Summary
Bei dieser Methode quantifizieren wir die Bindungsaffinität von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) zu kognazierenden und nicht-kogatierten Bindungsstellen mit einem einfachen, live, Reporter-Assay in Bakterienzellen. Der Test basiert auf der Unterdrückung eines Reportergens.
Abstract
Im Initiationsschritt der Proteintranslation bindet das Ribosom an den Initiationsbereich der mRNA. Die Translationsinitiation kann durch Bindung eines RNA-bindenden Proteins (RBP) an den Initiationsbereich der mRNA blockiert werden, der die Ribosome-Bindung stört. In der vorgestellten Methode nutzen wir dieses Blockierungsphänomen, um die Bindungsaffinität von RBPs zu ihren kognitierten und nicht kognierten Bindungsstellen zu quantifizieren. Dazu fügen wir eine Testbindungsstelle im Initiationsbereich einer Reporter-mRNA ein und induzieren die Expression des Test-RBP. Bei der RBP-RNA-Bindung beobachteten wir eine sigmoidale Unterdrückung des Reporterausdrucks als Funktion der RBP-Konzentration. Bei no-affinity oder sehr geringer Affinität zwischen Bindungsseite und RBP wurde keine signifikante Repression beobachtet. Die Methode wird in lebenden Bakterienzellen durchgeführt und erfordert keine teuren oder ausgeklügelten Maschinen. Es ist nützlich für die Quantifizierung und den Vergleich zwischen den Bindungsaffinitäten verschiedener RBPs, die in Bakterien funktionsfähig sind, zu einer Reihe von entworfenen Bindungsstellen. Diese Methode kann für die Bindung von Standorten mit hoher struktureller Komplexität ungeeignet sein. Dies ist auf die Möglichkeit der Unterdrückung der ribosomalen Initiation durch komplexe mRNA-Struktur in Abwesenheit von RBP zurückzuführen, was zu einer niedrigeren Basalreporter-Genexpression und damit zu einer weniger beobachtbaren Reporterrepression auf DIE RBP-Bindung führen würde.
Introduction
Die RNA-bindende Protein-basierte posttranskriptionelle Regulation, speziell die Charakterisierung der Interaktion zwischen RBPs und RNA, wurde in den letzten Jahrzehnten ausgiebig untersucht. Es gibt mehrere Beispiele für translationale Down-Regulierung bei Bakterien, die von RBPs stammen, die Ribosombindung1,2,3hemmen oder direkt mit ihnen konkurrieren. Im Bereich der synthetischen Biologie entwickeln sich RBP-RNA-Wechselwirkungen zu einem bedeutenden Werkzeug für die Entwicklung von Transkriptionsbasierten genetischen Schaltkreisen4,5. Daher steigt die Nachfrage nach Charakterisierung solcher RBP-RNA-Wechselwirkungen im zellulären Kontext.
Die gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung von Protein-RNA-Wechselwirkungen sind der elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA)6, der auf In-vitro-Einstellungen beschränkt ist, und verschiedene Pull-Down-Assays7, einschließlich der CLIP-Methode8,9 . Während solche Methoden die Entdeckung von de novo RNA-Bindungsstellen ermöglichen, leiden sie unter Nachteilen wie arbeitsintensiven Protokollen und teuren tiefen Sequenzierungsreaktionen und erfordern möglicherweise einen spezifischen Antikörper für RBP-Pull-down. Aufgrund der anfälligen Natur der RNA für ihre Umgebung können viele Faktoren RBP-RNA-Wechselwirkungen beeinflussen, was die Bedeutung der Rekation der RBP-RNA-Bindung im zellulären Kontext unterstreicht. Zum Beispiel haben wir und andere signifikante Unterschiede zwischen RNA-Strukturen in vivo und in vitro10,11gezeigt.
Basierend auf dem Ansatz einer früheren Studie12, haben wir vor kurzem10 gezeigt, dass bei der Platzierung vorgefertigter Bindungsstellen für die Kapsid-RBPs aus den Bakteriophagen GA13, MS214, PP715und Q.16 in der ÜbersetzungInitiationsregion eines Reporters mRNA, Reporter Ausdruck wird stark unterdrückt. Wir präsentieren eine relativ einfache und quantitative Methode, basierend auf diesem Repressionsphänomen, um die Affinität zwischen RBPs und ihrer entsprechenden RNA-Bindungsstelle in vivo zu messen.
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Protocol
1. Systemvorbereitung
- Design von Bindungs-Standort-Plasmiden
- Entwerfen Sie die Bindungsplatzkassette wie in Abbildung 1dargestellt. Jedes Minigen enthält die folgenden Teile (5' bis 3'): Eagl-Restriktionsstelle, 40 Basen des 5'-Endes des Kanamycin-Resistenzgens, pLac-Ara-Promotor, Ribosomenbindungsstelle (RBS), AUG des mCherry-Gens, ein Abstandsabstand , eine RBP-Bindungsstelle, 80 Basen des 5'-Ens des mCherry-Gens und einer ApaLI-Einschränkungsseite.
HINWEIS: Um die Erfolgsrate des Assays zu erhöhen, entwerfen Sie drei Bindungs-Seitenkassetten für jede Bindungsstelle, mit Abstandshaltern, die aus mindestens einer, zwei und drei Basen bestehen. Weitere Richtlinien finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
- Entwerfen Sie die Bindungsplatzkassette wie in Abbildung 1dargestellt. Jedes Minigen enthält die folgenden Teile (5' bis 3'): Eagl-Restriktionsstelle, 40 Basen des 5'-Endes des Kanamycin-Resistenzgens, pLac-Ara-Promotor, Ribosomenbindungsstelle (RBS), AUG des mCherry-Gens, ein Abstandsabstand , eine RBP-Bindungsstelle, 80 Basen des 5'-Ens des mCherry-Gens und einer ApaLI-Einschränkungsseite.
- Klonen von Bindungsstellenplasmiden
- Bestellen Sie die Bindungsplatzkassetten als doppelsträngige DNA(dsDNA) Minigene. Jedes Minigen ist 500 bp lang und enthält eine Eagl-Einschränkungsseite und eine ApaLI-Einschränkungsstelle an den Enden 5' bzw. 3' (siehe Schritt 1.1.1).
HINWEIS: In diesem Experiment wurden Minigene mit der Hälfte des Kanamycin-Gens bestellt, um das Screening auf positive Kolonien zu erleichtern. Allerdings eignet sich hier auch die Gibson-Baugruppe17, in diesem Fall kann die Bindungsstelle als zwei kürzere komplementäre einsträngige DNA-Oligos bestellt werden. - Doppelverdauen Sie sowohl die Minigene als auch den Zielvektor mit Eagl-HF und ApaLI durch das Restriktionsprotokoll18und Spaltenreinigung19.
- Ligate die verdauten Minigene an das Bindungs-Standort-Rückgrat, das den Rest des mCherry-Reportergens, Terminator und ein Kanamycin-Resistenzgen20enthält.
- Verwandeln Sie die Ligationslösung in Escherichia coli TOP10 Zellen21.
- Identifizieren Sie positive Transformationsmittel über die Sanger-Sequenzierung.
- Entwerfen Sie eine Grundierung 100 Basen vor dem Interessengebiet (siehe Tabelle 1 für Primersequenzen).
- Miniprep ein paar Bakterienkolonien22.
- Bereiten Sie 5 l einer 5 mM-Lösung des Primers und 10 l der DNA bei 80 ng/l Konzentration vor.
- Senden Sie die beiden Lösungen an eine praktische Einrichtung für Sanger-Sequenzierung23.
- Speichern Sie gereinigte Plasmide bei -20 °C und Bakterienstämme als Glycerinbestände24, beide im 96-Well-Format. DIE DNA wird dann zur Umwandlung in E. coli TOP10-Zellen verwendet, die eines von vier Fusions-RBP-Plasmiden enthalten (siehe Schritt 1.3.5).
- Bestellen Sie die Bindungsplatzkassetten als doppelsträngige DNA(dsDNA) Minigene. Jedes Minigen ist 500 bp lang und enthält eine Eagl-Einschränkungsseite und eine ApaLI-Einschränkungsstelle an den Enden 5' bzw. 3' (siehe Schritt 1.1.1).
- Entwurf und Konstruktion des RBP-Plasmids
HINWEIS: Aminosäure- und Nukleotidsequenzen der in dieser Studie verwendeten Mantelproteine sind in Tabelle 2aufgeführt.- Bestellen Sie die erforderliche RBP-Sequenz ohne Stop-Codon als benutzerdefiniertes dsDNA-Minigen ohne Stop-Codon mit Restriktionsstellen an den Enden (Abbildung 1).
- Klonen Sie das getestete RBP ohne Stop-Codon unmittelbar nach einem induzierbaren Promotor und vor einem fluoreszierenden Protein ohne Startcodon (Abbildung 1), ähnlich den Schritten 1.2.2-1.2.4. Stellen Sie sicher, dass das RBP-Plasmid ein anderes Antibiotikaresistenzgen enthält als das Bindungs-Standort-Plasmid.
- Identifizieren Sie positive Transformationsmittel über sanger-Sequenzierung, ähnlich wie Schritt 1.2.5 (siehe Tabelle 1 für Primersequenzen).
- Wählen Sie ein positives Transformant und machen Sie es chemisch kompetent25. Als Glycerin-gereinigte Plasmide bei -20 °C und Glycerinbestände von Bakterienstämmen24 bei -80 °C in 96-Well-Platten lagern.
- Verwandeln Sie die in 96-Well-Platten gelagerten Bindungs-Standort-Plasmide (ab Schritt 1.2.6) in chemisch kompetente Bakterienzellen, die bereits ein RBP-mCerulean-Plasmid21enthalten. Um Zeit zu sparen, anstatt die Zellen auf Petrischalen zu beschichten, bedecken Sie sie mit einem 8-Kanal-Pipettor auf 8-spurigen Platten mit Luria-Bertani (LB)26 Agar mit relevanten Antibiotika (Kan und Amp). Kolonien sollten in 16 h erscheinen.
- Wählen Sie für jedes Doppel-Transformant eine einzelne Kolonie aus und wachsen Sie über Nacht im LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika (Kan und Amp) und lagern Sie als Glycerinbestände24 bei -80 °C in 96-Well-Platten.
2. Experiment-Setup
HINWEIS: Das hier vorgestellte Protokoll wurde mit einem Flüssigkeitshandling-Robotersystem in Kombination mit einem Inkubator und einem Plattenleser durchgeführt. Jede Messung wurde für 24 Induktorkonzentrationen mit zwei Duplikaten für jede Dehnung + Induktor-Kombination durchgeführt. Mit diesem Robotersystem wurden Daten für 16 Stämme pro Tag mit 24 Induktorkonzentrationen gesammelt. Wenn ein solches Gerät jedoch nicht verfügbar ist oder weniger Experimente erforderlich sind, können diese einfach von Hand mit einer 8-Kanal-Multipipetette durchgeführt werden und das Protokoll entsprechend anpassen. So wurden beispielsweise vorläufige Ergebnisse für vier Stämme pro Tag mit 12 Induktorenkonzentrationen und vier Zeitpunkten auf diese Weise ermittelt.
- 1 L Bioassaypuffer (BA) im Voraus durch Mischen von 0,5 g Trypton, 0,3 ml Glycerin, 5,8 g NaCl, 50 ml 1 M MgSO4,1 ml 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 und 950 ml Doppeldestilliertem Wasser (DDW) vorbereiten. Autoklav oder steriler Filter des BA-Puffers.
- Die doppeltransformierenden Stämme bei 37 °C und 250 Umdrehungen pro Minute in 1,5 ml LB mit geeigneten Antibiotika (Kanamycin in einer Endkonzentration von 25 g/ml und Ampicillin bei einer Endkonzentration von 100 g/ml) in 48-Well-Platten über einen Zeitraum von 18 h (Übernachtung) anbauen.
-
Am Morgen die folgenden Vorbereitungen treffen.
- Induktorplatte. In einer sauberen 96-Well-Platte Brunnen mit halbarmem Medium (SPM) zubereiten, bestehend aus 95% BA und 5% LB26 im Inkubator bei 37 °C. Die Anzahl der Brunnen entspricht der gewünschten Anzahl von Induktorkonzentrationen. Fügen Sie C4-HSL zu den Brunnen in der Induktorplatte hinzu, die die höchste Induktorkonzentration (218 nM) enthalten.
- Programmieren Sie den Roboter, um das Medium von jedem der hochkonzentrierten Brunnen in 23 niedrigere Konzentrationen von 0 bis 218 nM zu verdünnen. Das Volumen jeder Induktorverdünnung sollte für alle Stämme (einschließlich Duplikate) ausreichen.
- Während die Induktorenverdünnungen vorbereitet werden, 180 l SPM im Inkubator bei 37 °C in 96-Well-Platten warm.
- Verdünnen Sie die Übernachtstämme von Schritt 2.2 um den Faktor 100 durch serielle Verdünnungen: zuerst um den Faktor 10 verdünnen, indem Sie 100 l Bakterien mit 900 l SPM in 48-Well-Platten mischen und dann um den Faktor 10 erneut verdünnen, indem 20 l aus der verdünnten Lösung in 180 l vorgewärmte SPM, in 96-Well-Platten geeignet für fluoreszierende Messungen.
- Fügen Sie den verdünnten Induktor von der Induktorplatte zu den 96-Well-Platten mit den verdünnten Stämmen entsprechend den Endkonzentrationen hinzu.
- Schütteln Sie die 96-Well-Platten bei 37 °C für 6 h, während Sie Messungen der optischen Dichte bei 595 nm (OD595), mCherry (560 nm/612 nm) und mCerulean (460 nm/510 nm) Fluoreszenz über einen Plattenleser alle 30 min. Messen Sie für Normalisierungszwecke das Wachstum von SMP ohne Zellen.
3. Vorläufige Ergebnisanalyse
- Wählen Sie für jeden Experimenttag ein Zeitintervall des logarithmischen Wachstums entsprechend den gemessenen Wachstumskurven zwischen der linearen Wachstumsphase und der stationären (T0, Tfinal). Nehmen Sie etwa 6 bis 8 Zeitpunkte, während Sie die erste und letzte Messung verwerfen, um Fehler zu vermeiden, die durch Ungenauigkeiten der exponentiellen Wachstumserkennung abgeleitet werden (siehe Abbildung 2A, oberes Panel).
HINWEIS: Verwerfen Sie Stämme, die abnormale Wachstumskurven oder Dehnungen aufweisen, bei denen die logarithmische Wachstumsphase nicht erkannt werden konnte, und wiederholen Sie das Experiment. -
Berechnen Sie die durchschnittliche normalisierte Fluoreszenz von mCerulean und die Produktionsrate von mCherry aus den Rohdaten von mCerulean und mCherry Fluoreszenz für jede Induktorkonzentration (Abbildung 2A).
- Berechnen Sie normalisiertem mCerulean wie folgt:
wobei blank(mCerulean) die mCerulean-Ebene [a.u.] nur für Medium ist, blank(OD) die optische Dichte nur für Medium und mCerulean und OD die mCerulean-Fluoreszenz- bzw. optischedichte Dichtewerte sind. - Durchschnittlicher mCerulean über die verschiedenen Zeitpunkte (Abbildung2B, zwei Top-Panels) wie folgt:
wobei #Time Punkte die Anzahl der berücksichtigten Datenzeitpunkte ist, T0 der Zeitpunkt, zu dem die exponentielle Wachstumsphase beginnt, und Tfinal der Zeitpunkt, zu dem die exponentielle Wachstumsphase endet. - Berechnen Sie die mCherry-Produktionsrate (Abbildung2B, untere zwei Panels) wie folgt:
wobei mCherry(t) die mCherry-Ebene [a.u.] zum Zeitpunkt t, OD der optische Dichtewert, T0 der Zeitpunkt ist, zu dem die exponentielle Wachstumsphase beginnt, und Tfinal ist der Zeitpunkt, zu dem die exponentielle Wachstumsphase endet.
- Berechnen Sie normalisiertem mCerulean wie folgt:
- Schließlich zeichnen Sie die mCherry-Produktionsrate als Funktion von mCerulean, wodurch Dosis-Antwort-Kurven in Abhängigkeit von RBP-mCerulean-Fusionsfluoreszenz erstellt werden (Abbildung 2C). Solche Plots stellen die Produktion des Reportergens als Funktion der RBP-Präsenz in der Zelle dar.
4. Dosis-Response-Funktion Fitting Routine und K RBP-Extraktion
- Unter der Annahme, dass die Ribosomrate der Übersetzung mit der RBP-Gebunden konstant ist, modellieren Sie die mCherry-Produktionsrate wie folgt (siehe Abbildung 2D,grüne Linie):
wobei [x] die normalisierte durchschnittliche mCerulean-Fluoreszenz ist, berechnet nach Eq. 2, mCherry Produktionsrate ist der Wert, der nach Eq. 3 berechnet wird, KRBP ist die relative Bindungsaffinität [a.u.], Kungebunden ist die Ribosomrate von Übersetzung mit dem RBP ungebunden, n ist der Kooperatoritätsfaktor, und C ist die Basisfluoreszenz [a.u.]. C, n, Kunboundund KRBP werden gefunden, indem die mCherry Produktionsratendaten an das Modell anpasst (Eq. 4). - Mit Hilfe der Datenanalyse-Software führen Sie ein Anpassungsverfahren auf Diagrammen durch, die die mCherry-Produktionsrate als Funktion von gemittelten mCerulean (Schritt 3.3) darstellen, und extrahieren Sie die Anpassungsparameter gemäß der Formel in Eq. 4.
HINWEIS: Berücksichtigt werden nur passende Ergebnisse mit R2 > 0,6. Für diese Passte, KRBP Fehler ist meist im Bereich von 0,5% bis 20% der K RBP-Werte, für ein 0,67 Konfidenzintervall, während diejenigen mit höheren KRBP Fehler kann auch durch Auge überprüft werden. - Normalisieren Sie Die K-RBP-Werte um den jeweiligen Maximalwert von gemittelt emCerulean für jede Dosis-Wirkungs-Funktion.
wobei KRBP in [a.u.] der Wert ist, der aus dem Fitting-Verfahren in Eq. 4 extrahiert wird, und max (gemittelt mCerulean) das maximal gemittelte mCerulean-Signal [a.u], das für den aktuellen Stamm beobachtet wird.
HINWEIS: Die Normalisierung erleichtert den korrekten Vergleich der regulatorischen Wirkung über Stämme hinweg, indem die Abhängigkeit von den jeweiligen maximalen RBP-Expressionsebenen beseitigt wird.
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Representative Results
Die vorgestellte Methode nutzt den Wettbewerb zwischen einem RBP und dem Ribosom zur Bindung an das mRNA-Molekül (Abbildung 1). Dieser Wettbewerb spiegelt sich in sinkenden mCherry-Spiegeln als Funktion der erhöhten Produktion von RBP-mCerulean wider, aufgrund steigender Konzentrationen von Induktoren. Im Falle einer zunehmenden mCerulean-Fluoreszenz, ohne signifikante Änderungen in mCherry, wird ein Mangel an RBP-Bindung abgeleitet. Repräsentative Ergebnisse für eine positive und eine negative Belastung sind in Abbildung 2dargestellt. In Abbildung 2Awerden die Kanäle OD, mCherry und mCerulean als Funktion von Zeit und Induktor über einen Bereich von vier Stunden dargestellt, wobei T0 = 1 h und Tfinal = 3,5 h vorliegen. In Abbildung 2Bwerden die durchschnittliche mCerulean-Fluoreszenz (oben) und die mCherry-Produktionsrate (unten) als Funktion der Induktorkonzentration dargestellt, für die beiden Beispielstämme. Wie man sieht, zeigen die Ergebnisse für eine positive Dehnung einen deutlichen Down-Regulierungseffekt in der mCherry-Produktionsrate (Abbildung 2B,C), was sich in einem signifikanten Wert ungleich Null von KRBP (Abbildung 2D) niederschlägt. Für die positive Dehnung ergab das Anpassungsverfahren folgende Werte: KRBP = 394,6 a.u., Kunbound = 275.6, n = 2.1, C = 11.2 a.u. und R2 = 0.93. Nach der Normalisierung durch die maximale mCerulean-Fluoreszenz betrug derK-RBP-Wert 0,24. Für den negativen Stamm wurde ein Mangel an eindeutiger Reaktion beobachtet (Abbildung 2C), und es wurde kein K-RBP-Wert extrahiert (Abbildung 2D).
In Abbildung 3stellen wir die Ergebnisse dieses Testes für zwei Phagenmantel-RBPs, PP7 und MS2, an mehreren mutierten Bindungsstellen an verschiedenen Stellen innerhalb des Initiationsbereichs der mCherry mRNA vor. Die Ergebnisse sind grob in drei Arten von Antworten eingeteilt (Abbildung3A):Stämme, die einen down-regulatorischen Effekt auf einem niedrigen mCerulean-Niveau aufweisen, was einen niedrigenK-RBP-Wert widerspiegelt (hohe Bindungsaffinität); Belastungen mit downregulatorischen Auswirkungen auf mittlerem oder hohem mCerulean-Niveau, die einen hohenK-RBP-Wert (zwischengeschaltete oder niedrige Affinität) widerspiegeln; und Stämme, die keine deutliche Reaktion auf steigende mCerulean-Werte aufweisen, was einen höherenK-RBP-Wert als die maximale RBP-Konzentration in der Zelle widerspiegelt (keine nachweisbare Bindungsaffinität). Abbildung 3B zeigt den minimalen K-RBP-Wert, der für jede RBP-Bindungs-Standort-Kombination basierend auf allen Kombinationen der beiden RBPs und zehn Bindungsstellen an unterschiedlichen Positionen berechnet wird. Die Bindungsstellen umfassen eine Negative Kontrolle (keine Bindungsstelle), nicht übereinstimmende Bindungsstellen und eine positive Kontrolle – die native Bindungsstelle für jeden RBP (PP7-wt für PP7-Beschichtungsprotein [PCP] und MS2-wt für MS2-Beschichtungsprotein [MCP]). Die Ergebnisse stimmen mit den Vorhersagen überein, da beide RBPs eine hohe Affinität zu ihren positiven Steuerelementen und eine nicht erkennbare Bindungsaffinität für die negativen Steuerelemente darstellen. Darüber hinaus haben frühere Studien mit diesen beiden RBPs27,28 beobachtet, dass sie orthogonal sind, was in der vorgestellten Heatmap deutlich vermittelt wird: sowohl MCP als auch PCP binden die native Site des anderen RBP nicht. Darüber hinaus zeigen die mutierten Bindungsstellen unterschiedliche Ergebnisse, wobei einige Bindungsseiten eine ähnliche Affinität wie die native Website aufweisen, z. B. PP7-mut-1, PP7-mut-2 und MS2-mut-3, während andere eine signifikant geringere Affinität aufweisen, z. B. PP7-mut-3 und MS2-mut-2. So präsentierte der Assay eine quantitative In-vivo-Messung der Bindungsaffinität von RBPs, die Ergebnisse lieferte, die mit denen früherer Experimente mit diesen RBPs vergleichbar sind.
Da der Test auf der Unterdrückung des mCherry-Gens basiert, ist ein lebensfähiges mCherry-Signal erforderlich. Daher gibt es beim Entwerfen der Bindungswebsitekassette zwei Entwurfsregeln zu beachten. Zunächst sollte der offene Leserahmen (ORF) des mCherry beibehalten werden. Da die Bindungs-Standortlänge variieren kann, kann das Einfügen in das Gen zu einer Verschiebung von ein oder zwei Basen aus dem ursprünglichen mCherry ORF führen. Fügen Sie daher bei Bedarf (Abbildung4A) eine oder zwei Basen unmittelbar nach der Bindungsstelle ein. Zum Beispiel ergibt eine Bindungsstelle, die 20-Basis lang ist, mit einem Wert von zwei Basen, eine Zugabe von 22 Basen zum mCherry-Gen. Um den ORF zu halten, müssen wir zwei Basen hinzufügen, insgesamt 24 Basen. Die zweite Designregel besteht darin, Einfügungen von Stop-Codons in den mCherry ORF zu vermeiden. Einige Bindungsstellen, wie die MS2-mut-2 (Abbildung 4B, Einset), enthalten Stopp-Codons, wenn sie in einem oder mehreren der drei möglichen ORFs positioniert sind. Ein solches Beispiel ist in Abbildung 4Adargestellt, wo die Bindungsstelle ein Stop-Codon enthielt, das mit dem mCherry ORF nur dann im Rahmen enthalten ist, wenn keine Basen hinzugefügt werden. Wie in der Dosis-Wirkungs-Kurve für diese Position zu sehen ist (Abbildung 4B), war die mCherry-Produktionsrate nicht nachweisbar, so dass die Bindungsaffinität nicht gemessen werden konnte.
Ein genauerer Blick auf Abbildung 4B zeigt die Auswirkungen des Abstands auf die mCherry-Produktion. So war z. B. für die Basalproduktionsrate ein Faktor von sechs mehr als für die für n = 5, was einen höheren Faltenrepressionseffekt gewährleistete. Für die B = 14 waren die Basalproduktionsniveaus jedoch zu niedrig, um einen abwärtsregulierenden Effekt zu beobachten.
Abbildung 1: Übersicht über Systemdesign und Klonschritte. Abbildung des Kassettendesigns für das Bindungs-Plasmid (links) und das RBP-mCerulean-Plasmid (rechts). Der nächste Schritt sind die aufeinanderfolgenden Umwandlungen beider Plasmide in kompetente E. coli-Zellen, wobei zunächst RBP-Plasmide durchgeführt werden. Doppel-Transformants werden dann auf ihre mCherry Expressionsniveaus in steigenden Induktorkonzentrationen getestet; Wenn der RBP an die Bindungsstelle gebunden ist, sinken die mCherry-Ebenen als Funktion von mCerulean (graue Blase). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Analyseschema. (A) Dreidimensionale (3D) Diagramme, die rohe OD-Spiegel (oben), mCerulean-Fluoreszenz (Mitte) und mCherry-Fluoreszenz (unten) als Funktion der Zeit- und Induktorkonzentration für eine positive Dehnung darstellen. (B) Oben: mCerulean Steady-State-Expressions-Levels für jede Induktorkonzentration werden berechnet, indem jedes Fluoreszenzniveau durch die jeweilige OD dividiert und über alle Werte im 2-3 h exponentiellen Wachstumszeitfenster für beide positiven (links) und negative (rechte) Dehnungen. Unten: mCherry Produktionsrate berechnet nach Eq. 3 für Zeitpunkte 2 x 3 h nach Induktion. (C) mCherry Produktionsrate, die in Abhängigkeit von der mittleren mCerulean-Fluoreszenz dargestellt wird, durchschnittlich über zwei biologische Duplikate für zwei Stämme. Fehlerbalken sind Standardabweichungen sowohl der mCherry-Produktionsrate als auch der gemittelten mCerulean-Fluoreszenz, die aus mindestens zwei Replikationen gewonnen wurde. (D) Fit für KRBP unter Verwendung der Fitting-Formel in Eq. 4 für die positive Dehnung (links) mit einer spezifischen Bindungsreaktion. Für den negativen Stamm (rechts) wurde keinK-RBP-Wert extrahiert. Die Daten werden in dupliziert angezeigt. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Katz et al.10angepasst. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Endergebnisse. (A) Normalisierte Dosis-Wirkungs-Kurven für dreißig verschiedene Stämme basierend auf zwei RBPs und zehn Bindungsstellen an verschiedenen Standorten. Es werden drei Arten von Antworten beobachtet: hohe Affinität, geringe Affinität und keine Affinität. (B) Quantitative KRBP-Ergebnisse für zwei RBPs (MCP und PCP) mit fünf verschiedenen Bindungs-Site-Kassetten (aufgeführt). Alle RBP-Bindungs-Standortstämme wurden in doppelter Ausführung gemessen. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Katz et al.10angepasst. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beispielentwurf und Ergebnisse für MCP mit einer mutierten Bindungsstelle. (A) Design-Illustration der Bindungsplatzkassetten an vier verschiedenen Orten. Kassette mit Ribosomenbindung, Startcodon für die mCherry, Spacer Basen, die getestete Bindungsstelle, ein oder zwei Basen zur Aufrechterhaltung des ORF und der Rest des mCherry-Gens. Rote Sterne weisen auf einen Stop-Codon hin. (B) Dosis-Wirkungs-Kurven für MCP mit einer mutierten Bindungsstelle an vier verschiedenen Stellen. Inset: die Reihenfolge der getesteten mutierten Bindungsstelle. Die dargestellten Ergebnisse beziehen sich auf Duplikate jedes Stammes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
name | Standort Binidng, A in AUG = 1 | Bindung sorzierst (RBS für Steuerelemente) | Site: ATG zum zweiten mCherry codon GTG Steuerung: RBS bis zweiter mCherry codon GTG |
Quelle |
MS2_wt_d5 | 5 | acatgaggattacccatgt | atgcacatgaggattacccatgtcgtg | Gen9 Inc. |
MS2_wt_d6 | 6 | acatgaggattacccatgt | atggcacatgaggattacccatgtg | Gen9 Inc. |
MS2_wt_d8 | 8 | acatgaggattacccatgt | atggcgcacatgaggattacccatgt cgtg |
Gen9 Inc. |
MS2_wt_d9 | 9 | acatgaggattacccatgt | atggcgccacatgaggattacccatg tgtg |
Gen9 Inc. |
MS2_U(-5)C_d8 | 8 | acatgaggatcacccatgt | atgcacatgaggatcacccatgtgg Sf |
Gen9 Inc. |
MS2_U(-5)C_d9 | 9 | acatgaggatcacccatgt | atggcacatgaggatcacccatgtg Sf |
Gen9 Inc. |
MS2_U(-5)C_d8 | 8 | acatgaggatgacccatgt | atgcacatgaggatgacccatgtgg Sf |
Gen9 Inc. |
MS2_U(-5)G_d9 | 9 | acatgaggatgacccatgt | atggcacatgaggatgacccatgtg Sf |
Gen9 Inc. |
MS2_struct_d9 | 9 | cacaagaggttcacttatg | atggccacaagaggttcacttatgg Sf |
Gen9 Inc. |
MS2_struct_d8 | 8 | cacaagaggttcacttatg | atgccacaagaggttcacttatggg Sf |
Gen9 Inc. |
PP7wt_d5' | 5 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgctaaggagtttatatggaaacc cttacgtg |
Gen9 Inc. |
PP7wt_d6' | 6 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaataaggagtttatatggaaac ccttagtg |
Twist Bioscience |
PP7wt_d8' | 8 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacataaggagtttatatggaa acccttacgtg |
Twist Bioscience |
PP7wt_d9' | 9 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacaataagtttatatgga aacccttagtg |
Twist Bioscience |
PP7_USLSBm_d6 | 6 | taaccgctttatatggaaagggtta | atggctaaccgctttatatggaag ggttagtg |
Gen9 Inc. |
PP7_USLSBm_d15 | 15 | taaccgctttatatggaaagggtta | atgggcgccggcgctaaccgcttta tatggaaagggttagtg |
Gen9 Inc. |
PP7_nB_d5 | 5 | taagggtttatatggaaaccctta | atgctaagggtttatatggaaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
PP7_nB_d6 | 6 | taagggtttatatggaaaccctta | atggctaagtttatatggaaacc cttatgtg |
Gen9 Inc. |
PP7_USs_d5 | 5 | taaggagttatatggaaccctta | atgctaaggagttatatggaaccct tagtg |
Gen9 Inc. |
PP7_USs_d6 | 6 | taaggagttatatggaaccctta | atggctaaggagttatatggaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
No_BS_d1 | - | - | ttaaagaggagaaagagacccatgg Sf |
Gen9 Inc. |
No_BS_d4 | - | - | ttaaagaggagaaagagacccatgg gcgtg |
Gen9 Inc. |
No_BS_d10 | - | - | ttaaagaggagaaagagacccatgg gcgccggcgtg |
Gen9 Inc. |
Sequenzierungsprimer für Bindungsplatzkassetten | gcatttttatccataagattagcgg | Idt | ||
Sequenzierungsprimer für RBP-Kassetten | gcggcgctggctctcatctaataaa | Idt |
Tabelle 1: Bindungsstellen und Sequenzierungsprimer. Sequenzen für die in dieser Studie verwendeten Bindungsstellen und Bindungsstellenkassetten sowie die Primer für die im Protokoll beschriebenen Sequenzierungsreaktionen (Schritte 1.2.5.1 und 1.3.3).
RBP-Name in dieser Arbeit | Quelle Organismus Name, Protein | Quelle Organismus Gen | Quellorganismus refseq | wt aa seq | Änderungen von wt (und Referenzen) | aa seq in dieser Arbeit verwendet | nt seq wird in dieser Arbeit verwendet |
Mcp | Escherichia-Virus MS2 | Cp | NC_001417.2 | MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGVA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKVATQT VGGVELPVA AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
delF-G [1] V29I [1] entnommen aus Addgenplasmid 27121 |
MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGIA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKG AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
ATGGCTTCTA ACTTTACTCA GTTCGTTCTC GTCGACAATG GCGGAACTGG CGACGTGACT GTCGCCCCAA GCAACTTCGC TAACGGGATC GCTGAATGGA TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA CAGGCTTACA AAGTAACCTG TAGCGTTCGT CAGAGCTCTG CGCAGAATCG CAAATACACC ATCAAAGTCG AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG CGTTCGTACT TAAATATGGA ACTAACCATT CCAATTTTCG CCACGAATTC CGACTGCGAG CTTATTGTTA AGGCAATGCA AGGTCTCCTA AAAGATGGAA ACCCGATTCC CTCAGCAATC GCAGCAAACT CCGGCATCTAC |
Pcp | Pseudomonas Phagen PP7 | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA TRTLTEIQST ADRQIFEEKV GPLVGRLRLT ASLRQNGAKT AYRVNLKLDQ ADVVDCSTSVC GELPKVRYTQ VWSHDVTIVA NSTEASRKSL YDLTKSLVAT SQVEDLVVNL VPLGR |
delF-G [2] entnommen aus Addgenplasmid 40650 |
MLASKTIVLSVG EATRTLTEIQ STADRQIFEE KVGPLVGRLR LTASLRQNGA KTAYRVNLKL DQADVVDSG LPKVRYTQVW SHDVTIVANS TEASRKSLYD LTKSLVATSQ VEDLVVNLVP LGR |
ATGCTAGCCTC CAAAACCATC GTTCTTTCGG TCGGCGAGGC TACTCGCACT CTGACTGAGA TCCAGTCCAC CGCAGACCGT CAGATCTTCG AAGAGAAGGT CGGGCCTCTG GTGGGTCGGC TGCGCCTCAC GGCTTCGCTC CGTCAAAACG GAGCCAAGAC CGCGTATCGC GTCAACCTAA AACTGGATCA GGCGGACGTC GTTGATTCCG GACTTCCGAA AGTGCGCTAC ACTCAGGTAT GGTCGCACGA CGTGACAATC GTTGCGAATA GCACCGAGGC CTCGCGCAAA TCGTTGTACG ATTTGACCAA GTCCCTCGTC GCGACCTCGC AGGTCGAAGA TCTTGTCGTC AACCTTGTGC CGCTGGGCCGT |
Verweise: | |||||||
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Tabelle 2: RBP-Sequenzen. Aminosäure- und Nukleotidsequenzen der in dieser Studie verwendeten Mantelproteine.
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Discussion
Die in diesem Artikel beschriebene Methode erleichtert die quantitative In-vivo-Messung der RBP-RNA-Bindungsaffinität in E. coli-Zellen. Das Protokoll ist relativ einfach und kann ohne den Einsatz ausgeklügelter Maschinen durchgeführt werden, und die Datenanalyse ist einfach. Darüber hinaus werden die Ergebnisse sofort erstellt, ohne die relativ lange Wartezeit, die mit den Ergebnissen der Next Generation Sequencing (NGS) verbunden ist.
Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass es nur in Bakterienzellen funktioniert. Eine frühere Studie12 hat jedoch einen Repressionseffekt mit einem ähnlichen Ansatz für den L7AE RBP in Säugetierzellen nachgewiesen. Eine zusätzliche Einschränkung der Methode besteht darin, dass das Einfügen der Bindungsstelle im mCherry-Initiationsbereich die basalen mCherry-Ebenen unterdrücken kann. Strukturelle Komplexität oder hohe Stabilität der Bindungsstelle kann die ribosomale Initiation auch ohne RBP stören, was zu einem rückgangen mCherry Basalgehalt führt. Wenn die Basalwerte zu niedrig sind, wird die zusätzliche Repression, die durch die erhöhungen RBP-Konzentrationen herbeigeführt wird, nicht zu beobachten sein. In einem solchen Fall ist es am besten, die Bindungsplatzkassette mit der Bindungsstelle noch im Initiierungsbereich zu entwerfen, aber am Rande des Übergangs von der Initiationsregion zur Dehnungsregion (im Bereich von 12 x 15 bp10,29). Wir haben gezeigt, dass bei solchen Werten immer noch ein Repressionseffekt zu beobachten ist. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass der Test unabhängig von der strukturellen Komplexität funktioniert, empfehlen wir, den Test an mindestens drei verschiedenen Positionen für eine bestimmte bindungsstelle durchzuführen.
Der Hauptnachteil der Methode im Vergleich zu In-vitro-Methoden wie EMSA besteht darin, dass die RBP-RNA-Bindungsaffinität nicht in absoluten Einheiten der RBP-Konzentration gemessen wird, sondern in Bezug auf die Fusion-RBP-Fluoreszenz. Dieser Nachteil ist ein direktes Ergebnis der in vivo Einstellung, die unsere Fähigkeit, die tatsächlichen Konzentrationen von RBP auszulesen, einschränkt. Dieser Nachteil wird durch die Vorteile der Messung in der in vivo Einstellung ausgeglichen. Zum Beispiel haben wir Unterschiede in bindungsaffinitäten beim Vergleich der Ergebnisse aus unserem In-vivo-Assay mit früheren In-vitro- und In-situ-Assays gefunden. Diese Unterschiede können auf Unterschiede in der Struktur der mRNA-Moleküle in vivo zurückzuführen sein, die aus ihrer Anwesenheit in den Zellen10,11,30,31entstehen. Solche strukturellen Unterschiede können zu Veränderungen in der Stabilität der gefalteten Zustände in vivo führen, die wiederum die RBP-Bindung entweder stabilisieren oder destabilisieren.
Da die Methode relativ einfach und kostengünstig ist, empfehlen wir, mehrere Steuerelemente neben dem eigentlichen Experiment auszuführen. Das Ausführen einer negativen Kontrolle, d. h. einer Sequenz, die keine Affinität zum RBP hat, aber ähnliche strukturelle Merkmale aufweist, kann dazu beitragen, Fehlalarme zu vermeiden, die aus unspezifischen Wechselwirkungen mit der mRNA resultieren. In den gezeigten repräsentativen Ergebnissen waren die beiden negativen Kontrollen das mCherry-Gen allein (keine Bindungsstelle) und die native Bindungsstelle des anderen RBP (d. h. PP7-wt für MCP und MS2-wt für PCP). Darüber hinaus schlagen wir vor, eine positive Kontrolle (z. B. ein RBP und seine native Bindungsseite) zu integrieren. Eine solche Kontrolle wird dazu beitragen, die Bindungsaffinität zu quantifizieren, indem sie einen Bezugspunkt darstellt und Falschnegative vermeidet, die aus einer geringen Faltenrepression resultieren.
Schließlich schlagen wir für diejenigen, die eine strukturelle Perspektive der RBP-RNA-Bindung erhalten möchten, die Durchführung einer selektiven 2-Hydroxyl-Acylierung durch Primer-Erweiterungssequenzierung (SHAPE-Seq)11,32,33 versuch. SHAPE-Seq ist ein NGS-Ansatz in Kombination mit der chemischen Sondierung von RNA, der zur Abschätzung der sekundären Struktur von RNA sowie der RNA-Interaktionen mit anderen Molekülen, wie Proteinen, verwendet werden kann. In unserer bisherigen Arbeit führten wir ein SHAPE-Seq-Experiment an einem repräsentativen Stamm sowohl in vivo-Bedingungen34 als auch in vitro mit gereinigtem rekombinantem Protein10,35durch. In unserem Fall zeigten die Ergebnisse, dass DIE RBP-Bindung ein viel breiteres Segment von RNA beeinflusste, als bisher für diese RBPs in vitro36berichtet wurde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde aus dem I-CORE-Programm des Planungs- und Budgetierungsausschusses und der Israel Science Foundation (Grant No. 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675 und aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 664918 - MRG-Grammar.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
ApaLI | NEB | R0507 | |
Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
Eagl-HF | NEB | R3505 | |
Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
Incubator | TECAN | liconic incubator | |
Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
KpnI- HF | NEB | R0142 | |
Ligase | NEB | B0202S | |
Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
Matlab analysis software | Mathworks | ||
Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
Tryptone | BD | 211705 |
References
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