुप्लीकेट में तैयार किए गए और 1 घंटे, 3 घंटे और 5 घंटे के बाद आगे के विश्लेषण के अधीन इनक्यूबेशन ।
| उपकरण | |
| क्वाड्रपोल जीसीएमएस | शिमाडज़ू जीसीएमएस-क्यूपी 2010 अल्ट्रा |
| स्तंभ | सीपी-पोराबॉन्डक्यू 25m; φ 0.32 मिमी; फिल्म मोटाई, 5μm |
| विश्लेषणात्मक स्थितियां | |
| कॉलम टेम्प | 40 डिग्री सेल्सियस |
| इंजेक्शन पोर्ट अस्थायी | 100 डिग्री सेल्सियस |
| वाहक गैस स्ट्रीम | कुल प्रवाह दर, 47.1 एमएल •मिन-1 कॉलम में प्रवाह दर, 2.10 एमएल •मिन-1 |
| स्प्रिट अनुपात | 20 |
| डिटेक्शन वोल्टेज | 1.5 केवी |
| एन2ओ की संवेदनशीलता | |
| पता लगाने की निचली सीमा (LOD)* | 1.42 पीएमओएल |
| मात्राकरण (LOQ) की निचली सीमा* | 4.58 पीएमओएल |
| * LOD और LOQ एन 2 O(०.९७,१.९४, २.९१, ४.७५, ९.५०, १४.३ पीपीएम) के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने के बीच एक रैखिक संबंध द्वारा निर्धारित किया गया था, वह में इसी प्रतिक्रियाओं, और एस/एन अनुपात । LOD और LOQ क्रमशः एस/एन = 3 और एस/एन = 10 के बराबर सांद्रता के रूप में गणना की गई । |
तालिका 2: जीसी/एमएस विश्लेषण के लिए शर्तें ।
| तलछट | DNRA दर | कोई3का संवर्धन- * |
| nmol-N g-1 घंटा-1 | परमाणु% | |
| इंटरटिडल 1 | 177 | 99.9 |
| इंटरटिडल 2 | 129 | 99.0 |
| सबटिडल 1 | 39.3 | 99.9 |
| सबटिडल 2 | 24.8 | 99.0 |
| * जोड़ा KNO3के परमाणु% के रूप में ही; पूर्ण उन्मूलन और उपयोग की गई इनक्यूबेशन स्थितियों के तहत कोई नाइट्रिफिकेशन पहले परीक्षण नहीं किया गया था। |
तालिका 3: परीक्षण किए गए इंटरटिडल और सबटिडल तलछट की संभावित DNRA दरें।
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Discussion
डीएनआरए विश्लेषण के लिए एनएच4++ के एकाग्रता और आइसोटोप अनुपात को कई तरीकों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। एनएच4++ की सांद्रता और आइसोटोप अनुपात आम तौर पर अलग से मापा जाता है। एनएच4+ एकाग्रता को आमतौर पर एक ऑटोएनालाइजर 4 , 10 ,15,,16,,17,सहित रंगीन तरीकों का उपयोग करके मापाजाताहै।17 आइसोटोप अनुपात मापन में विश्लेषण के लिए एनएच4+ रूपांतरण, ट्रैपिंग और इंस्ट्रूमेंटेशन की अपनी विधि के आधार पर व्यापक भिन्नताएं हैं। विशिष्ट तरीकों में निम्नलिखित शामिल हैं:
(1) नमूने में एनएच4++ को एमजीओ या नाओएच के अलावा एनएच 3 में परिवर्तित कर दियाजाता है। तरल चरण से गैस चरण में जाने के बाद, एनएच 3 एक एसिडीकृत ग्लास फिल्टर पर या एसिड समाधान में फंसजाता है। सूखने के बाद, फिल्टर को एक मौलिक विश्लेषक/आइसोटोप अनुपात मास स्पेक्ट्रोमीटर (ईए-आईआरएमएस),,11, 18,22, ,38का उपयोग करके एन2के रूप में दहन और विश्लेषण कियाजाताहै। वैकल्पिक रूप से, एसिड समाधान में कैप्चर किए गए एनएच4+ को एक एसोरबेंट (जैसे, ज़ेओलाइट) पर एकत्र किया जाता है और ईए-आईआरएमएस10, 12,के माध्यम से दहन और विश्लेषण कियाजाताहै।
(2) एनएच4++ को हाइपोब्रोमाइट ऑक्सीकरण के माध्यम से एन2 में ऑक्सीकरण किया जाता है। विकसित एन 2 की आइसोटोपिक संरचना आईआरएमएस,4, 14,,39या झिल्ली-परिचय मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमआईएमएस)2 16, 17,के माध्यम से मापीजातीहै।39
(3) एनएच4++ एकाग्रता का निर्धारण बिना किसी रूपांतरण के उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके किया जाता है। क्योंकि एनएच 4+ और एनएच3 का संतुलन 15 एनएच4+ और, 14एनएच 1444+ के पीएच ए के पास थोड़ा अलग है, 14एनएच4+ और 15एनएच4+ सांद्रता का निर्धारण रिटेंशन टाइम 6 ,19,40में एक छोटे से बदलाव के आधार पर किया जा सकता है ।6
इस पत्र में वर्णित विधि मूल रूप से ऊपर सूचीबद्ध दृष्टिकोण (1) के समान है, यानी, क्षारीय परिस्थितियों में ग्लास फिल्टर पर एनएच4+ के रूप में एनएच3 को ठीक करने वाला कदम; हालांकि, यह निम्नलिखित अनुक्रमिक एनएच4+ रूपांतरण चरणों के संबंध में अलग है। ये रूपांतरण चरण प्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए आवश्यक समय को छोटा करने के लिए जोड़े गए संशोधनों के साथ पिछले अध्ययनों पर आधारित हैं। सबसे पहले, हमने मूल डेनिट्रिफायर विधि में कुछ संशोधन किए। पी क्लोरोफिस के बायोमास के बाद तैयार किया जाता है जैसा कि पहले23,,24वर्णित है, हम बैक्टीरिया उगाते हैं और केंद्रित सेल निलंबन को ग्लिसरोल स्टॉक के रूप में संरक्षित करते हैं। इस घने सेल निलंबन को सीधे आइसोटोप विश्लेषण के लिए बफर समाधान के साथ मिलाकर उपयोग किया जा सकता है क्योंकि डिनिरिफिंग गतिविधि पहले से ही पर्याप्त रूप से प्रेरित की जा चुकी है। हालांकि आगे की जांच की आवश्यकता है, इस संशोधन विश्लेषण की प्रजनन क्षमता में सुधार हो सकता है क्योंकि प्रस्तुत विधि denitrifier कोशिकाओं, जो विश्लेषण के लिए सीधे उपलब्ध है की बड़े पैमाने पर खेती सक्षम बनाता है । हमने बैक्टीरियल कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए समाधान की संरचना को भी संशोधित किया, टीएसबी पर आधारित माध्यम से फॉस्फेट-बफर ग्लूकोज समाधान तक, मूल माध्यम में पेप्टोन जैसे अनावश्यक घटकों को बाहर करने के लिए। यह संशोधन खाली एन द्वारा संदूषण को कम कर सकता है क्योंकि फॉस्फेट-बफर ग्लूकोज समाधान में पिछले अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले मूल माध्यम के विपरीत एन शामिल नहीं है; इसका परीक्षण आगे के विश्लेषणों के माध्यम से किया जाना चाहिए। प्रसार विधि के माध्यम से एनएच4+ एकत्र करने वाले चरण में, हमने इनक्यूबेशन अवधि को छोटा कर दिया और कार्बनिक एन के टूटने और एनएच4+के किसी भी प्रतिकूल रूपांतरण या नुकसान को कम करने के लिए तापमान को कम किया। अंशांकन वक्र की रैखिकता का उपयोग करके इस संशोधन की वैधता की जांच की गई थी। हमने यह भी जांच की कि संशोधित तापमान और इनक्यूबेशन अवधि से एनएच4+ (डेटा नहीं दिखाया गया) की वसूली पर कोई असर नहीं पड़ा ।
इस विधि का एक और लाभ यह है कि एनएच4+ अंततः एन2ओ में परिवर्तित हो जाता है, जिसकी वायुमंडलीय पृष्ठभूमि कम होती है और इसे क्वाड्रपोल जीसी/एमएस का उपयोग करके मापा जा सकता है, जो आईआरएमएस की तुलना में कम खर्चीला और प्रबंधन करना आसान है । तालिका 2 में दिखाई गई स्थिति के तहत, सीओ2 (एम/जेड 44) और एन2ओ (एम/जेड 44) जीसी द्वारा पूरी तरह से अलग हैं; इन गैसों का अवधारण समय क्रमशः 1.15 और 1.07 मिनट है। चूंकि एन2ओ की वायुमंडलीय एकाग्रता पीपीबी के आदेश पर है, इसलिए एन2ओ को कम सांद्रता में भी नगण्य हवा हस्तक्षेप के साथ मापा जा सकता है। एन2ओ का अंशांकन वक्र लगभग मूल से गुजरता है, वायुमंडलीय संदूषण के कारण एन2ओ की एकाग्रता पर प्रभाव का प्रदर्शन बहुत सीमित है(चित्र 3)। इस विधि का यह भी लाभ है कि यह 14एनएच 4 + और 15एनएच44+ सांद्रता को एक साथ निर्धारित कर सकता है;+ ऊपर सूचीबद्ध दृष्टिकोण (3) को छोड़कर विहित तरीकों, एकाग्रता और आइसोटोप अनुपात के लिए व्यक्तिगत विश्लेषण की आवश्यकता होती है।
कुल मिलाकर, इस विधि का उपयोग करके एनएच4+ के लिए पता लगाने और मात्राकरण की सीमाएं क्रमशः लगभग 0.03 माइक्रोमोल और 0.09 माइक्रोमोल थीं, और ये मान 6 माइक्रोमोल/एल और 18 माइक्रोमोल/एल के बराबर हैं, यदि नमूना समाधान के 5 एमएल (यानी, इस मामले में निकालने तलछट) का उपयोग इस पेपर में वर्णित प्रसार प्रक्रिया के लिए किया जाता है। यद्यपि कम एनएच 4 + नमूनों के एनएच4+ एकाग्रता4का निर्धारण करने के लिए रंगीन विधि का उपयोग करने की सिफारिश की जातीहै,फिर भी प्रस्तावित विधि एनएच4+ आइसोटोप अनुपात और अमोनियम की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता वाले नमूनों में एकाग्रता को प्रभावी ढंग से निर्धारित करती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम डेटा संग्रह में मदद करने और प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए नाओतो तनाका को धन्यवाद देते हैं। नमूनों के संग्रह को जेएसपीएस काकेंही ग्रांट नंबर 17K15286 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
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