Summary

שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

Published: July 22, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לערוך גנטית לרכב-T תאים דרך CRISPR/Cas9 מערכת.

Abstract

צ ‘ ושמעון אנטיגן לקולטן T (רכב-T) הטיפול בתאים הוא קצה חיתוך ואפשרות הטיפול המהפכני החדש של סרטן. עם זאת, ישנן מגבלות משמעותיות לשימוש נרחב בטיפול בסרטן. מגבלות אלה כוללות פיתוח של רעלים ייחודיים כגון תסמונת השחרור ציטוקינים (CRS) ו רעילות נוירו (NT) והרחבה מוגבלת, פונקציות אפקטור, ופעילות נגד הגידול בגידולים מוצקים. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את היעילות רכב-T ו/או בקרת רעלים של תאי רכב-T היא לערוך את הגנום של התאים רכב-T עצמם במהלך ייצור תא רכב T. כאן, אנו מתארים את השימוש CRISPR/Cas9 gene העריכה בתאי רכב-T באמצעות התמרה עם בניית לנטינגיזציה המכילה RNA מדריך כדי גרנולוציט מקרופאג המושבה מגרה גורם (GM-שדרתי) ו Cas9. כדוגמה, אנו מתארים CRISPR/Cas9 בתיווך מתווכת של GM-שדרתי. הראינו כי אלה מוטורס-מכוניות מסוגk/o מכונית T לייצר ביעילות gm-שדרתי פחות, תוך שמירה על פונקציית התאים הקריטיים t ותוצאה של פעילות אנטי סרטניים משופרת vivo לעומת מסוג פראי רכב-T תאים.

Introduction

שצ קולטן אנטיגן T (רכב-T) טיפול תא מציג הבטחה גדולה לטיפול בסרטן. מיכל בן , 2 שתי מכונית-T טיפולים תא המיקוד CD19 (CART19) אושרו לאחרונה בארצות הברית הצהיר ובאירופה לשימוש B ממאירות תא לאחר הוכחת תוצאות מדהימות ב מולטיב להיכנס ניסויים קליניים. מיכל שלוש , ד , 5 מחסומים לשימוש נרחב יותר של מכונית-T תאים הם פעילות מוגבלת של גידולים מוצקים ורעלים משויכים כולל תסמונת השחרור ציטוקינים (CRS) ו רעילות נוירו (NT). מיכל שלוש , מיכל 5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9 כדי לשפר את המדד התרפויטי של מכונית-t טיפול בתאים, הנדסת הגנום כלים כגון נוקלאוסים אצבע אבץ, talens, ו CRISPR מועסקים לשנות עוד יותר תאים מכונית-t בניסיון לייצר פחות רעיל או יעיל יותר מכונית-t תאים. מיכל עשור , מיכל בן 11

במאמר זה, אנו מתארים שיטה כדי ליצור CRISPR/Cas9 לערוך תאים רכב-T. המטרה הספציפית של שיטה זו היא לשנות גנטית בתאי רכב-T במהלך ייצור תא רכב-T באמצעות CRISPR/Cas9 כדי ליצור פחות רעיל או יעיל יותר מכונית-T תאים. הרציונל לפיתוח מתודולוגיה זו בנויה על הלקחים שנלמדו מניסיון קליני של הטיפול בתאי רכב T, אשר מצביע על צורך דחוף אסטרטגיות הרומן כדי להגביר את החלון הטיפולי של המכונית-T טיפול בתאי ולהרחיב את היישום לתוך גידולים אחרים נתמך על ידי ההתקדמות האחרונה בביולוגיה סינתטי המאפשר שינויים מרובים של תאים רכב-T שהתחילו להיכנס למרפאה. בעוד כמה כלים הנדסת הגנום מפותחים ומיושמים בהגדרות שונות, כגון נוקלאוסים אצבע אבץ, TALENs, ו CRISPR, המתודולוגיה שלנו מתארת CRISPR/Cas9 שינוי של תאים מכונית-T. מיכל עשור , 11 crispr/Cas9 הוא מנגנון RNA מבוססי הגנה בקטריאלי אשר נועד לחסל DNA זר. CRISPR מסתמך על האנונוקיטיות כדי לדבוק רצף היעד מזוהה דרך RNA מדריך (gRNA). העריכה CRISPR של התאים רכב-T מציע מספר יתרונות על פני כלים אחרים הנדסת הגנום. אלה כוללים דיוק של רצף gRNA, פשטות לעצב gRNA מיקוד את הגן של עניין, גבוה לעריכת היעילות של הגן, ואת היכולת למקד גנים מרובים מאז Grna מרובים ניתן להשתמש באותו זמן.

באופן ספציפי בשיטות המתוארות כאן, השתמשנו בקידוד מדריך CRISPR לקודד וירוס RNA ו Cas9 לשבש גן במהלך התמרה מכונית של תאי T. בבחירת הטכניקה המתאימה כדי לערוך מכונית T תאים, אנו מציעים את הטכניקה המתוארת כאן הוא מנגנון יעיל כדי ליצור מחקר כיתה תא רכב T, אבל בגלל ההשפעה לטווח ארוך של שילוב קבוע של Cas9 לתוך הגנום אינו ידוע, אנו להציע מתודולוגיה זו כדי לפתח הוכחה של מחקר המושג תאים-T בכיתה רכב, אבל לא להפקת טוב בפועל ייצור תאים מכונית-T.

בפרט, כאן אנו מתארים את הדור של גרנולוציט מקרופאג המושבה גורם מגרה (GM-שדרתי) הסתרה מכונית T תאים מיקוד האדם CD19. אלה תאי רכב-T נוצרו על ידי התמרה עם חלקיקים לקידוד מדריך RNA ספציפי GM-שדרתי (שם גן CSF2) ו Cas9. בעבר מצאנו כי הניטרול של GM-שדרתי הCRS קילה ו-NT במודל מבע. 12 GM-שדרתי מכוניותk/o -T תאים לאפשר עיכוב של gm-שדרתי במהלך תהליך הייצור, ביעילות להפחית את הייצור של gm-שדרתי תוך שיפור הרכב-T תא אנטי גידול פעילות והישרדות vivo לעומת ווילטיפ רכב-t תאים. 12 לכן, כאן אנו מספקים מתודולוגיה כדי ליצור CRISPR/CAS9 לרכב תאים T.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של הלוח המוסדי של מרפאת מאיו (IRB) והועדה הביובטיטיתית המוסדית (IBC). 1. הפקת תא CART19 בידוד תא T, גירוי ותרבות vivo לשעבר לבצע את כל התרבות תאים העבודה במכסה של תרבות התא ניצול ציוד הגנה אישית מתאים. בציר דם היקפי בתאי מוננובית (PBMCs) מתוך מזוהה התא?…

Representative Results

איור 1 מראה הפחתה של gm-שדרתי ב gm-שדרתי CART19 תאיםk/o . כדי לוודא כי הגנום של התאים T שונתה לנוקאאוט GM-שדרתי, רצף הגאות שימש בתאי GM/o CART19 (איור 1a). רכב-T תא המשטח הצביעת מוודאת כי התאים T לבטא בהצלחה את קולטן פני השטח של המכונית בחוץ גופית ע…

Discussion

בדו ח זה, אנו מתארים מתודולוגיה לניצול CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה כדי לגרום שינויים משניים בתאי רכב-T. באופן ספציפי, זה מוצג באמצעות התמרה ויראלית עם וקטור ויראלי המכיל gRNA מיקוד הגן של עניין Cas9 לייצר GM-שדרתי התאיםk/o CART19. הצגנו בעבר כי הניטרול של GM-שדרתי נטרול קילה CRS ו-NT במודל מבע. 12 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו היתה נתמכת באמצעות מענקים מ K12CA090628 (SSK), הלאומי סרטן מקיף ברשת (SSK), מרכז הקליניקה של מאיו עבור הרפואה האישית (SSK), קרן Predolin (SSK), משרד מרפאת מאיו של תרגום לתרגול (SSK), ו התוכנית מדען רפואי מאיו מרפאת הדרכה רוברט ל. האוול מלגה מדען (RMS).

Materials

CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience Invitrogen 17-0038-42
Choice Taq Blue Mastermix Denville Scientific C775Y51
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit  STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
FITC Mouse Anti-Human CD107a  BD Pharmingen 555800
Fixation Medium (Medium A) Invitrogen GAS001S100
GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2
CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector:
pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number:
High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free
of charge)
GenScript N/A custom order
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
https://tide.nki.nl. Desktop Genetics
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience Invitrogen 47-7319-42
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Monensin Solution, 1000X BioLegend 420701
Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 BD Pharmingen 559770
Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 BD Pharmingen 561892
Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 BD Pharmingen 560687
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Scientific 5100-0001
NALM6, clone G5  ATCC CRL-3273 acute lymphoblastic leukemia cell line
Nuclease Free Water Promega P119C
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile Genesee Scientific 25-227
Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile Genesee Scientific 25-228
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid Gibco 31985-070
PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 BD Horizon 562384
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid Gibco 10378-016
Permeabilization Medium (Medium B) Invitrogen GAS002S100
PureLink Genomic DNA Mini Kit Invitrogen K182001
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
Rat Anti-Human GM-CSF BV421 BD Horizon 562930
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

References

  1. Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
  2. Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  5. Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
  6. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  7. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
  8. Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  9. Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
  10. Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
  11. Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
  12. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
  13. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  14. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
  15. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).

Play Video

Cite This Article
Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells. J. Vis. Exp. (149), e59629, doi:10.3791/59629 (2019).

View Video