Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Måling av de potensielle frekvensene av dissimilatory nitratreduksjon til ammonium basert på 14NH4+/15NH4+ Analyser via sekvensiell konvertering til N2O

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/59562
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 4, 4, 5, 1
1Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

Summary

En rekke metoder for å bestemme den potensielle DNRA-satsen basert på 14NH4+/15NH4+ analyser er gitt i detalj. NH4+ omdannes til N2O via flere trinn og analyseres ved hjelp av quadrupole gasskromatografi–massespektrometri.

Abstract

Betydningen av å forstå nitratets skjebne (NO3−), som er den dominerende N-arten som overføres fra terrestriske til akvatiske økosystemer, har økt fordi globale nitrogenbelastninger har økt dramatisk etter industrialiseringen. Dissimilatory nitratreduksjon til ammonium (DNRA) og denitrifisering er begge mikrobielle prosesser som bruker NO3− for respirasjon. Sammenlignet med denitrifisering er kvantitative bestemmelser av DNRA-aktiviteten kun utført i begrenset grad. Dette har ført til en utilstrekkelig forståelse av viktigheten av DNRA i NO3− transformasjoner og de regulerende faktorene i denne prosessen. Målet med dette papiret er å gi en detaljert prosedyre for måling av den potensielle DNRA-frekvensen i miljøprøver. Kort sagt kan den potensielle DNRA-satsen beregnes ut fra det 15N-merkede ammonium (15NH4+) akkumuleringshastighet i 15NO3− tilsatt inkubasjon. Fastsettelsen av de 14NH4+ og 15NH4+ konsentrasjonene som er beskrevet i dette papiret, består av følgende trinn. Først blir NH4+ i prøven ekstrahert og fanget på et surt glassfilter som ammoniumsalt. For det andre er det fanget ammonium eluted og oksidert til NO3− via persulfatoksidasjon. For det tredje konverteres NO3− til N2O via en N2O-reduktase mangelfull denitrifier. Til slutt analyseres det konverterte N2O ved hjelp av et tidligere utviklet quadrupole gasskromatografi–massespektrometrisystem. Vi brukte denne metoden til å saltmyrsedimenter og beregnet sine potensielle DNRA-priser, noe som viser at de foreslåtte prosedyrene tillater en enkel og raskere bestemmelse sammenlignet med tidligere beskrevne metoder.

Introduction

Den kunstige syntesen av nitrogengjødsel og den utbredte applikasjonen har i stor grad gjennomsyret den globale nitrogensyklusen. Det er anslått at overføringen av reaktivt nitrogen fra terrestriske til kystsystemer har doblet seg siden førindustriell tid1. En betydelig del av gjødsel brukt på et gitt felt vaskes bort fra jord til elver eller grunnvann, først og fremst som NO3− 2. Dette kan føre til miljøproblemer som drikkevannforurensning, eutrofiering og dannelse av hypoksi. NO3− i vannmiljøer fjernes fra eller beholdes i økosystemet via biologisk assimilering og ulike mikrobielle dissimilatory prosesser. Denitrifisering og anammox er kjent for å være store mikrobielle fjerningsprosesser for NO3−. Denitrifisering er mikrobiell reduksjon av NO3− til gassprodukter (NO, N2O og N2) kombinert med oksidasjon av en elektrondonor, som organiske stoffer, og dermed redusere risikoen for de ovennevnte problemene. Anammox produserer også N2 fra NO2− og NH4+; Derfor fjerner det uorganisk N fra et økosystem. Derimot arbeider DNRA for å beholde N i et økosystem; det er allment akseptert at DNRA utføres hovedsakelig av fermentative bakterier eller chemolithoautotrohic bakterier og at de reduserer dissimilatory NO3− til biotilgjengelig og mindre mobil NH4+.

Studier på DNRA har primært blitt utført i marine eller elvemunning økosystemer, som oseanisk eller elvemunning sedimenter og vann, salt eller brakkmyr jord, og mangrove jord. Kyst- eller marine økosystemer er viktige som reservoarer for å fjerne NO3− fra terrestriske økosystemer, og i tidligere studier DNRA har vist seg å bidra over et svært bredt spekter av NO3− fjerning (0-99%)3,,4,,5,,6,,7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15,,16,,17,,18. Videre har eksistensen av DNRA blitt demonstrert i et bredt spekter av miljøer, inkludert ferskvannsmiljøer19,ris risjord20og skogsjord21. Selv om disse studiene har vist at DNRA potensielt kan sammenlignes med denitrifisering for NO3− fjerning, er studier som måler DNRA-aktiviteten fortsatt svært begrenset sammenlignet med de som måler denitrifisering.

DNRA-frekvensen er evaluert ved hjelp av 15N-merkingsteknikker i forbindelse med dataanalyse via analytiske eller numeriske modeller. En analytisk løsning for å beregne DNRA-satsen er basert på økningen i 15N-berikelsen av NH4+ bassenget etter tillegg av 15NO3− som tracer. 15.15 .15 N-merket NO3− legges til en prøve og inkuberes, og DNRA-satsen kan deretter beregnes ut fra konsentrasjons- og isotopforholdet endres i NH4+ før og etter en viss tidsperiode. I dette papiret er en metode for å kvantifisere NH4+ konsentrasjonen og isotopforholdet, som er nødvendig for å beregne DNRA-satsen, beskrevet i detalj. I utgangspunktet er metoden rapportert her en kombinasjon av flere tidligere rapporterteteknikker 22,23,24,25,26 med modifikasjoner lagt til noen prosedyrer. Metoden består av en rekke fem komponentprosedyrer: (1) inkubasjon av en miljøprøve med endring av en stabil isotopsporer, 15NO3−, (2) ekstraksjon og gjenoppretting av NH4+ ved hjelp av en "diffusjonsprosedyre" med modifikasjoner, (3) persulfatoksidasjon av NH4+ i prøven, bestående av innfødte NH4+ og 15NH4+ avledet fra 15NO3− via DNRA-aktivitet, til NO3− og 15NO3−, (4) påfølgende mikrobiell transformasjon av NO3− og 15NO3− til N2O isotopomers via den modifiserte denitrifiermetoden, og (5) kvantifisering av N2O isotopomers ved hjelp av gasskromatografi–massespektrometri (GC/MS). I den følgende delen beskrives først preparatet for prosedyrer (2) og (4), og deretter beskrives alle de fem komponentprosedyrene i detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av en PTFE-konvolutt for kvantitativt fangst av gassfattig NH3

  1. Plasser et 60 mm stykke polytetrafluoretylentape (PTFE) (25 mm i bredden) på et lite ark aluminiumsfolie (ca. 300 mm x 450 mm i størrelse, tørket med etanol).
  2. Aske et glassfiberfilter (10 mm i diameter med en porestørrelse på 2,7 μm) ved 450 °C i 4 timer i en muffleovn. Plasser glassfiberfilteret litt over midtpunktet på den lengre aksen på båndet (figur 1a).
  3. Punkt 20 μL på 0,9-mol/L H2SO4 i midten av et GF/D-filter, og brett umiddelbart PTFE-båndet med to pinsett: flate stempel pinsett og rett-end pinsett. Følgende trinn, trinn 1.4–1.7, vises i figur 1 og bør utføres raskt.
  4. Vend PTFE-båndet over GF/D-filteret på den stiplede linjen som vises i figur 1a, for å danne figuren som vises i figur 1b.
  5. Forsegle begge sider ved å brette og deretter trykke på kanten tett med pinsettene (figur 1c). Ikke trykk for hardt, og ikke skrap PTFE-båndet.
  6. Brett den åpne enden med pinsettene, og trykk deretter på kanten med pinsettene (figur 1d).
  7. Forsegle den åpne enden ved å trykke kanten tett med pinsettene (figur 1e). GF/D-filteret skal ikke trykkes under denne prosedyren.

2. Forbereder biomasse av en lystgass reduktase mangelfull denitrifier, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, for denitrifier metoden

  1. Strek en 20% glyserol lager av Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 på 1/4 styrke tryptone soy kjøttkraft (TSB) agar plater. Inkuber platene ved 25 °C i 2–3 dager.
  2. Overfør en singler koloni av P. klororafis til et lite testrør som inneholder 5 ml autoklavet TSB medium og kultur aerobically (uten risting) for en dag ved 25 ° C i mørket til oppnå maksimal vekst; dette vil bli brukt som prekultur.
  3. Overfør 3 ml av forkulturen til en 1-L flaske med en silisiumgummipropp som inneholder 1 L nylaget autoklavet modifisert TSB supplert med 10 mmol / L KNO323. Inkuber flasken mens du agitating ved hjelp av en røre under mørke forhold ved 25 °C. Etter å ha dyrket i 8 timer, skift ut silisiumgummiproppen med en skrukork og lukk tett. Fortsett dyrkingen i anoksi over natten.
  4. Sentrifuge kulturen på 18800 x g i 15 min ved 4 °C for å få biomassepellets.
  5. Vask den pakkede biomassen tre ganger med 30 ml Dulbeccos fosfatbufret saltvann (D-PBS(-), pH 7.5), for å eliminere NO3−fullstendig . Betingelsene for sentrifugeringen er de samme som i trinn 2.3.
  6. Etter vask, re-suspendere pakket biomasse med 30 ml D-PBS(-). Bruk 1 ml av suspensjonen til å bestemme celletettheten ved å måle OD600. Pipette 1 ml aliquots av gjenværende suspensjon i sterile kryovialer som inneholder 0,8 ml 45% glyserol. Bevar de tilberedte glyserollagrene ved -80 °C til bruk (se avsnitt 6).

3. Eliminering av oksygen, nitritt og nitrat fra prøvesedimentet

  1. Vei 3,0 g (våt vekt) sediment i et 20 ml hetteglass med glass og tilsett 9,0 ml overflatevann for å suspendere det (25 % m/w slam).
  2. Forsegle hetteglasset med en svart butylgummipropp (vasket med ionutvekslingsvann og sterilisert via autoklav) og en aluminiumshette.
  3. Tøm fjæringen og skift ut hoderomluften med Ar (>99,99 %) ved 0,6 l/min i 20 min med manifold.
  4. Erstatt Ar headspace gass med ultra-ren (> 99.99995%) Han ved å støvsuge for 90 s og lading Han for 30 s. Gjenta denne prosedyren fire ganger. Sett gasstrykket for headspace til 1,5 atm.
  5. Inkuber hetteglassene ved 20 °C over natten med risting ved 150 o/min under mørke forhold ved hjelp av en konstant temperaturshaker for å eliminere gjenværende oksygen, nitrat og nitritt i sedimentsuspensjonen og hoderomgassen.

4. Tidsforse forsøk for å bestemme DNRA-rate

  1. Erstatt headspace gass med frisk ultra-ren Han bruker samme prosedyre som i trinn 3.5, men uten de fire repetisjoner.
  2. Tilsett merkede og ikke-merkede underlag i hvert hetteglass i henhold til tabell 1 gjennom butylgummiproppen ved hjelp av en gasstett sprøyte. Rense tidligere forberedt substrat løsninger i tilstrekkelig størrelse glass hetteglass ved hjelp av ultra-ren Han med trykket av headspace satt til 1,5 atm for å unngå luftforurensning. Unngå utilsiktet injeksjon av en hvilken som helst mengde luft under injeksjonsprosedyrene.
  3. Inkuber hetteglass ved 20 °C med risting ved 150 o/min. Tilsett substituttene i hvert hetteglass i henhold til tabell 1 og inkuber i 1 time, 3 timer og 5 timer. Etter at inkubasjonen er stoppet, må sedimentsuspensjonen i hetteglassene utsettes for følgende prosedyrer: trinn 4.4–4.9.
  4. Fjern aluminiumshetten og butylgummiproppen fra hvert hetteglass. Deretter legger KCl (aske ved 450 °C i 4 timer) til sedimentsuspensjonen opp til en endelig konsentrasjon på ca. 2 mol/l for å sikre utvinning av NH4+ fra sedimentet. Lukk hetteglassene med en butylgummipropp og en aluminiumslukking.
  5. Rist sedimentet ved 150 o/min i 1 t ved 4 °C under mørke forhold for å trekke ut NH4+.
  6. Overfør hele sedimentfjæringen i hetteglasset til et 50 ml sentrifugrør i plast, og sentrifuge ved 10 000 x g i 10 min ved 4 °C.
  7. Skyll den indre veggen på en nyåpnet 10 ml engangssprøyte, og fest den til et nyåpnet engangscelluloseacetatmembranfilter (porestørrelse 0,22 μm, 25 mm i diameter). Skyll deretter membranfilteret med 1 ml supernatant. Plasser den skyllede sprøytefilterenheten på en 20 ml bredmunn polypropylenflaske (PP).
  8. Filtrer resten av supernatanten gjennom et acetatmembranfilter i 20 ml PP-flasken. Oppbevar ekstraktekstraktene ved −20 °C inntil videre analyse.

5. Fange diffust NH4+ i 2M H2SO4 absorbert til GF / D-filteret i PTFE konvolutten og persulfatoksidasjon av NH4+ til NO3−

  1. Klargjør standardløsninger på 14NH4Cl med konsentrasjonsgradienter på 0 μmol/l, 10 μmol/l, 40 μmol/l, 100 μmol/l, 200 μmol/l, 400 μmol/l og 500 μmol/l. For 15N-ratioanalysen fikse den totale konsentrasjonen av NH4+ til 200 μmol/L og klargjør isotopforhold på 100:0, 99,5:0,5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 og 10:90 med rene 14NH4Cl og 15NH4Cl standardløsninger.
  2. Overfør 30 mgo (aske ved 450 °C i 4 timer) til et 20 ml hetteglass i glass, og plasser PTFE-konvolutten i hetteglasset.
  3. Overfør 5 ml av en prøve eller standard til hetteglasset som inneholder MgO og PTFE-konvolutten, og lukk umiddelbart med en grå butylgummipropp. Tetning med en aluminiumcap. Hvis konsentrasjonen av NH4+ forventes å overstige 500 μmol/l, fortynne prøven til under 500 μmol/l.
  4. Rist hetteglassene ved 150 o/min i 3 timer ved 4 °C under mørke forhold.
  5. Fjern aluminiumshetten og butylgummiproppen. Ta PTFE-konvolutten ut av hetteglasset med punkt-end pinsett, skyll konvolutten grundig og pinsettene med ionutvekslingsvann, tørk dem med tørkepapir og legg deretter konvolutten på et nytt tørkepapir.
  6. Åpne PTFE-konvolutten med et par pinsett (bruk av både flat-end og punkt-end pinsett anbefales) i nøyaktig omvendt rekkefølge av folding utført i trinn 1.4-1.7.
  7. Hold det perifere området av GF/D-filteret, der H2SO4 skal være uabsorbert, med flat-end pinsett, og overføre den til en 11 ml skrue cap reagensrør med en PTFE-lined cap. Skyll pinsettene med ionutvekslingsvann, og tørk dem med tørkepapir.
  8. Gjenta trinn 5.5–5.7 for de gjenværende konvoluttene.
  9. Tilsett 1 ml ion-utvekslet vann til hvert av testrørene, lukk skrukorken, og hold den uten å riste i minst 30 minutter ved romtemperatur for å fullstendig elute NH4+ fra GF / D-filteret. I løpet av dette trinnet utfører du følgende trinn (trinn 5.10) parallelt.
  10. Klargjør persulfatoksiderende oppløsning (POR) reagens25,26.
    1. Fordi den ikke kan lagres, må du forberede den nøyaktige mengden POR som trengs for å behandle en enkelt dag med prøver.
    2. For å forberede POR til å behandle 50 prøver, hell 100 ml ionutvekslingsvann i en 200 ml skrukorkflaske og tilsett 1,52 g NaOH (nitrogenforbindelsesanalyseklasse), 3 g borsyre og 5 g K2S2O8 (nitrogen- og fosforanalyseklasse) i den rekkefølgen. Umiddelbart etter at du har lagt til hver reagens, rist oppløsningen til den er fullstendig oppløst.
    3. Om nødvendig, suge flasken i varmt vann for å hjelpe oppløsning av kjemikaliene; Det bør imidlertid tas hensyn til kontaminering av NO3− fordi vann fra springen vanligvis inneholder NO3−.
  11. Etter trinn 5.8 åpner du skrukorken, legger til 2 ml POR-reagens i reagensrøret og lukker røret tett med en skrukork for å forhindre tap eller kontaminering under følgende trinn.
  12. Sett reagensrørene på et stativ, pakk dem inn i tolags aluminiumsfolie, og autoklav dem i 1 t ved 121 °C. Hold rørene i oppreist stilling i løpet av dette trinnet og unngå raske temperaturendringer etter endt autoklavering.

6. Bestemme NO3− konvertert fra NH4+ ved denitrifier metoden ved hjelp av quadrupole GC / MS

  1. Bland 100 ml steril 40 mmol/l fosfatbuffer (pH 7,2) og 100 ml steril 30 mmol/l glukose aseptisk (20 mmol/l fosfat og 15 mmol/l glukose; endelig).
  2. Tilsett et 1/7,2 volum glyserolbestand av P. klororafis til 200 ml fosfatbufret glukoseoppløsning i en 300 ml Erlenmeyer kolbe, og tøm med en ultra-ren Han (> 99,995%) strømmen i 1 t.
  3. Dispenser 2,0 ml av denitrifiersuspensjonen i hvert 5 ml hetteglass. Cap hetteglassene med en grå butylgummipropp og en aluminiumslukking.
  4. Erstatt headspace luft med ultra-ren Han ved å støvsuge i 3 min og lade Han i 1 min. Sett gasstrykket for hoderommet til 1,3 atm for å unngå utilsiktet luftforurensning.
  5. Injiser 1 ml av en prøve eller standard gjennom butylgummiproppen ved hjelp av en engangssprøyte på 1 ml. Legg merke til den nøyaktige mengden av prøven som faktisk injiseres.
  6. Inkuber hetteglassene over natten ved 25 °C under mørke forhold.
  7. Injiser 0,3 ml 6-mol/LL NaOH for å stoppe denitrifiseringen og absorbere headspace CO2, som ellers vil forstyrre N2O-analysen av GC/MS alvorlig fordi CO2 og N2O har samme molekylvekt.
  8. Bestem mengdene 44N2O, 45N2O og 46N2O i headspace gass ved hjelp av quadrupole GC/MS med en modifisert injeksjonsport25. Driftsbetingelsene som brukes for GC/MS-analysen, vises i tabell 2.

7. Dataanalyse

  1. Utled kalibreringskurven for NH4+ konsentrasjonen fra det lineære forholdet mellom den kjente konsentrasjonen på 14NH4+ og de målte signalintensitetene til den totale produserte 44N2O + 45N15142O + 15 46N2O. Utled kalibreringskurven for 15N-innholdet fra det lineære forholdet mellom det kjente atomet% (det vil vil at.27 Beregn konsentrasjonen av 15NH4+ ved å multiplisere den totale NH4+ med 15N-forholdet på NH4+.
  2. Beregn den potensielle DNRA-satsen ved hjelp av ligninger gittandre steder 28,29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representative resultatene som presenteres i denne artikkelen ble avledet fra 15N-sporingseksperimenter av saltmyrsedimenter. Den samplede saltmyren ble nyopprettet i kjølvannet av jordskjelvet i Great East Japan i Moune-området i Kesen-numa i Miyagi-prefekturet i Japan i 2011. I september 2017 ble overflatesedimenter (0–3 cm) samlet inn på to steder i subtidal- og intertidalsonene. Først, umiddelbart etter innsamling, ble sedimentet siktet gjennom et 4 mm nett for å fjerne planterøtter, skjellrester og steinsprut og deretter homogenisert. Prøvene ble lagret ved 4 °C til DNRA-analysen ble utført.

Inkubasjonsprosedyrene for 15NO3− og samtidig bestemmelse av 14NH4+ og 15NH4+ konsentrasjoner ble utført som beskrevet i protokolldelen. Det ble observert en økning ikonsentrasjonen på 15NH 4+ gjennom hele inkubasjonsperioden for alle sedimenter (figur 2). Vi beregnet DNRA-satsene ved å dele akkumuleringshastigheten på 15NH4+ med isotopforholdet til NO3− pool29. De beregnede ratene var innenfor området 24,8–177 nmol-N g−1 tørr jord h−1 ( tabell3) og var sammenlignbare med verdier som ble funnet i tidligere studier. Dette utvalget av oppnådde priser er høyere enn de rapporterte verdiene avledet fra lignende miljøer, inkludert de fra intertidalesedimenter 17,saltmyrer5,,16og andre elvemunninger18,,33,,34,samt fra eutrofiske miljøer som en grunn elvemunning i Nord-Carolina31 og Shanghai urbane elvenettverk32. Derimot rapporterte Fernandes et al.13 høyere potensielle DNRA-priser i organisk rike mangrovejordsmonn i India. Generelt er DNRA antatt å være favorisert av et høyt forhold mellom tilgjengelig C til elektron acceptors35,36,37. Prøvene som viser de representative resultatene ble tatt fra en saltmyr som nylig ble opprettet av et jordskjelv, som opprinnelig hadde blitt brukt som dyrkingsfelt. Denne spesielle egenskapen til prøvene kan bidra til den observerte høye DNRA-frekvensen. I samsvar med denne spekulasjonen var DNRA-frekvensen i den intertidale sonen, som er rik på organiske forbindelser (data som ikke vises) sammenlignet med subtidalsonen, høyere enn i subtidalsonen (figur 2, tabell 3).

Figure 1
Figur 1: Tilberedning av en PTFE-konvolutt for å fange gassfattig NH3. PTFE-konvolutten som brukes i diffusjonsprosedyren, tilberedes ved å brette PTFE-tape etter instruksjonene som vises i panelene (A)–(E). Det forsurede filteret inne i konvolutten fanger opp den gassiske NH3. Disse trinnene bør utføres raskt. Detaljert informasjon er gitt i trinn 1.2-1.7 i protokolldelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Endring i konsentrasjonen av 15NH4+ ved anaerob inkubasjon av sedimenter. De 15N tracer inkubasjonene av sedimentprøvene ble utført i duplikat. Konsentrasjonen av 15N-NH4+ er vist i nmol per tørrvekt av sediment. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Et eksempel på kalibreringskurve med lav konsentrasjon N2O. Toppareal n2O ble oppnådd ved summen av toppområdet m/z 44, m/z 45 og m/z 46. Konfigurasjoner for GC/MS-analyse vises i tabell 2. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

15.15 .15 N-merkede og ikke-merkede substrater lagt til hvert hetteglass
100mM (100mM) 100mM (100mM)
Nh4 Cl Leilighet K15NR3
Volum (μL) på 100 mM lageroppløsning lagt til hvert hetteglass 24 60
Endelig konsentrasjon (μmol/L)* >230§ 570
*viste verdier beregnes ved å anta at vanninnholdet i sedimentet er 50 %
§avhengig av bakgrunnskonsentrasjonen av ammonium

Tabell 1: Kombinasjoner av substrater endret til hetteglass som beholder ca. 11 ml sedimentfjæring. sediment suspension. Prøvene ble utarbeidet i duplikat og utsatt for ytterligere analyser etter 1 t, 3 timer og 5 timer inkubasjon.

Utstyr
quadrupole GCMS Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra
Kolonnen CP-PoraBONDQ 25m; φ 0,32 mm; filmtykkelse, 5μm
Analytiske forhold
kolonne temp 40 °C
injeksjon port temp 100 °C
gassstrøm for transportør Total strømningshastighet, 47,1 ml•min-1
strømningshastighet i kolonne, 2,10 ml•min-1
sprit forhold 20
deteksjonsspenning 1.5 kv
Følsomhet for N2O
nedre grense for deteksjon (LOD)* 13:42
nedre grense for kvantifisering (LOQ)* 16.58.
* LOD og LOQ ble bestemt av et lineært forhold mellom en seriell fortynning av N2O (0,97, 1,94, 2,91, 4,75, 9,50, 14,3 ppm) i Han, tilsvarende svar i toppområdet og S / N-forhold. LOD og LOQ ble beregnet som konsentrasjoner tilsvarende henholdsvis S/N=3 og S/N=10.

Tabell 2: Betingelser for GC/MS-analysen.

Sediment DNRA-pris berikelse av NO3- *
nmol-N g-1 t-1 atom%
Intertidal 1 177 99.9
Intertidal 2 129 99.0
Subtidal 1 39.3 99.9
Subtidal 2 24.8 99.0
* samme som atom% av lagt KNO3; fullstendig eliminasjon og ingen nitrasjon under brukte inkubasjonsforhold ble testet tidligere.

Tabell 3: Potensielle DNRA-rater for de testede intertidale og subtidale sedimentene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Konsentrasjons- og isotopforholdet mellom NH4+ for DNRA-analysen ble kvantifisert ved hjelp av flere metoder. Konsentrasjonene og isotopforholdene til NH4+ måles vanligvis separat. NH4+ konsentrasjon måles vanligvis ved hjelp av kolorimetriske metoder, inkludert en autoanalyzer4,,10,,15,,16,,17. Isotop ratio målingen har store variasjoner avhengig av metoden for NH4+ konvertering, fangst, og instrumentering for analysen. Typiske metoder inkluderer følgende:

(1) NH4+ i prøven konverteres til NH3 via tillegg av MgO eller NaOH. Etter å ha flyttet fra væskefasen til gassfasen, er NH3 fanget på et surt glassfilter eller i en syreløsning. Etter tørking blir filteret kombusted og analysert som N2 ved hjelp av en elemental analysator / isotopforhold massespektrometer (EA-IRMS)11,18,22,38. Alternativt samles den fangede NH4+ i en syreløsning på en adsorbent (f.eks. zeolite) og blir kombusted og analysert via EA-IRMS10,12.

(2) NH4+ er oksidert til N2 via hypobromittoksidasjon. Den isotopiske sammensetningen av den utviklede N2 måles via IRMS4,14,,39 eller membran-introduksjon massespektrometri (MIMS)16,17.

(3) NH4+ konsentrasjon bestemmes ved hjelp av høyytelses flytende kromatografi uten konvertering. Fordi likevekt av NH4+ og NH3 er litt forskjellig for 15NH4+ og 14NH4+ nær pH av pKa, 14NH4+ og 15NH4+ konsentrasjoner kan bestemmes basert på et lite skifte i oppbevaringstid6,19,40.

Metoden som er beskrevet i dette papiret er i utgangspunktet den samme som tilnærming (1) som er oppført ovenfor, det vil vil vil at trinnet gjenoppretter NH4+ som NH3 på et glassfilter under alkaliske forhold; Det er imidlertid annerledes med hensyn til følgende sekvensielle NH4+ konverteringstrinn. Disse konverteringstrinnene er basert på tidligere studier med ekstra endringer for å forkorte den nødvendige tiden for en rekke eksperimenter. Først gjorde vi noen modifikasjoner på den opprinnelige denitrifier-metoden. Etter biomassen av P. klororaf er utarbeidet som tidligere beskrevet23,24, vokser vi bakterier og bevarer konsentrert cellesuspensjon som glyserolbestand. Denne tette cellefjæringen kan brukes direkte til isotopanalysen ved å blande den med en bufferløsning fordi denitrifiserende aktiviteten allerede er tilstrekkelig indusert. Selv om videre undersøkelser er nødvendig, kan denne endringen forbedre reproduserbarheten av analysen fordi den presenterte metoden muliggjør massedyrking av denitrifierceller, som er direkte tilgjengelige for analyser. Vi endret også sammensetningen av løsningen for å suspendere bakteriecellene, fra et medium basert på TSB til en fosfatbufret glukoseløsning, for å utelukke unødvendige komponenter som pepton i det opprinnelige mediet. Denne endringen kan redusere kontaminering av blank N fordi fosfatbufret glukoseoppløsningen ikke inneholder N, i motsetning til det opprinnelige mediet som brukes i tidligere studier; dette bør testes via ytterligere analyser. I trinnet samle NH4+ via diffusjonsmetoden forkortet vi inkubasjonsperioden og senket temperaturen for å minimere nedbrytning av organisk N og eventuell ugunstig konvertering eller tap av NH4+. Gyldigheten av denne endringen ble kontrollert ved hjelp av lineariteten til kalibreringskurven. Vi sjekket også at den modifiserte temperatur- og inkubasjonsperioden ikke påvirket utvinningen av NH4+ (data som ikke vises).

En annen fordel med denne metoden er at NH4+ til slutt konverteres til N2O, som har lav atmosfærisk bakgrunn og kan måles ved hjelp av quadrupole GC / MS, som er billigere og enklere å administrere enn IRMS. Under betingelsen som vises i tabell 2, er CO2 (m/z 44) og N2O (m/z 44) fullstendig atskilt med GC; retensjonstiden for disse gassene er henholdsvis 1,15 og 1,07 min. Siden atmosfærisk konsentrasjon av N2O er i rekkefølgen av PPB, kan N2O måles med ubetydelig luftforstyrrelser selv i lave konsentrasjoner. Kalibreringskurven til N2O passerer nesten gjennom opprinnelsen, noe som viser påvirkning på konsentrasjonen av N2O på grunn av atmosfærisk forurensning er svært begrenset (figur 3). Denne metoden har også fordelen at den kan kvantifisere 14NH4+ og 15NH4+ konsentrasjoner sammen; kanoniske metoder, unntatt tilnærming (3) som er nevnt ovenfor, krever individuelle analyser for konsentrasjonen og isotopforholdet.

Samlet sett var grensene for deteksjon og kvantifisering for NH4+ ved hjelp av denne metoden henholdsvis ca. 0,03 μmol og 0,09 μmol, og disse verdiene tilsvarer henholdsvis 6 μmol/l og 18 μmol/l, hvis 5 ml av prøveløsningen (det vil si sedimentekstraktet i dette tilfellet) brukes til diffusjonsprosedyren som beskrevet i dette papiret. Selv om bruk av den kolorimetriske metoden anbefales å bestemme NH4+ konsentrasjonenav prøver som har lav NH4+, bestemmer den foreslåtte metoden effektivt NH4+ isotopforholdet og konsentrasjonen i prøver med relativt høye konsentrasjoner av ammonium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Naoto Tanaka for å ha hjulpet til med datainnsamling og utvikling av protokollen. Innsamlingen av prøver ble støttet av JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M. Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Tags

Miljøvitenskap utgave 164 nitrogensyklus dissimilatory nitratreduksjon til ammonium (DNRA) 15N tracer diffusjonsmetode persulfatoksidasjon quadrupole GC / MS saltmyr
Måling av de potensielle frekvensene av dissimilatory nitratreduksjon til ammonium basert <sup>på 14</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup>/<sup>15</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup> Analyser via sekvensiell konvertering til N<sub>2</sub>O
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuroiwa, M., Fukushima, K.,… More

Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter