Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Meting van de potentiële tarieven van dissimilatorische nitraatreductie naar Ammonium op basis van 14NH4+/15NH4+ Analyses via sequentiële conversie naar N2O

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/59562
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 4, 4, 5, 1
1Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

Summary

Een reeks methoden om de potentiële DNRA-snelheid te bepalen op basis van 14NH4+/15NH4+ analyses wordt in detail verstrekt. NH4+ wordt omgezet in N2O via verschillende stappen en geanalyseerd met behulp van quadrupole gaschromatografie-massaspectrometrie.

Abstract

Het belang van het begrijpen van het lot van nitraat (NR3−), de dominante N-soort die van terrestrische naar aquatische ecosystemen wordt overgebracht, is toegenomen omdat de wereldwijde stikstofbelastingen na de industrialisatie drastisch zijn toegenomen. Dissimilatorische nitraatreductie tot ammonium (DNRA) en denitrificatie zijn beide microbiële processen die NO3− gebruiken voor ademhaling. In vergelijking met denitrificatie zijn de kwantitatieve bepalingen van de DNRA-activiteit slechts in beperkte mate uitgevoerd. Dit heeft geleid tot onvoldoende inzicht in het belang van DNRA in NO3− transformaties en de regulerende factoren van dit proces. Het doel van dit document is een gedetailleerde procedure te bieden voor de meting van het potentiële DNRA-tarief in milieumonsters. Kortom, het potentiële DNRA-tarief kan worden berekend op basis van de 15N-gelabelde ammonium (15NH4+) accumulatiesnelheid in 15NR3− toegevoegde incubatie. De bepaling van de 14NH4+ en 15NH4+ concentraties beschreven in dit document bestaat uit de volgende stappen. Ten eerste wordt de NH4+ in het monster geëxtraheerd en gevangen op een verzuurd glasfilter als ammoniumzout. Ten tweede wordt het gevangen ammonium via persulfaatoxidatie geëuterd en geoxideerd tot NO3− Ten derde wordt de NO3− omgezet in N2O via een N2O reductase denitreifier. Ten slotte wordt de omgebouwde N2O geanalyseerd met behulp van een eerder ontwikkeld quadrupole gaschromatografie-massaspectrometriesysteem. We pasten deze methode toe op kweldersedimenten en berekenden hun potentiële DNRA-percentages, waaruit bleek dat de voorgestelde procedures een eenvoudige en snellere bepaling mogelijk maken in vergelijking met eerder beschreven methoden.

Introduction

De kunstmatige synthese van stikstofmest en de wijdverbreide toepassing ervan hebben de wereldwijde stikstofcyclus sterk verstoord. Geschat wordt dat de overdracht van reactieve stikstof van terrestrische naar kustsystemen is verdubbeld sinds pre-industriële tijden1. Een aanzienlijk deel van de meststoffen die op een bepaald veld worden aangebracht, wordt weggespoeld van de bodem naar rivieren of grondwater, voornamelijk als NR3− 2. Dit kan leiden tot milieuproblemen zoals drinkwatervervuiling, eutrofiëring en de vorming van hypoxie. NO3− in wateromgevingen wordt verwijderd uit of vastgehouden in het ecosysteem via biologische assimilatie en verschillende microbiële dissimilerende processen. Denitrificatie en anammox staan bekend als belangrijke microbiële verwijderingsprocessen voor NO3−. Denitrificatie is de microbiële reductie van NO3− tot gasvormige N-producten (NO, N2O en N2) in combinatie met de oxidatie van een elektronendonor, zoals organische stoffen, waardoor het risico op bovengenoemde problemen wordt verminderd. Anammox produceert ook N2 van NO2− en NH4+; daarom verwijdert het anorganische N uit een ecosysteem. Omgekeerd werkt DNRA aan het behoud van N in een ecosysteem; algemeen wordt aangenomen dat DNRA voornamelijk wordt uitgevoerd door fermenterende bacteriën of chemolithoautotrofe bacteriën en dat ze dessimilerende NO3− tot biologisch beschikbare en minder mobiele NH4+verminderen.

Studies over DNRA zijn voornamelijk uitgevoerd in mariene of estuariene ecosystemen, zoals oceanische of estuariene sedimenten en water, zout of brak moerasgrond, en mangrovegrond. Kust- of mariene ecosystemen zijn belangrijk als reservoirs voor het verwijderen van NO3− uit terrestrische ecosystemen, en in eerdere studies is aangetoond dat DNRA een bijdrage levert over een zeer breed scala van3− verwijdering (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Verder is het bestaan van DNRA aangetoond in een breed scala van omgevingen, waaronder zoetwateromgevingen19, rijstpadiebodems20en bosbodems21. Hoewel deze studies hebben aangetoond dat DNRA potentieel vergelijkbaar is met denitrificatie voor NO3− verwijdering, zijn studies die de DNRA-activiteit meten nog steeds zeer beperkt in vergelijking met studies die denitrificatie meten.

De DNRA-snelheid is geëvalueerd aan de hand van 15N-labelingtechnieken in combinatie met data-analyse via analytische of numerieke modellen. Een analytische oplossing voor het berekenen van het DNRA-tarief is gebaseerd op de toename van de 15N verrijking van de NH4+ pool na de toevoeging van 15NO3− als tracer. 15. N-label NO3− wordt toegevoegd aan een monster en geïncubeerd, en de DNRA-snelheid kan vervolgens worden berekend op basis van de veranderingen in de concentratie en isotopenverhouding in NH4+ voor en na een bepaalde periode. In dit document wordt een methode beschreven om de NH4+ concentratie en de isotopenverhouding te kwantificeren, die nodig zijn om de DNRA-snelheid te berekenen, in detail beschreven. Kortom, de hier gerapporteerde methode is een combinatie van verschillende eerder gerapporteerde technieken22,23,24,25,26 met wijzigingen toegevoegd aan een aantal procedures. De methode bestaat uit een reeks van vijf componentprocedures: (1) incubatie van een milieumonster met de wijziging van een stabiele isotopentracer, 15NR3−(2) extractie en nuttige toepassing van NH4+ met behulp van een "diffusieprocedure" met wijzigingen, (3) persulfaatoxidatie van NH4+ in het monster; bestaande uit inheemse NH4+ en 15NH4+ afgeleid van 15NR3− via DNRA-activiteit, in NO3− en 15NO3−(4) latere microbiële transformatie van NO 3− en 3 − en15 15GEEN3− tot N2O-isotopen via de gemodificeerde denitrifiermethode en (5) kwantificering van de N2O-isotopen met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC/MS). In het volgende deel wordt eerst de voorbereiding van de procedures (2) en (4) beschreven en vervolgens worden alle vijf de componentprocedures in detail beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van een PTFE-enveloppe voor het kwantitatief vastleggen van gasvormige NH3

  1. Plaats een stuk polytetrafluorethyleen (PTFE) van 60 mm (25 mm breed) op een klein vel aluminiumfolie (ongeveer 300 mm x 450 mm groot, afgeveegd met ethanol).
  2. As een glasvezelfilter (10 mm in diameter met een poriegrootte van 2,7 μm) bij 450 °C gedurende 4 uur in een dempoven. Plaats het glasvezelfilter iets boven het middelpunt van de langere as van de tape(figuur 1a).
  3. Spot 20 μL van 0,9-mol/L H2SO4 in het midden van een GF/D-filter en vouw de PTFE-tape onmiddellijk met twee pincetten: een platte stempelcet en een enkelvoudig pincet. De volgende stappen, de stappen 1.4–1.7, worden weergegeven in figuur 1 en moeten snel worden uitgevoerd.
  4. Draai de PTFE-tape over het GF/D-filter op de stippellijn in figuur 1a om de vorm in figuur 1bte vormen .
  5. Verzegel beide zijden door te vouwen en druk vervolgens stevig op de rand met de pincet(figuur 1c). Druk niet te hard en krab de PTFE-tape niet.
  6. Vouw het open uiteinde met de pincet en druk vervolgens op de rand met de pincet (Figuur 1d).
  7. Sluit het open uiteinde af door de rand stevig te drukken met de pincet(figuur 1e). Het GF/D-filter mag tijdens deze procedure niet worden ingedrukt.

2. Het voorbereiden van de biomassa van een lachgasreductase deficiënt denitrifier, Pseudomonas chlororaphis ondersp. aureofaciens ATCC13985, voor de denitrifiermethode

  1. Streep een 20% glycerol voorraad Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 op 1/4 sterkte tryptone sojabouillon (TSB) agar platen. Incubeer de platen 25 °C gedurende 2-3 dagen.
  2. Breng een alleenstaande kolonie P. chlororaphis over naar een kleine reageerbuis met 5 mL autoclaved TSB medium en cultuur aërobe (zonder te schudden) gedurende een dag bij 25 °C in het donker tot het verkrijgen van maximale groei; dit zal worden gebruikt als de precultuur.
  3. Breng 3 mL van de precultuur over op een 1-L fles met een siliconen rubberen stop met 1 L vers bereide autogeklaveerde gemodificeerde TSB aangevuld met 10 mmol/L KNO323. Broed de fles tijdens het roeren met behulp van een roerder onder donkere omstandigheden bij 25 °C. Na het kweken voor 8 uur, vervang de silicium rubberen stop met een schroefdop en sluit goed. Zet de teelt in anoxie 's nachts voort.
  4. Centrifuge de cultuur op 18.800 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om biomassapellets te verkrijgen.
  5. Was de verpakte biomassa drie maal met 30 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing van Dulbecco (D-PBS(-), pH 7.5), om de NO3−volledig te elimineren. De voorwaarden van de centrifugatie zijn hetzelfde als in stap 2.3.
  6. Na het wassen de verpakte biomassa opnieuw ophangen met 30 mL D-PBS(-). Gebruik 1 mL van de suspensie om de celdichtheid te bepalen door OD600te meten. Pipette 1 mL aliquots van de resterende suspensie in steriele cryovials met 0,8 mL van 45% glycerol. Bewaar de bereide glycerolvoorraden bij −80 °C tot gebruik (zie punt 6).

3. Eliminatie van zuurstof, nitriet en nitraat uit het monstersediment

  1. Weeg 3,0 g (nat gewicht) sediment af in een glazen flacon van 20 mL en voeg 9,0 mL oppervlaktewater toe om het op te schorten (25% w/w drijfmest).
  2. Sluit de flacon af met een zwarte butylrubberstopper (gewassen met ionengerend water en gesteriliseerd via autoclaving) en een aluminium dop.
  3. Zuiver de vering en vervang de hoofdruimtelucht door Ar (>99,99%) op 0,6 L/min gedurende 20 minuten met behulp van een spruitstuk.
  4. Vervang het Ar headspace gas door ultra-pure (>99.99995%) Hij door te stofzuigen voor 90 s en opladen Hij voor 30 s. Herhaal deze procedure vier keer. Stel de gasdruk in de hoofdruimte in op 1,5 atm.
  5. Broed de flesjes bij 20 °C 's nachts met schudden bij 150 rpm onder donkere omstandigheden met behulp van een constante temperatuur shaker om de resterende zuurstof, nitraat en nitriet in het sediment suspensie en headspace gas te elimineren.

4. Tijdscursusexperiment voor het bepalen van het DNRA-tarief

  1. Vervang de headspace gas door verse ultra-pure Hij met behulp van dezelfde procedure als in stap 3.5, maar zonder de vier herhalingen.
  2. Voeg gelabelde en niet-gelabelde substraten toe aan elke flacon volgens tabel 1 via de butylrubberstopper met behulp van een gastachtige spuit. Zuiver de eerder voorbereide substraatoplossingen in voldoende grote glazen flacons met ultrazuiver Hij met de druk van de hoofdruimte ingesteld op 1,5 atm om luchtverontreiniging te voorkomen. Vermijd de onbedoelde injectie van een hoeveelheid lucht tijdens de injectieprocedures.
  3. Incubeer flacons bij 20 °C met schudden bij 150 tpm. Voeg de substraten toe aan elke flacon volgens tabel 1 en broed gedurende 1 uur, 3 uur en 5 uur uit. Nadat incubatie is gestopt, onderwerpt u de sedimentsuspensie in de flacons aan de volgende procedures: stappen 4.4–4.9.
  4. Verwijder de aluminium dop en butyl rubberstopper uit elke flacon. Voeg vervolgens KCl (ingeasd bij 450 °C gedurende 4 uur) toe aan de sedimentsusopening tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 2 mol/L om het herstel van NH4+ uit het sediment te garanderen. Sluit de flesjes met een butyl rubberen stop en een aluminium sluiting.
  5. Schud het sediment bij 150 tpm gedurende 1 uur bij 4 °C onder donkere omstandigheden om de NH4+te extraheren.
  6. Breng de gehele sedimentsuspensie in de flacon over op een plastic centrifugebuis van 50 mL en vercent u 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  7. Spoel de binnenwand van een vers geopende wegwerpspuit van 10 mL af en bevestig deze aan een vers geopend wegwerpceacetaat van wegwerpcellulose (poriegrootte 0,22 μm, 25 mm in diameter). Spoel vervolgens het membraanfilter af met 1 mL supernatant. Plaats de gespoelde spuitfilterunit op een 20 mL wide-mouth polypropyleen (PP) fles.
  8. Filtreer de resterende supernatant door een acetaatmembraanfilter in de 20 mL PP-fles. Bewaar de uittreksels op −20 °C tot nader onderzoek.

5. Het vastleggen van diffuus NH4+ in 2M H2SO4 geabsorbeerd naar het GF/D-filter in de PTFE-envelop en de persulfaatoxidatie van NH4+ tot NR3−

  1. Bereid standaardoplossingen voor van 14NH4Cl met concentratiegradiënten van 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L en 500 μ/L. Voor de analyse van de 15N-verhouding de totale concentratie van NH4+ tot 200 μmol/L vast te stellen en isotopenratio's van 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 en 10:90 voor te bereiden met pure 14NH4Cl en 15NH4CL standaardoplossingen.
  2. Breng 30 mg MgO (ingeasd bij 450 °C gedurende 4 uur) over in een glazen flacon van 20 mL en plaats de PTFE-envelop in het flesje.
  3. Breng 5 mL van een monster of standaard over in het flacon met de MgO en de PTFE-envelop, en sluit onmiddellijk met een grijze butylrubberstopper. Verzegel met een aluminium dop. Als de concentratie nh4+ naar verwachting meer dan 500 μmol/L zal bedragen, verdunt u het monster tot minder dan 500 μmol/L.
  4. Schud de flacons bij 150 tpm voor 3 uur bij 4 °C onder donkere omstandigheden.
  5. Verwijder de aluminium dop en de butylrubberstopper. Haal de PTFE-envelop uit het flacon met punt-ended pincet, spoel de envelop en de pincet grondig af met ion-geruild water, veeg ze af met een afvegend papier en leg de envelop op een vers afveegpapier.
  6. Open de PTFE-envelop met een paar pincet (gebruik van zowel de flat-ended en punt-ended pincet wordt aanbevolen) in de exacte omgekeerde volgorde van het vouwen uitgevoerd in stappen 1.4–1.7.
  7. Houd het perifere gebied van de GF / D-filter, waar de H2SO4 wordt verondersteld te worden unabsorbed, met de flat-ended pincet, en breng het in een 11-mL schroefdop reageerbuis met een PTFE-gevoerde dop. Spoel de pincet met ion-geruild water, en veeg ze met veegpapier.
  8. Herhaal stap 5.5–5.7 voor de resterende enveloppen.
  9. Voeg 1 mL ion-geruild water toe aan elk van de reageerbuizen, sluit de schroefdop en onderhoud deze zonder minstens 30 minuten te schudden bij kamertemperatuur om de NH4+ volledig uit het GF/D-filter te halen. Voer tijdens deze stap parallel de volgende stap (stap 5.10) uit.
  10. Bereid het persulfaat-oxiderende oplossing (POR) reagens25,26.
    1. Omdat het niet kan worden opgeslagen, bereid de exacte hoeveelheid POR die nodig is voor de behandeling van een enkele dag van monsters.
    2. Om POR voor te bereiden om 50 monsters te behandelen, giet 100 mL ion-geruild water in een 200 mL schroefdop fles en voeg 1,52 g NaOH (stikstof samengestelde analyse grade), 3 g boorzuur, en 5 g van K2S2O8 (stikstof en fosfor analyse kwaliteit) in die volgorde. Onmiddellijk na het toevoegen van elk reagens, schud de oplossing totdat deze volledig is opgelost.
    3. Indien nodig, week de fles in warm water om de ontbinding van de chemicaliën te helpen; er moet echter aandacht worden besteed aan de verontreiniging van NO3− omdat kraanwater normaal gesproken GEEN3−bevat .
  11. Open na stap 5.8 de schroefdop, voeg 2 mL van het POR-reagens toe aan de reageerbuis en sluit de buis stevig met een schroefdop om verlies of verontreiniging tijdens de volgende stappen te voorkomen.
  12. Leg de reageerbuizen op een rek, wikkel ze in dubbelgelaagde aluminiumfolie en maak ze 1 uur bij 121 °C. Houd de buizen rechtop tijdens deze stap en vermijd snelle temperatuurveranderingen na het beëindigen van het autoclaven.

6. Het bepalen van de NO3− omgezet van NH4+ door de denitrifier methode met behulp van quadrupole GC /MS

  1. Meng 100 mL steriele fosfaatbuffer van 40 mmol/L (pH 7.2) en 100 mL steriele 30 mmol/L glucose aseptisch (20 mmol/L fosfaat en 15 mmol/L glucose; definitief).
  2. Voeg een 1/7,2 volume glycerolvoorraad P. chlororaphis toe aan 200 mL van de fosfaatgebufferde glucoseoplossing in een Erlenmeyer-kolf van 300 mL en zuiver met een ultrazuivere Hij (>99,995%) stream voor 1 uur.
  3. Doe 2,0 mL van de denitrifier-ophanging in elke 5 mL flacon. Dop de flesjes met een grijze butyl rubberen stop en een aluminium sluiting.
  4. Vervang de headspace air met ultra-pure Hij door stofzuigen voor 3 min en het opladen van de He voor 1 min. Stel de positieve druk van het headspace gas in op 1,3 atm om onbedoelde luchtverontreiniging te voorkomen.
  5. Injecteer 1 mL van een monster of standaard via de butyl rubberstopper met behulp van een wegwerpspuit van 1 mL. Let op de exacte hoeveelheid van het daadwerkelijk geïnjecteerde monster.
  6. Broed de flesjes 's nachts bij 25 °C onder donkere omstandigheden.
  7. Injecteer 0,3 mL 6-mol/LL NaOH om de denitrificatie te stoppen en de headspace CO2op te nemen, wat anders de N2O-analyse door GC/MS ernstig zal verstoren omdat CO2 en N2O hetzelfde molecuulgewicht hebben.
  8. Bepaal de bedragen van 44N2O, 45N2O en 46N2O in het headspace gas met behulp van quadrupole GC/MS met een aangepaste injectiepoort25. De bedrijfsomstandigheden die voor de GC/MS-analyse worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 2.

7. Gegevensanalyse

  1. Ontlenen de kalibratiecurve voor de NH4+ concentratie aan de lineaire relatie tussen de bekende concentratie van 14NH4+ en de gemeten signaalintensiteiten van het totaal geproduceerde 44N2O + 45N2O + 46N2O. Ontlenen de kalibratiecurve voor het 15N-gehalte aan de lineaire relatie tussen het bekende atoom%(d.w.z.. , 15N/14N+15N) en het berekende atoom% met behulp van een eerder verstrekte vergelijking27. Bereken de concentratie van 15NH4+ door de totale NH4+ te vermenigvuldigen met de 15N verhouding van NH4+.
  2. Bereken de potentiële DNRA-snelheid aan de hand van vergelijkingen die elders28,29,30 wordenaangeboden .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representatieve resultaten in dit document zijn afgeleid van 15N-tracing experimenten van kweldersedimenten. De bemonsterde kwelder werd nieuw gemaakt in de nasleep van de 2011 Great East Japan Aardbeving in het Moune gebied van Kesen-numa stad in miyagi prefectuur, Japan. In september 2017 werden oppervlaktesedimenten (0-3 cm) verzameld op twee locaties in de subgetijden- en intergetijdenzones. Eerst, onmiddellijk na het verzamelen, werd het sediment gezeefd door een 4 mm gaas om plantenwortels, schelpenresten en puin te verwijderen en vervolgens gehomogeniseerd te worden. De monsters werden opgeslagen bij 4 °C totdat de DNRA-analyse werd uitgevoerd.

De incubatieprocedures voor de 15NR3− en de gelijktijdige bepaling van de 14NH4+ en 15NH4+ concentraties werden uitgevoerd zoals beschreven in de protocolsectie. Voor alle sedimenten werd een toename van de 15NH4+ concentratie gedurende de incubatietijd waargenomen (figuur 2). We berekenden de DNRA-tarieven door de accumulatiesnelheid van 15NH4+ te delen door de isotopenverhouding van de NO3− pool29. De berekende percentages lagen binnen het bereik van 24,8–177 nmol-N g−1 droge bodem h−1 ( tabel3) en waren vergelijkbaar met waarden die in eerdere studies werden gevonden. Dit bereik van verkregen tarieven is hoger dan de gerapporteerde waarden afgeleid van vergelijkbare omgevingen, waaronder die van intergetijdensedimenten17, kwelders5,16, en andere estuaria omgevingen18,33,34, evenals uit eutrofische omgevingen zoals een ondiepe rivier estuarium in North Carolina31 en de Shanghai stedelijke riviernetwerken32. Omgekeerd rapporteerden Fernandes et al.13 hogere potentiële DNRA-tarieven in organisch rijke mangrovebodems in India. In het algemeen wordt gedacht dat DNRA wordt begunstigd door een hoge verhouding van de beschikbare C tot elektronen acceptoren35,36,37. De monsters waaruit de representatieve resultaten werden genomen uit een kwelder nieuw gemaakt door een aardbeving, die oorspronkelijk was gebruikt als een teeltveld. Dit specifieke kenmerk van de monsters kan bijdragen tot het waargenomen hoge DNRA-percentage. In overeenstemming met deze speculatie was het DNRA-percentage in de intergetijdenzone, dat rijk is aan organische verbindingen (niet weergegevene gegevens) in vergelijking met de subtidalzone, hoger dan die in de subgetijdenzone(figuur 2, tabel 3).

Figure 1
Figuur 1: Bereiding van een PTFE-envelop voor het vastleggen van gasvormige NH3. De PTFE-envelop die in de diffusieprocedure wordt gebruikt, wordt bereid door PTFE-tape te vouwen volgens de instructies in panelen (A)–(E). Het verzuurde filter in de envelop vangt de gasvormige NH3op. Deze stappen moeten snel worden uitgevoerd. Gedetailleerde informatie wordt gegeven in de stappen 1.2–1.7 in de sectie protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Verandering in de 15NH4+ concentratie via de anaerobe incubatie van sedimenten. De 15N tracer incubaties van de sedimentmonsters werden uitgevoerd in tweevoud. De concentratie van 15N-NH4+ wordt weergegeven in nmol per droog gewicht van sediment. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Een voorbeeld van kalibratiecurve van lage concentratie N2O. Piekgebied van N2O werd verkregen op de som van het piekgebied van m/z 44, m/z 45 en m/z 46. Configuraties voor GC/MS-analyse worden weergegeven in tabel 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

15. N-gelabelde en niet-gelabelde substraten toegevoegd aan elke flacon
100mM 100mM
NH4Cl K15NR.
Volume (μL) van 100 mM voorraadoplossing toegevoegd aan elke flacon 24 60
Eindconcentratie (μmol/L)* >230§ 570
*getoonde waarden worden berekend door ervan uit te gaan dat het watergehalte van het sediment 50% is
§afhankelijk van de achtergrond ammoniumconcentratie

Tabel 1: Combinaties van substraten die zijn gewijzigd in flacons met een behoud van ongeveer 11 mL van de sedimentsuspensie. De monsters werden in tweevoud bereid en na 1 h, 3 uur en 5 uur incubatie aan verdere analyses onderworpen.

Apparatuur
viervoetige GCMS Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra
Kolom CP-PoraBONDQ 25m; φ 0,32 mm; filmdikte, 5μm
Analytische omstandigheden
kolom temp 40 °C
injectiepoort temp 100 °C
draaggasstroom Totale debiet, 47,1 mL•min-1
stroomsnelheid in kolom, 2,10 mL•min-1
sprit verhouding 20
detectiespanning 1,5 kv
Gevoeligheid van N2O
ondergrens van detectie (LOD)* 13.42 uur
ondergrens van kwantificering (LOQ)* 16.58 uur
*LOD en LOQ werden bepaald door een lineaire relatie tussen een seriële verdunning van N2O (0,97, 1,94, 2,91, 4,75, 9,50, 14,3 ppm) in Hij, overeenkomstige reacties in piekgebied en S/N-verhouding. LOD en LOQ werden berekend als concentraties die gelijk zijn aan respectievelijk S/N=3 en S/N=10.

Tabel 2: Voorwaarden voor de GC/MS-analyse.

Sediment DNRA-tarief verrijking vanNR.
nmol-N g-1 uur-1 atoom%
Intertidal 1 177 99.9
Intertidal 2 129 99.0
Subtidal 1 39.3 99.9
Subtidal 2 24.8 99.0
*hetzelfde als atoom% van de toegevoegde KNO3; volledige eliminatie en geen nitrificatie onder gebruikte incubatieomstandigheden werd eerder getest.

Tabel 3: Potentiële DNRA-percentages van de geteste intergetijden- en subtidalsedimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De concentratie- en isotopenverhouding van NH4+ voor de DNRA-analyse werd met behulp van verschillende methoden gekwantificeerd. De concentraties en isotopenverhoudingen van NH4+ worden over het algemeen afzonderlijk gemeten. De NH4+ concentratie wordt meestal gemeten met behulp van colorimetrische methoden, waaronder een autoanalyzer4,10,15,16,17. De meting met de isotopenratio heeft grote variaties, afhankelijk van de methode van NH4+ conversie, overvulling en instrumentatie voor de analyse. Typische methoden zijn de volgende:

(1) De NH4+ in het monster wordt omgezet in NH3 via de toevoeging van MgO of NaOH. Na het verplaatsen van de vloeibare fase naar de gasfase, wordt de NH3 gevangen op een verzuurd glasfilter of in een zure oplossing. Na het drogen wordt het filter verbrand en geanalyseerd als N2 met behulp van een elemental analyzer/isotopenratio massaspectrometer (EA-IRMS)11,18,22,38. Als alternatief wordt de gevangen NH4+ in een zuuroplossing verzameld op een adsorberend (bijvoorbeeld zeoliet) en wordt deze verbrand en geanalyseerd via EA-IRMS10,12.

(2) NH4+ wordt geoxideerd tot N2 via hypobromite oxidatie. De isotopensamenstelling van de geëvolueerde N2 wordt gemeten via IRMS4,14,39 of membraanintroductie (MIMS)16,17.

(3) De NH4+ concentratie wordt bepaald aan de hand van hoogwaardige vloeibare chromatografie zonder enige omzetting. Omdat het evenwicht van NH4+ en NH3 is iets anders voor 15NH4+ en 14NH4+ in de buurt van de pH van pKa, de 14NH4+ en 15NH4+ concentraties kunnen worden bepaald op basis van een kleine verschuiving in de retentietijd6,19,40.

De methode beschreven in dit document is in principe hetzelfde als de hierboven genoemde aanpak (1), dat wil zeggen, de stap herstellen NH4+ als NH3 op een glasfilter onder alkalische omstandigheden; het is echter anders met betrekking tot de volgende opeenvolgende NH4+ conversiestappen. Deze conversiestappen zijn gebaseerd op eerdere studies met toegevoegde wijzigingen om de benodigde tijd voor een reeks experimenten te verkorten. Ten eerste hebben we een paar wijzigingen aangebracht aan de oorspronkelijke denitrifiermethode. Nadat de biomassa van P. chlororaphis is bereid zoals eerder beschreven23,24, kweken we bacteriën en behouden we de geconcentreerde celsuspensie als een glycerolbestand. Deze dichte celsuspensie kan direct worden gebruikt voor de isotopenanalyse door deze te mengen met een bufferoplossing omdat de denitrificerende activiteit al voldoende is geïnduceerd. Hoewel verder onderzoek nodig is, kan deze wijziging de reproduceerbaarheid van de analyse verbeteren omdat de gepresenteerde methode de massateelt van denitrifiercellen mogelijk maakt, die direct beschikbaar zijn voor analyses. We hebben ook de samenstelling van de oplossing voor het opschorten van de bacteriële cellen, van een medium op basis van TSB naar een fosfaatgebufferde glucoseoplossing, aangepast om de onnodige componenten zoals pepton in het oorspronkelijke medium uit te sluiten. Deze wijziging kan verontreiniging met blanco N verminderen omdat de fosfaatgebufferde glucoseoplossing geen N bevat, in tegenstelling tot het oorspronkelijke medium dat in eerdere studies werd gebruikt; dit moet worden getest door middel van verdere analyses. In de stap verzamelen NH4+ via de diffusie methode, verkorten we de incubatietijd en verlaagde de temperatuur om de afbraak van organische N en eventuele ongunstige conversie of verlies van NH4+te minimaliseren. De geldigheid van deze wijziging werd gecontroleerd met behulp van de lineariteit van de kalibratiecurve. We hebben ook gecontroleerd of de gewijzigde temperatuur- en incubatietijd geen invloed had op het herstel van NH4+ (gegevens die niet zijn weergegeven).

Een ander voordeel van deze methode is dat NH4+ uiteindelijk wordt omgezet naar N2O, die een lage atmosferische achtergrond heeft en kan worden gemeten met behulp van quadrupole GC / MS, dat is minder duur en gemakkelijker te beheren dan IRMS. Onder de in tabel 2 vermelde voorwaarde worden CO2 (m/z 44) en N2O (m/z 44) volledig gescheiden door GC; de retentietijd van deze gassen bez bez bez. Aangezien de atmosferische concentratie van N2O in de orde van ppb is, kan N2O worden gemeten met verwaarloosbare luchtinterferentie, zelfs in lage concentraties. De kalibratiecurve van N2O passeert bijna de oorsprong, waaruit blijkt dat de invloed op de concentratie van N2O als gevolg van atmosferische verontreiniging zeer beperkt is (figuur 3). Deze methode heeft ook het voordeel dat het de 14NH4+ en 15NH4+ concentraties samen kan kwantificeren; canonieke methoden, met uitzondering van de hierboven genoemde benadering (3), vereisen individuele analyses voor de concentratie en de isotopenverhouding.

Over het geheel genomen waren de detectie- en kwantificeringsgrenzen voor NH4+ met behulp van deze methode respectievelijk ongeveer 0,03 μmol en 0,09 μmol, en deze waarden komen overeen met 6 μmol/L en 18 μmol/L, indien 5 mL van de monsteroplossing (d.w.z. het sedimentextract in dit geval) wordt gebruikt voor de diffusieprocedure zoals beschreven in dit document. Hoewel het gebruik van de colorimetrische methode wordt aanbevolen om de NH4+ concentratie van monsters met een lage NH4+te bepalen, bepaalt de voorgestelde methode effectief de NH4+ isotopenverhouding en de concentratie in monsters met relatief hoge concentraties ammonium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We danken Naoto Tanaka voor het helpen verzamelen van gegevens en het ontwikkelen van het protocol. De verzameling monsters werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M. Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Tags

Milieuwetenschappen Uitgifte 164 stikstofcyclus dessimilerende nitraatreductie tot ammonium (DNRA) 15N-tracer diffusiemethode persulfaatoxidatie viervoudige GC/MS kwelders
Meting van de potentiële tarieven van dissimilatorische nitraatreductie naar Ammonium op basis van <sup>14</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup>/<sup>15</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup> Analyses via sequentiële conversie naar N<sub>2</sub>O
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuroiwa, M., Fukushima, K.,… More

Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter