使用 CRISPR/Cas9 在 CAR-T 电池中敲除 GM-CSF
Summary
在这里,我们提出一个协议,通过CRISPR/Cas9系统对CAR-T细胞进行基因编辑。
Abstract
奇美抗原受体T(CAR-T)细胞治疗是癌症的前沿和潜在的革命性新治疗选择。然而,在癌症治疗中广泛使用它存在重大限制。这些限制包括发展独特的毒性,如细胞因子释放综合征 (CRS) 和神经毒性 (NT) 和有限的扩张、 效应器功能和抗肿瘤活性在实体肿瘤.提高CAR-T效能和/或控制CAR-T细胞毒性的一个策略是在CAR-T细胞制造过程中编辑CAR-T细胞本身的基因组。在这里,我们描述了CRISPR/Cas9基因编辑在CAR-T细胞中通过转导与含有引导RNA的慢病毒结构,以颗粒细胞巨噬细胞菌群刺激因子(GM-CSF)和Cas9。例如,我们描述了CRISPR/Cas9对GM-CSF的介导淘汰。已经证明,与野生型CAR-T细胞相比,这些GM-CSFk/o CAR-T细胞在维持关键T细胞功能的同时,有效产生较少的GM-CSF,并增强体内抗肿瘤活性。
Introduction
嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗在癌症治疗中显示出巨大的前景。1,2两种针对CD19(CART19)的CAR-T细胞疗法最近在美国和英国批准用于B细胞恶性肿瘤,在多中心临床试验中取得了显著成果。3,4,5 CAR-T细胞更广泛地使用的障碍是实体肿瘤和相关毒性(包括细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性(NT)中的活性有限。3,5,6,7,8,9为了提高CAR-T细胞治疗的治疗指标,利用锌指核酸酶、TALEN和CRISPR等基因组工程工具进一步修改CAR-T细胞,以产生毒性较低或更有效的CAR-T细胞。10,11
在本文中,我们将介绍一种生成 CRISPR/Cas9 编辑的 CAR-T 单元格的方法。该方法的具体目标是通过CRISPR/Cas9在CAR-T细胞制造过程中对CAR-T细胞进行基因改造,以产生毒性较低或更有效的CAR-T细胞。开发该方法的原理基于从CAR-T细胞治疗的临床经验中吸取的经验教训,这表明迫切需要新的策略来增加CAR-T细胞治疗的治疗窗口,并将应用扩展到其他肿瘤,并支持合成生物学的最新进展,允许CAR-T细胞的多次修改,已经开始进入诊所。当几种基因组工程工具正在开发并应用于不同的环境,如锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR 时,我们的方法描述了 CRISPR/Cas9 对 CAR-T 细胞的修饰。10,11 CRISPR/Cas9 是一种基于RNA的细菌防御机制,旨在消除外来DNA。CRISPR依靠内切酶来切出通过导引RNA(gRNA)识别的目标序列。与其他基因组工程工具的CRISPR编辑CAR-T细胞具有若干优势。其中包括gRNA序列的精确性、针对感兴趣的基因设计gRNA的简单性、高基因编辑效率,以及同时使用多个gRNA系统靶向多个基因的能力。
具体来说,在本文描述的方法中,我们使用一种慢病毒编码CRISPR指南RNA和Cas9在CAR转导T细胞过程中破坏基因。在选择适当的技术来编辑CAR-T细胞时,我们建议这里描述的技术是一种产生研究级CAR-T细胞的有效机制,但由于Cas9永久集成到基因组的长期影响是未知的,我们提出这种方法,以开发概念证明研究级CAR-T细胞,但不用于生产良好的制造实践级CAR-T细胞。
特别是,在这里,我们描述了以人类CD19为目标的粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)敲除CAR-T细胞的产生。这些CAR-T细胞是通过转导与慢病毒颗粒编码的指南RNA特定于GM-CSF(基因名称CSF2)和Cas9产生的。我们之前发现,GM-CSF 中和改善 CRS 和 NT 在异种移植模型中.12个 GM-CSFk/o CAR-T 细胞允许在制造过程中抑制 GM-CSF,有效减少 GM-CSF 的生产,同时提高 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性和在体内的存活率,与野生型 CAR-T 细胞相比。12因此,在这里,我们提供了一个生成 CRISPR/Cas9 编辑的 CAR-T 单元格的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本报告中,我们描述了一种利用CRISPR/Cas9技术诱导CAR-T细胞二次修改的方法。具体来说,这证明使用慢病毒转导与病毒载体,含有gRNA靶向感兴趣的基因和Cas9生成GM-CSFk/o CART19细胞。我们之前已经表明,GM-CSF 中和在异种移植模型中可改善 CRS 和 NT。12如前所述,GM-CSFk/o CAR-T 电池允许在制造过程中抑制 GM-CSF,有效减少 GM-CSF 的生产,同时保持其他关键的 T 细胞功能,并增强体内…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了K12CA090628(SSK)、国家综合癌症网络(SSK)、梅奥个性化医学诊所中心(SSK)、普雷多林基金会(SSK)、梅奥诊所执业翻译办公室(SSK)的资助。梅奥诊所医学科学家培训计划罗伯特·豪厄尔医生-科学家奖学金(RMS)。
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
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