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Cancer Research

यूरीन हेमाटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं और एमएल-AF9 प्रेरित ल्यूकेमिया में Mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59593
Automatic Translation
1, 1
1Blood Cell Development and Function Program, Fox Chase Cancer Center

Summary

हम murine स्वस्थ hematopoietic स्टेम और संतति कोशिकाओं (HSPCs) और ल्यूकेमिया कोशिकाओं घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) द्वारा संचालित के एक माउस मॉडल से mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का पता लगाने के लिए मल्टीपैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन MLL-AF9.

Abstract

हम विभिन्न लाइव अस्थि मज्जा में mitochondrial ROS का विश्लेषण करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण प्रस्तुत (बीएम) व्युत्पन्न स्टेम और स्वस्थ चूहों से संतति सेल आबादी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एएमएल के साथ चूहों MLL-AF9 द्वारा संचालित. विशेष रूप से, हम एक दो कदम सेल धुंधला प्रक्रिया का वर्णन है, जिससे स्वस्थ या ल्यूकेमिया बीएम कोशिकाओं को पहले एक fluorogenic डाई है कि mitochondrial superoxides का पता लगाता है के साथ दाग रहे हैं, फ्लोरोक्रोम से जुड़े monoclonal एंटीबॉडी है कि उपयोग किया जाता है के साथ धुंधला द्वारा पीछा विभिन्न स्वस्थ और घातक hematopoietic जनक आबादी भेद करने के लिए. हम भी प्राप्त करने और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक रणनीति प्रदान करते हैं। पूरे प्रोटोकॉल 3-4 एच के रूप में कम के रूप में एक समय सीमा में किया जा सकता है। हम भी प्रमुख चर पर विचार करने के लिए के रूप में अच्छी तरह से लाभ और लाइव hematopoietic और ल्यूकेमिया स्टेम और संतति subpopulations प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फ्लोरोजेनिक रंगों का उपयोग कर के mitochondrial डिब्बे में ROS उत्पादन की निगरानी की सीमाओं पर विचार करने के लिए . इसके अलावा, हम डेटा है कि mitochondrial ROS बहुतायत अलग स्वस्थ HSPC उप जनसंख्या और ल्यूकेमिया संतानों के बीच भिन्न होता है और hematologic अनुसंधान में इस तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों पर चर्चा प्रस्तुत करते हैं.

Introduction

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) आणविक ऑक्सीजन से प्राप्त अत्यधिक प्रतिक्रियाशील अणु हैं। ROS उत्पादन का सबसे अच्छी तरह से परिभाषित सेलुलर स्थान mitochondria है, जहां इलेक्ट्रॉनों कि ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन के दौरान इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ETC) के माध्यम से पारित (OXPHOS) आणविक ऑक्सीजन द्वारा अवशोषित कर रहे हैं एक विशिष्ट के गठन के लिए अग्रणी आरओएस का प्रकार जिसे सुपरऑक्साइड1कहा जाता है। एंजाइमों की एक श्रृंखला के कार्यों के माध्यम से, सुपरऑक्साइड dismutases या SODs कहा जाता है, superoxides हाइड्रोजन पेरोक्साइड में परिवर्तित कर रहे हैं, जो बाद में इस तरह के कैटालेस या glutathione peroxidases (GPX) के रूप में एंजाइमों द्वारा पानी में बेअसर कर रहे हैं। ROS-नियामक तंत्र में क्षोभ ROS के अतिरिक्त उत्पादन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, अक्सर ऑक्सीडेटिव तनाव के रूप में जाना जाता है, जो हानिकारक और संभावित घातक सेलुलर परिणाम जैसे मैक्रो अणु क्षति (यानी, डीएनए, प्रोटीन, लिपिड) है. इसके अलावा, ऑक्सीडेटिव तनाव मधुमेह, सूजन रोगों, उम्र बढ़ने और ट्यूमर2,3,4जैसे कई रोगों से संबंधित है। रेडॉक्स होमियोस्टेसिस को बनाए रखने और ऑक्सीडेटिव तनाव को रोकने के लिए, कोशिकाओं में विभिन्न प्रकार के ROS-नियामक तंत्रहोते हैं 5।

उचित भ्रूणीय और वयस्क हेमेटोपोइसिस6के लिए कुछ आरओएस के शारीरिक स्तर आवश्यक हैं . हालांकि, अतिरिक्त ROS डीएनए क्षति, सेलुलर भेदभाव और hematopoietic स्टेम और संतति पूल की थकावट के साथ जुड़ा हुआ है. वहाँ भी सबूत है कि redox जीव विज्ञान में परिवर्तन ल्यूकेमिया और स्वस्थ कोशिकाओं के बीच अलग हो सकता है. उदाहरण के लिए, ROS स्तर उनके स्वस्थ समकक्षों और अन्य अध्ययनों के सापेक्ष घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) कोशिकाओं में उच्च हो जाते हैं सुझाव दिया है कि ल्यूकेमिया स्टेम कोशिकाओं अस्तित्व के लिए ROS के एक कम स्थिर राज्य स्तर को बनाए रखने7,8. महत्वपूर्ण बात यह है कि इन रेडॉक्स मतभेदों को चिकित्सीय रूप से भुनाने की रणनीतियों ने मानव कैंसर की कई सेटिंग्स9,10में वादा किया है . इसलिए, परख है कि माउस मॉडल में आरओएस के स्तर के आकलन के लिए अनुमति कैसे इन प्रजातियों सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान और रोग रोगजनन के लिए योगदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए एक मंच प्रदान की हमारी समझ में सुधार हो सकता है उपन्यास redox-लक्ष्यीकरण विरोधी कैंसर चिकित्सा.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित पशु प्रक्रियाओं के सभी फॉक्स चेस कैंसर केंद्र में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.

नोट: प्रोटोकॉल कार्यप्रवाह को चित्र 1 में प्रस्तुत 4 भागों में विभाजित किया गया है और आवश्यक अभिकर्मकों को सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध किया गया है।

1. अस्थि मज्जा (बीएम) अलगाव

नोट: MLL-AF9 ल्यूकेमिया चूहों पहले वर्णित के रूप में उत्पन्न किए गए थे11.

  1. मोनो-न्यूक्लियर अस्थि मज्जा कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें, जैसा कि पहले वर्णित12,13,14,15,जंगली प्रकार C57.Bl6 चूहों से (जो CD45.2 congenic मार्कर व्यक्त) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से C57 से. Bl6-SJL चूहों (जो CD45.1 congenic मार्कर व्यक्त) कि MLL-AF9-एक्सप्रेसल्यूमिया कोशिकाओं के साथ प्रतिरोपित किया गया है (CD45.2+).
    नोट: बी .एम . चूहों से12,13 को कुचलकर या हड्डियों को 14,15को बहाकर बरामद किया जा सकता है . यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों के लिए, बीएम फ्लशिंग के माध्यम से दोनों स्वस्थ और ल्यूकेमिया चूहों से बरामद किया गया था।

2. Mitochondrial ROS Fluorogenic डाई दाग

  1. एक बार मोनो परमाणु अस्थि मज्जा कोशिकाओं स्वस्थ और / या ल्यूकेमिया चूहों से बरामद किया गया है, Trypan ब्लू के साथ कोशिकाओं के एक aliquot दाग और कुल बीएम कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या निर्धारित करने के लिए एक hemocytometer का उपयोग कर गिनती.
  2. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज और एफ-पीबीएस में गोली को फिर से शुरू करें (पीबीएस 2% भ्रूण गोजातीय सीरम और एक 1% पेनिसिलिन /स्ट्रेप्टोमाइसिन कॉकटेल के साथ पूरक) 2 x 106 कोशिकाओं /
  3. अलीकोट 200 जेडएल सेल निलंबन प्रति ट्यूब में 9 एकल रंग नियंत्रण ट्यूबों के रूप में लेबल इस प्रकार है:
    कोई दाग, B220-Cy5-पीई, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (केवल स्वस्थ HSPCs के लिए), CD45.2-APC (केवल ल्यूकेमिया कोशिकाओं के लिए), CD34-FITC, Mitochondrial ROS डाई और लाइव /
    नोट: (वैकल्पिक) माइटोकोंड्रियाल आरओएस को शामिल करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण 2 00 डिग्री सेल्सियस में 2 x 105 कोशिकाओं के इलाज के द्वारा तैयार किया जा सकता है, जिसमें मेंडाडोन सोडियम बिसल्फेट (एमएसबी) के 20 डिग्री सेल्सियस के साथ 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में 5% सीओ2 इनक्यूबेटर। एक दूसरा नियंत्रण mitochondrial ROS के MSB मध्यस्थता प्रेरण रिवर्स करने के लिए 2 x 105 कोशिकाओं में 200 $L के साथ 200 $L के साथ तैयार किया जा सकता है एमएसबी प्लस 100 $M N-acetyl-L-cysteine (NAC) के लिए 1 एच पर 37 डिग्री सेल्सियस में एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर.
  4. एक ट्यूब (प्रयोगात्मक ट्यूब) में शेष कोशिकाओं और 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक जीवित / मृत सेल दाग के साथ एफ-पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट, एकल रंग नियंत्रण ट्यूब के लिए लाइव / मृत दाग जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. लाइव /मृत डाई के साथ दाग दोनों एकल रंग और प्रयोगात्मक ट्यूबों के लिए कमरे के तापमान (आरटी) एफ-पीबीएस के 1.0 एमएल जोड़ें। आरटी पर 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट।
  7. एक 5 एम स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए डाइमेथिल सल्फोक्साइड (DMSO) के 13 डिग्री एल में माइटोकोंड्रियाल आरओएस डाई के 50 डिग्री ग्राम को पुन: निलंबित करें।
  8. Dilute mitochondrial ROS डाई के साथ या Verapamil के बिना या बिना आरटी एफ-पीबीएस में 5 डिग्री सेल्सियस की एक अंतिम एकाग्रता के लिए (50 डिग्री सेल्सियस)।
  9. लाइव/डेड सेल दाग के धोने से दूर करें। प्रत्येक प्रयोगात्मक ट्यूब के साथ-साथ माइटोकोंड्रिल ROS डाई एकल-रंग नियंत्रण ट्यूब के लिए वेरापामिल युक्त माइटोकोंड्रियाल ROS डाई दाग के 200 डिग्री एल जोड़ें।
  10. भंवर मिश्रण और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए।
  11. mitochondrial ROS-सना हुआ एकल रंग नियंत्रण और प्रयोगात्मक ट्यूबों के लिए आरटी एफ-पीबीएस के 1.0 एमएल जोड़ें। आरटी पर 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट।
  12. सुपरनेंट को बंद करें और आरटी एफ-पीबीएस के अतिरिक्त 1.0 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें। आरटी पर 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट।

3. वंश एंटीबॉडी दाग

  1. तालिका 1में सूचीबद्ध एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें।
    नोट: इन एंटीबॉडी कॉकटेलको पहले14,15,16अनुकूलित किया गया है .
  2. स्वस्थ बीएम युक्त प्रयोगात्मक ट्यूबों के अंतिम mitochondrial ROS डाई धोने से supernatant aspirate और प्रत्येक ट्यूब के लिए #1 एंटीबॉडी कॉकटेल के 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. मिश्रण करने के लिए भंवर. इसके अलावा एकल रंग नियंत्रण ट्यूब तैयार करते हैं। अंधेरे में बर्फ पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. ल्यूकेमिया बीएम युक्त प्रयोगात्मक ट्यूबों के अंतिम mitochondrial ROS डाई धोने से supernatant aspirate और प्रत्येक ट्यूब के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल #2 के 200 डिग्री एल जोड़ें। मिश्रण करने के लिए भंवर. अंधेरे में बर्फ पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. आरटी पर 300 x ग्राम पर 1.0 एमएल ठंड एफ-पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के साथ धोएं।
  5. ठंड एफ-पीबीएस के 500 डिग्री एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और समुच्चय को बाहर करने के लिए एक 40 डिग्री मीटर फिल्टर का उपयोग करके एक प्रवाह साइटोमीटर ट्यूब में कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।

4. प्रवाह साइटोमेट्री अधिग्रहण और विश्लेषण

नोट: कई hematopoietic स्टेम और जनक सबसेट दुर्लभ हैं, इस तरह के दीर्घकालिक hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के रूप में. इस प्रकार, आदर्श रूप से 3-5 लाख घटनाओं विभिन्न HSPC सबसेट में mitochondrial ROS के पर्याप्त विश्लेषण के लिए प्रवाह साइटोमेट्री अधिग्रहण के दौरान प्रत्येक प्रयोगात्मक ट्यूब के लिए एकत्र किया जाना चाहिए.

  1. आगे सेट करने के लिए कोई दाग नियंत्रण ट्यूब का उपयोग करें (FSC-A) और पक्ष (SSC-A) विश्लेषण सेल आबादी के आकार और जटिलता के आधार पर तितर बितर भूखंडों.
  2. प्रवाह cytometer क्षतिपूर्ति करने के लिए कोई दाग और एकल रंग नियंत्रण ट्यूबों का प्रयोग करें.
  3. आगे और साइड तितर बितर साजिश से बाहरी मलबे बाहर गेट (चित्र 2ए, बी, बाएं से पहले पैनल).
  4. गेट आउट डबलेट का उपयोग करते हुए डबल डिबलिंग जैसे कि फॉरवर्ड डिभिकर(चित्र 2ए, बी, बाएं से दूसरा पैनल)।
  5. चित्रा 2Aमें प्रस्तावित gating रणनीति का पालन करें,बी लाइव कोशिकाओं, वंश कम कोशिकाओं और विभिन्न HSPC और ल्यूकेमिया सबसेट का चयन करने के लिए।
  6. ब्याज की प्रत्येक जनसंख्या के लिए, एक हिस्टोग्राम साजिश में TRPE चैनल (x-अक्ष) के मध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता (MFI) का विश्लेषण करने के लिए mitochondrial ROS संकेत में अंतर का मूल्यांकन (चित्र 3ए -सी,बाएँ पैनल). Mitochondrial ROS के स्तर एक तितर बितर साजिश में विशिष्ट वंश मार्करों बनाम mitochondrial ROS धुंधला तुलना द्वारा एकल सेल स्तर पर मूल्यांकन किया जा सकता है.

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Representative Results

प्रस्तुत कई स्वस्थ और MLL-AF9-expressing ल्यूकेमिया जनक आबादी के mitochondria में ROS का विश्लेषण करने के लिए एक विधि है. चित्र 1 प्रोटोकॉल कार्यप्रवाह का एक योजनाबद्ध दृश्य प्रदर्शित करता है, जिसमें 4 प्रमुख चरण होते हैं: 1) चूहों से BM अलगाव; 2) एक fluorogenic डाई है कि mitochondrial ROS, विशेष रूप से superoxides पहचानता है के साथ बीएम कोशिकाओं दाग; 3) सतह मार्कर एंटीबॉडी विभिन्न स्वस्थ और ल्यूकेमिया hematopoietic आबादी को रेखांकित करने के लिए धुंधला; और 4) प्रवाह साइटोमेट्री अधिग्रहण और विश्लेषण.

चित्र 2 ए, बी स्वस्थ और ल्यूकेमिया बीएम में विभिन्न hematopoietic स्टेम और संतति आबादी का विश्लेषण करने के लिए एक प्रतिनिधि gating रणनीति को दर्शाया गया है। मलबे को खत्म करने के लिए एक FSC/SSC प्लॉट लागू किया जाता है और एक FSC-क्षेत्र (FSC-A) बनाम FSC-ऊँचाई (FSC-H) प्लॉट का उपयोग डबलट्स और समुच्चयों को बाहर करने के लिए किया जाता है। वंश की सतह मार्करों का एक पैनल(तालिका 1 और चरण 3.1) को विभिन्न प्रकार की परिपक्व हेमेटोपोईटिक आबादी को बाहर करने के लिए जोड़ा जाता है जैसे लिम्फोसाइट्स, एरिथ्रोसाइट्स, ग्रैन्युसाइट्स और मोनोसाइट्स/ वंश कॉकटेल भी एक CD48 एंटीबॉडी भी शामिल है और इसलिए वंश कम कोशिकाओं के सभी सबसेट भी CD48 हैं-. Sca-1 और c-Kit सेल सतह अभिव्यक्ति HSPCs के एक विषम मिश्रण भेद करने के लिए प्रयोग किया जाता है CD48 कहा जाता है- LSKs (लिनकम, Sca-1+, सी किट+, CD48- )माइलॉयड संततिसेनेत से (Linकम, Sca-1- , c-किट+, CD48- ). विभिन्न एचएसपीसी सबसेटों को अलग करने के लिए SLAM मार्कर , CD150 के साथ-साथ CD34 भी 17 ,18,19,20,21को भी जोड़ा जाता है . चित्र 2 बी भी cKit उच्च व्यक्त ल्यूकेमिया जनक के लिए एक प्रतिनिधि gating रणनीति को दर्शाया गया है (लिनकम, सी-किटउच्च; Sca-1-), जो ल्यूकेमिया की शुरुआत कोशिकाओं के लिए समृद्ध कर रहे हैं (LICs)11 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ल्यूकेमिया कोशिकाओं cKit के मध्यवर्ती कम अभिव्यक्ति व्यक्त (cKitInt-low).

स्वस्थ CD48 - LSK और माइलॉयड संतति के बीच mitochondrial ROS धुंधला की तुलना से पता चलता है कि माइलॉयड संततिकार mitochondrial ROS धुंधला के काफी उच्च स्तर प्रदर्शित (चित्र 3ए) . इसके अलावा, cKitउच्च ल्यूकेमिया संतति CD48 की तुलना में mitochondrial ROS धुंधला की काफी उच्च स्तर प्रदर्शित- LSK, माइलॉयड जनक या cKitint-कम ल्यूकेमिया कोशिकाओं (चित्र ासा3ए). cKitInt-कम ल्यूकेमिया कोशिकाओं को भी काफी उच्च mitochondrial ROS CD48 की तुलना में धुंधला प्रदर्शित- LSK कोशिकाओं लेकिन माइलॉयड संतानों के लिए नहीं (चित्र 3ए). LSKs आगे CD150 अभिव्यक्ति द्वारा उप विभाजित पता चला है कि mitochondrial ROS धुंधला CD48 में काफी भिन्न नहीं था- LSK कोशिकाओं CD150 उच्च द्वारा उप विभाजित (CD150उच्च), मध्यवर्ती (CD150Int) या कोई (CD150नेग) व्यंजक (चित्र 3ठ) हालांकि, स्थिर राज्य mitochondrial ROS cKitउच्च या cKitInt-कम ल्यूकेमिया कोशिकाओं के धुंधला CD48 की तुलना में काफी अधिक पाया गया था- LSKs-CD150उच्च, -CD150Int या -CD150नेग कोशिकाओं ( चित्र 3ठ) LSK कोशिकाओं CD34 के कोई स्तर के लिए कम व्यक्त करने के लिए लंबे समय तक recontitutic स्टेम कोशिकाओं, विशेष रूप से CD48- LSK कोशिकाओं कि CD34हैं - और CD150उच्च20,21के पुनर्गठन के लिए समृद्ध हैं. हालांकि, CD48 subdividing- LSK कोशिकाओं CD150 और CD34 अभिव्यक्ति द्वारा mitochondrial ROS इन छह HSPC सबसेट के बीच धुंधला में कोई महत्वपूर्ण अंतर प्रकट नहीं किया (चित्र 3सी).

Figure 1
चित्र 1 : प्रोटोकॉल काम प्रवाह के Schematic प्रतिनिधित्व. चरण 1) स्वस्थ और MLL-AF9 ल्यूकेमिक चूहों से बीएम अलगाव; चरण 2) एक mitochondrial ROS डाई (mROS) का उपयोग कर सेलुलर धुंधला; चरण 3) स्वस्थ और ल्यूकेमिक चूहों में हेमाटोपोइटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं (एचपीएससी) आबादी में भेदभाव करने के लिए फ्लोरोक्रोम से जुड़े मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ सेलुलर धुंधला; चरण 4) प्रवाह Cytometry अधिग्रहण और कई HSPC आबादी में mitochondrial ROS के विश्लेषण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : प्रवाह साइटोमेट्री स्वस्थ और MLL-AF9-व्यय अस्थि मज्जा कोशिकाओं के लिए रणनीतियों gating. (ए) स्वस्थ चूहों से अलग बीएम कोशिकाओं को एक जीवित / मृत डाई (QDot), mitochondrial ROS डाई (TRPE) के साथ दाग थे. स्वस्थ चूहों से बीएम बाद में एंटीबॉडी पहचानने वंश मार्करों प्लस CD48 (Cy5-पीई), सी-किट (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC) के साथ दाग ासाकीर्द की गई थी. (बी) लाइव/डेड सेल और माइटोकोंड्रिया रोस दाग के अलावा, ल्यूकेमिया चूहों से बीएम भी एंटीबॉडी पहचानने वंश मार्करों प्लस CD48 (Cy5-PE), सी-किट (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue) और CD45.2 (APC), जो भेदभाव करने के लिए लागू किया जाता है के साथ दाग थे स्वस्थ प्राप्तकर्ता बीएम कोशिकाओं (CD45.1) से MLL-AF9 ल्यूकेमिया कोशिकाओं के बीच। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : स्वस्थ और MLL-AF9 अस्थि मज्जा में Mitochondrial ROS स्तर. बाएँ पैनल ों संकेत आबादी के mitochondrial ROS स्तर के प्रतिनिधि histograms हैं और संबंधित सही पैनलों संकेत आबादी के लिए mitochondrial ROS के MFI के बार ग्राफ विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करते हैं (एन $ 4). (ए) स्वस्थ CD48 में mitochondrial ROS स्तर की तुलना- LSK, माइलॉयड संतानों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से MLL-AF9 लिनकम सी-किटउच्च और MLL-AF9 लिनकम सी-किटInt-कम कोशिकाओं. (बी) स्वस्थ CD48 में mitochondrial ROS स्तर की तुलना- LSK कोशिकाओं उनकी CD150 अभिव्यक्ति बनाम MLL-AF9 लिनकम सी-किटउच्च और MLL-AF9 लिनकम सी-किटInt-कम कोशिकाओं के आधार पर. (ग)स्वस्थ CD48 में mitochondrial ROS स्तर की तुलना- LSK कोशिकाओं उनके CD150 और CD34 अभिव्यक्ति के आधार पर. (* p$0.05; ** p andlt; 0.01 * * p और lt; 0.001; ** * p;lt; 0.0001). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : समर्थक और एंटी ऑक्सीडेंट यौगिकों का उपयोग कर mitochondrial ROS स्तर में परिवर्तन. स्वस्थ और एमएलएल-एएफ 9-दफ्तव्यक्त बीएम कोशिकाओं में माइटोकोंड्रियाल आरओएस के हिस्टोग्राम, जिसमें 1 0 डिग्री सेल्सियस सोडियम बिस्सल्फेट (एमएसबी) के साथ इलाज किया गया है, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर (सकारात्मक नियंत्रण) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए या एमएसबी के 20 0 डिग्री एम के साथ 100 डिग्री सेल्सियस के संयोजन में। एन-ऐसीटिल-एल-सिस्टीन (एनएसी) के लिए 1 एच पर 37 डिग्री सेल्सियस में 5% सीओ2 इनक्यूबेटर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : माइटोकोंड्रिल आरओएस और वंश-पहचान एंटीबॉडी दाग का अनुकूलन। (ए) एमएलएल-एएफ9 में माइटोकोंड्रियाल रोस (एमROS) के स्तर की तुलना 1 या 5 $M का उपयोग करके ल्यूकेमिया कोशिकाओं को 1 या 5 मिनट के लिए व्यक्त करता है। ब्लू जेड एमएसबी 20 डिग्री एम; ग्रीन जेड NAC 100 $M; ऑरेंज - Msb 20 डिग्री एम + एनएसी 100 डिग्री सेल्सियस)। (बी) स्वस्थ LSKs में CD34 चैनल (FITC) के MFI की तुलना 20, 60 या 90 मिनट के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल #1 के साथ दाग (एन $ 4, * पी $ 0.05; * * पी और lt; 0.01). (ग) 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेशन से पहले या बाद में दाग लगाने वाले एंटीबॉडी की तुलना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : mitochondrial ROS और वंश मार्कर एंटीबॉडी दाग के आदेश. ((क)दाग के विभिन्न आदेशों का उपयोग करके प्राप्त की गई संकेतित HSPCs की जनसंख्या के डॉट भूखंडों। (ख) एल एस के और माइलॉयड जनक डिब्बों में मूल्यांकन किए गए माइटोकोंड्रिल रोएस स्तरों में दाग के विभिन्न क्रम का उपयोग किया जाता है (लाल ] एंटीबॉडी दाग के लिए 1 h पर 4 डिग्री सेल्सियस और उसके बाद माइटोकोंड्रियाल ROS दाग 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए; ब्लू - माइटोकोंड्रियाल रोस्ट 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए दाग और उसके बाद एंटीबॉडी 4 डिग्री सेल्सियस पर 1h दाग। (ग) माइटोकोंड्रिल रोएस (एमROS) के एमएफआई का परिमाणीकरण, संकेतित जनसंख्या में धुंधला करने के विभिन्न आदेशों का उपयोग करते हुए धुंधला करना (द र् 4, * च ] 0ण्5)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7 : mitochondrial ROS पर verapamil उपचार का प्रभाव स्वस्थ और MLL-AF9-एक्सप्रिंग बीएम कोशिकाओं में धुंधला रंग. (क)संकेतित एचएसपीसी की आबादी के डॉट भूखंडों के साथ या बिना इलाज के नमूनों में 50 डिग्री एम वेरापैमिल के लिए 10 मिनट पर 37 डिग्री सेल्सियस में एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में. (बी) माइटोकोंड्रियाल रोओएस और मिटोमास ग्रीन डाई के हिस्टोग्राम, 50 डिग्री एम वेरापैमिल की उपस्थिति (नीले) या अनुपस्थिति (लाल) में संकेतित एचएसपीसी आबादी में धुंधला। (सी-ई) संकेत स्वस्थ में mitochondrial ROS स्तर की मात्रा (सी और डी) और ल्यूकेमिया (ई) बी.एम नमूनों में सेल आबादी के साथ या बिना इलाज 50 $M Verapamil mitochondrial ROS धुंधला के दौरान (एन $ 4, * पी $ 0.05). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1: एंटीबॉडी कॉकटेल| चरण 3.1 में तैयार एंटीबॉडी कॉकटेल की सूची। स्वस्थ और ल्यूकेमिया अस्थि मज्जा के भीतर विभिन्न hematopoietic उप आबादी की पहचान करने के लिए।

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Discussion

आरओएस का पता लगाने के लिए विकसित किए गए फ्लोरोरोजेनिक रंगों का अक्सर स्थिर कोशिकाओं में माइक्रोस्कोपी या प्रवाह साइटोमेट्री22द्वारा जीवित कोशिकाओं में मूल्यांकन किया जाता है। फ्लो साइटोमेट्रिक बी एम कोशिकाओं में mitochondrial ROS के मूल्यांकन mitochondrial ROS fluorogenic रंगों का उपयोग कर दो प्रमुख लाभ है: 1) यह एक तेज और सरल तकनीक है कि लाइव सेल विश्लेषण के लिए उपयुक्त है और 2) यह भेद और दुर्लभ विश्लेषण के लिए अनुमति देता है सतह मार्कर धुंधला का उपयोग कर बी एम में एकल सेल स्तर पर आबादी. यहाँ प्रस्तुत कदम दर कदम प्रोटोकॉल दोनों स्वस्थ चूहों से hematopoietic स्टेम और संतति आबादी के पूर्व vivo redox स्थिति का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से MlL-AF9 द्वारा संचालित एएमएल के एक माउस मॉडल प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर. इस प्रोटोकॉल के निष्पादन के दौरान विचार करने की आवश्यकता है जो कई महत्वपूर्ण तकनीकी चर हैं।

सबसे पहले, समर्थक और एंटी ऑक्सीडेंट नियंत्रण का उपयोग उपयोगकर्ता mitochondrial ROS धुंधला में वृद्धि के लिए एक आधार रेखा स्थापित करने के साथ ही दाग की विशिष्टता की अनुमति देता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए, समर्थक ऑक्सीडेंट MSB दोनों स्वस्थ और ल्यूकेमिया बीएम कोशिकाओं में mitochondrial ROS धुंधला का एक डिटेक्टेबल प्रेरण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था (चित्र 4). एंटी ऑक्सीडेंट NAC एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि यह काफी हद तक MITOCHONDRIAl ROS MSB द्वारा प्रेरित धुंधला रिवर्स (चित्र 4) .

दूसरा, इस अध्ययन में कार्यरत माइटोकोंड्रिल आरओएस फ्लोरोरोजेनिक डाई को 10 मिनट के लिए 5 डिग्री सेल्सियस की एकाग्रता में उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, निर्माता भी पता चलता है कि एकाग्रता और धुंधला के समय सेल प्रकार के बीच भिन्न हो सकते हैं. इस अध्ययन में, mitochondrial ROS धुंधला दोनों 1 डिग्री सेल्सियस और 5 $M या तो 10 या 30 मिनट के लिए तुलना में किया गया था. विश्लेषण से पता चला कि या तो 10 से 30 मिनट के लिए 5 डिग्री सेल्सियस की सांद्रता mitochondrial ROS में MSB-मध्यस्थ परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त है और साथ ही उन NAC उपचार द्वारा उलट (चित्र 5A) . के बाद से वहाँ 10 और 30 मिनट के बीच कोई मात्रात्मक अंतर था, 10 मिनट के एक धुंधला समय इस अध्ययन के लिए परख की लंबाई को कम करने के लिए चुना गया था.

तीसरा, सीडी 34 एंटीबॉडी ऊष्मायन समय साहित्य के भीतर 20 से 90 मिनट23,24से भिन्न होता है . यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए, murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं एंटीबॉडी कॉकटेल #1 के साथ incubated थे (चरण 3.1) के लिए 20, 60 या 90 मिनट. चित्रा 5Bमें दिखाया गया है, काफी मजबूत CD34 धुंधला 20 मिनट दाग के साथ तुलना में 60 या 90 मिनट के लिए दाग कोशिकाओं पर मनाया गया. तथापि, सीडी34 अभिरंजन में एक महत्वपूर्ण अंतर 60 और 90 मिनट के एंटीबॉडी ऊष्मायन समय के बीच नहीं देखा गया था (चित्र 5ख) और इस प्रकार प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए 60 मिनट एंटीबॉडी दाग की सिफारिश की जाती है।

चौथा, प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, दोनों स्वस्थ और ल्यूकेमिया कोशिकाओं को पहले mitochondrial ROS fluorogenic डाई के साथ दाग रहे हैं, धोया और फिर फ्लोरोक्रोम से जुड़े वंश एंटीबॉडी के साथ दाग. हालांकि वंश एंटीबॉडी के साथ mitochondrial ROS दाग के संयोजन का एक सीधा मूल्यांकन इस अध्ययन में आयोजित नहीं किया गया था, fluorochrome से जुड़े वंश एंटीबॉडी दाग का एक मूल्यांकन के लिए mitochondrial ROS दाग शर्तों के तहत परख गया था 10, 20 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट। इस विश्लेषण से पता चला कि 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट ऊष्मायन काफी हद तक वंश की सतह मार्कर धुंधला (चित्र 5 ब्) को बदल देता है । इसके अतिरिक्त, mitochondrial ROS धुंधला पहले द्वारा मूल्यांकन किया गया था, फ्लोरोक्रोम से जुड़े वंश एंटीबॉडी के साथ स्वस्थ बीएम कोशिकाओं धुंधला mitochondrial ROS fluorogenic डाई के साथ धुंधला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आपरेशन के विपरीत आदेश के बाद. पहले वंश एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं mitochondrial ROS धुंधला द्वारा पीछा किया कम mitochondrial ROS संकेतों के विपरीत इसके विपरीत धुंधला प्रोटोकॉल की तुलना में परिणाम हुआ ( चित्र6A, बी) - CD48 के लिए महत्वपूर्ण मतभेद सहित- LSK CD150उच्च, CD48- LSK CD150Int CD34 और myeloid जनक आबादी (चित्र 6C) .

पांचवें, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि विभिन्न murine स्वस्थ HSPC आबादी efflux कई mitochondrial धुंधला फ्लोरोजेनिक जांच के लिए अलग क्षमताओं के अधिकारी ऐसे mitochondrial द्रव्यमान का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया के रूप में (बाद में mitoMASS हरे रंग के रूप में संदर्भित) या संभावित25,26. इसलिए, mitochondrial ROS fluorogenic डाई के साथ स्वस्थ और ल्यूकेमिया जनकों के धुंधला पर efflux पंप अवरोधकरनेवाला verapamil के प्रभाव का भी मूल्यांकन किया गया था. Mitochondrial ROS के साथ HSPCs के एक साथ दाग वंश मार्कर एंटीबॉडी दाग (चित्र 7A)में परिवर्तन नहीं किया, हालांकि, verapamil काफी स्वस्थ और ल्यूकेमिया की एक किस्म में mitochondrial ROS धुंधला संकेतों में सुधार किया संतति की जनसंख्या (चित्र 7ठ, ब्)। विशेष रूप से, verpamil द्वारा दाग सुधार mitochondrial ROS के परिमाण के रूप में महान नहीं था कि mitoMASS हरी fluorogenic डाई के साथ देखा (चित्र 7B).

छठी, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, बीएम कोशिकाओं हड्डी युक्तियाँ (एपिफिसिस) हड्डियों के फ्लशिंग के बाद को हटाने के द्वारा बरामद किया गया. हालांकि, एपिफिसिस में हेमेटोपोएटिक कोशिकाएं होती हैं जो हड्डी फ्लशिंग से संभावित रूप से खो सकती हैं। एक विकल्प के रूप में, बीएम कोशिकाओं को एक मोर्टार और मूसल के साथ हड्डियों को मैश करके निकाला जा सकता है जैसा कि पहले12,13वर्णित किया गया था .

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल जीवित जीवों से निकाले गए जीवित कोशिकाओं में intracellular redox जीव विज्ञान को मापने के लिए फ्लोरोजेनिक रंगों के उपयोग के लिए एक नींव प्रदान करता है। हालांकि, यह ध्यान दें कि कोई भी एक fluorogenic डाई निश्चित विशिष्ट माना जा सकता है और इसलिए वैकल्पिक तरीकों के साथ अतिरिक्त अध्ययन किसी भी निष्कर्ष को सत्यापित करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, इस अध्ययन के परिणामों का सुझाव है कि ल्यूकेमिया सेल आबादी LICs के लिए समृद्ध (यानी, लिनकम cKitउच्च) स्वस्थ माइलॉयड संतान ों या अन्य HSPC आबादी की तुलना में mitochondrial ROS के उच्च स्तर प्रदर्शित करते हैं. हालांकि, लिनकम cKitउच्च ल्यूकेमिया सेल जनसंख्या यहाँ मूल्यांकन विषम होना दिखाया गया है और आगे अन्य वंश मार्करों11,27द्वारा उप विभाजित किया जा सकता है. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि LICs एक अलग चयापचय phenotype28के अधिकारी. इसलिए, भविष्य के अध्ययन चयापचय assays या जांच के साथ समानांतर में mitochondrial ROS का आकलन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अतिरिक्त वंश मार्कर एंटीबॉडी जानकारीपूर्ण हो जाएगा.

यह सीधा प्रोटोकॉल रहने वाले hematopoietic कोशिकाओं में mitochondrial ROS स्तर की माप के लिए अनुमति देता है और स्वस्थ और रोगग्रस्त स्टेम और संतति कोशिकाओं के redox जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए रेडॉक्स-लक्ष्यीकरण चिकित्सा.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम फॉक्स चेस कैंसर सेंटर बोर्ड ऑफ डायरेक्टर्स (DDM), अमेरिकन सोसायटी ऑफ हेमेटोलॉजी स्कॉलर अवार्ड (एसएमएस), अमेरिकन कैंसर सोसायटी आरएसजी (एसएमएस) और रक्षा विभाग (पुरस्कार: W81XWH-18-1-0472) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat inactivated FBS VWR Seradigm LIFE SCIENCE 97068-085 Media
Penicillin Streptomycin Corning 30-002-CI Media
PBS Fisher Scientific BP399-20 Buffer
15 mL conical tube BD falcon 352096 Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube BD falcon 352098 Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers Fisher Scientific 22-363-547 Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer Fisher Scientific 50-112-9751 Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite Sigma aldrich M5750 Pro-oxidant
NAC Sigma aldrich A7250 Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 Biolegend 100310 Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 eBioscience 15-0041-81 Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 eBioscience 15-0081-81 Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5 Biolegend 115510 Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 Biolegend 103210 Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 Biolegend 108410 Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 Biolegend 116210 Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 Biolegend 103420 Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8 Biolegend 105825 Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7 Biolegend 108120 Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2 Biolegend 115909 Antibody
CD34 FITC clone RAM34 BD Bioscience 553733 Antibody
CD45.2 APC clone 104 Biolegend 1098313 Antibody
MitoSOX Red ThermoFisher Scientific M36008 Dye
Mitotracker Green ThermoFisher Scientific M7514 Dye
Live/dead Yellow Dye ThermoFisher Scientific L34967 Dye

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References

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Di Marcantonio, D., Sykes, S. M. Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia. J. Vis. Exp. (151), e59593, doi:10.3791/59593 (2019).

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