Brug af CRISPR/Cas9 til at udskære GM-CSF i bil-T-celler
Summary
Her præsenterer vi en protokol til genetisk redigering af bil-T-celler via et CRISPR/Cas9 system.
Abstract
Chimeric antigen receptor T (bil-T) celleterapi er en banebrydende og potentielt revolutionerende nye behandlingsmulighed for kræft. Men, der er betydelige begrænsninger for dens udbredte anvendelse i behandlingen af kræft. Disse begrænsninger omfatter udvikling af unikke toksiciteter såsom cytokinfrigivelsessyndrom (CRS) og neurotoksicitet (NT) og begrænset ekspansion, Effector funktioner, og anti-tumor aktivitet i solide tumorer. En strategi til forbedring af bil-T effekt og/eller kontrol toksiciteter af bil-T-celler er at redigere genomet af de bil-T-celler selv under bil-T celle produktion. Her beskriver vi brugen af CRISPR/Cas9 genredigering i bil-T-celler via transduktion med en lentiviral konstruktion, der indeholder en guide RNA til granulocytmakrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og Cas9. Som et eksempel beskriver vi crispr/Cas9 medieret knockout af GM-CSF. Vi har vist, at disse GM-CSFk/o bil-T celler effektivt producerer mindre GM-CSF samtidig bevare kritisk T celle funktion og resultere i øget anti-tumor aktivitet in vivo i forhold til vilde type bil-T-celler.
Introduction
Chimeric antigen receptor T (bil-T) celleterapi udviser store løfter i behandlingen af kræft. 1 , 2 to bil-T celle terapier rettet mod CD19 (CART19) blev for nylig godkendt i Det Forenede erklærede og i Europa for anvendelse i B-celle maligniteter efter at have påvist slående resultater i multicenter kliniske forsøg. 3 , 4 , 5 barrierer for mere udbredt anvendelse af bil-T-celler er begrænset aktivitet i solide tumorer og tilknyttede toksiciteter, herunder cytokinfrigivelsessyndrom (CRS) og neurotoksicitet (NT). 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 for at forbedre det terapeutiske indeks for Car-t-celleterapi anvendes genom-ingeniør værktøjer såsom zink finger-nukleaser, talens og crispr til yderligere at modificere bil-t-celler i et forsøg på at generere mindre giftige eller mere effektive bil-t-celler. 10 , 11
I denne artikel beskriver vi en metode til at generere CRISPR/Cas9 redigerede bil-T-celler. Det specifikke mål med denne metode er at genetisk modificere bil-T-celler under bil-T-celle fremstilling via CRISPR/Cas9 til at generere mindre giftige eller mere effektive bil-T-celler. Begrundelsen for at udvikle denne metode bygger på erfaringerne fra klinisk erfaring med CAR-T-celleterapi, som indikerer et presserende behov for nye strategier for at øge det terapeutiske vindue i CAR-T-celleterapi og for at udvide applikationen til andre tumorer og understøttes af de seneste fremskridt inden for syntetisk biologi tillader flere ændringer af bil-T-celler, der er begyndt at komme ind i klinikken. Mens flere genomingeniør værktøjer udvikles og anvendes i forskellige indstillinger, såsom zink finger nucleaser, TALENs og CRISPR, beskriver vores metodologi CRISPR/Cas9 modifikation af bil-T-celler. 10 , 11 crispr/Cas9 er en RNA-baseret bakteriel forsvarsmekanisme, der er designet til at eliminere udenlandsk DNA. CRISPR er afhængig af endonukleaser for at kløve en målsekvens, der identificeres gennem et guide-RNA (gRNA). Crispr-redigering af bil-T-celler giver flere fordele i forhold til andre genom Engineering værktøjer. Disse omfatter præcision af gRNA sekvens, enkelhed til at designe en gRNA målretning af genet af interesse, høj gen redigering effektivitet, og evnen til at målrette flere gener, da flere gRNAs kan bruges på samme tid.
Specifikt i de metoder, der er beskrevet her, brugte vi en lentivirus encoding CRISPR guide RNA og Cas9 til at forstyrre et gen under BILTRANSDUKTION af T-celler. Ved valg af en passende teknik til at redigere bil-T-celler, foreslår vi den teknik, der er beskrevet her, er en effektiv mekanisme til at generere forskning grade bil-T-celler, men fordi den langsigtede effekt af permanent integration af Cas9 i genomet er ukendt, vi foreslå denne metode til at udvikle bevis for koncept forskning grade bil-T-celler, men ikke for at producere god fremstillingspraksis grade bil-T-celler.
Især her beskriver vi generationen af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) knockout bil-T-celler rettet mod human CD19. Disse bil-T-celler blev genereret ved transduktion med lentiviral partikler, der koder en guide RNA specifik for GM-CSF (gen navn CSF2) og Cas9. Vi har tidligere konstateret, at GM-CSF neutralisering Amelio CRS og NT i en xenograft model. 12 GM-CSFk/o bil-t-celler giver mulighed for hæmning af GM-CSF under fremstillingsprocessen, effektivt at reducere produktionen af GM-CSF samtidig øge bil-t celle anti-tumor aktivitet og overlevelse in vivo sammenlignet med dværg bil-t-celler. 12 således, her giver vi en metodologi til at GENERERE crispr/CAS9 redigeret bil-T-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapport beskriver vi en metode til at udnytte CRISPR/Cas9-teknologien til at inducere sekundære modifikationer i bil-T-celler. Specifikt, dette påvises ved hjælp af lentiviral transduktion med en viral vektor, der indeholder grna rettet mod genet af interesse og Cas9 til at generere GM-CSFk/o CART19 celler. Vi havde tidligere vist, at GM-CSF neutralisering Amelio CRS og NT i en xenograft model. 12 som tidligere beskrevet, GM-CSFk/o bil-T-celler giver mulighed for H…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet gennem tilskud fra K12CA090628 (SSK), national Comprehensive Cancer Network (SSK), Mayo Clinic Center for individualiseret medicin (SSK), Predolin Foundation (SSK), Mayo Clinic Office of Translation til Practice (SSK), og Mayo Clinic Medical Scientist Trænings program Robert L. Howell læge-videnskabsmand Scholarship (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
- Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
- Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
