Summary

En semi-kvantitativ Läkemedelstillhörighet lyhörd mål stabilitet (Dart) test för att studera rapamycin/mTOR interaktion

Published: August 27, 2019
doi:

Summary

I denna studie, vi förbättrat dataanalys kapacitet Dart experiment genom att övervaka förändringar i protein stabilitet och uppskatta affiniteten av protein-ligand interaktioner. Interaktionerna kan plottas i två kurvor: en proteolytisk kurva och en dosberoende kurva. Vi har använt mTOR-rapamycin interaktion som ett exemplariskt fall.

Abstract

Responsiv mål stabilitet för läkemedels tillhörighet (Dart) är en robust metod för detektion av nya mål för små molekyl proteiner. Det kan användas för att kontrollera kända små molekyl-proteininteraktioner och för att hitta potentiella protein mål för naturliga produkter. Jämfört med andra metoder, Dart använder infödda, oförändrade, små molekyler och är enkel och lätt att använda. I denna studie, vi ytterligare förbättrat dataanalys kapacitet Dart experiment genom att övervaka förändringar i protein stabilitet och uppskatta affiniteten av protein-ligand interaktioner. Proteinet-ligand interaktioner kan plottas i två kurvor: en proteolytisk kurva och en dos-beroende kurva. Vi har använt mTOR-rapamycin interaktion som ett exemplariskt fall för inrättandet av vårt protokoll. Från proteolytiska kurvan såg vi att proteolys av mTOR av pronase hämmade av närvaron av rapamycin. Dosberoende kurvan tillät oss att uppskatta bindaffinitet för rapamycin och mTOR. Denna metod kommer sannolikt att vara en kraftfull och enkel metod för att korrekt identifiera nya målproteiner och för optimering av drogen mål engagemang.

Introduction

Identifiera små molekyl målproteiner är avgörande för den mekanistiska förståelsen och utvecklingen av potentiella terapeutiska läkemedel1,2,3. Affinitetskromatografi, som en klassisk metod för att identifiera målproteiner hos små molekyler, har gett goda resultat4,5. Emellertid, denna metod har begränsningar, i att kemisk modifiering av små molekyler resulterar ofta i minskad eller förändrad bindande specificitet eller affinitet. För att övervinna dessa begränsningar har flera nya strategier nyligen utvecklats och tillämpats för att identifiera de små molekyl målen utan kemisk modifiering av de små molekylerna. Dessa direkta metoder för mål identifiering av etikettfria små molekyler inkluderar läkemedels tillhörighet lyhörd mål stabilitet (Dart)6, stabilitet av proteiner från satser av oxidation (sprox)7, cellulära termisk Skift analys (cetsa)8 ,9, och termisk proteomet profilering (TPP)10. Dessa metoder är mycket fördelaktiga eftersom de använder naturliga, oförändrade små molekyler och förlitar sig endast på direkta bindande interaktioner för att hitta målproteiner11.

Bland dessa nya metoder, Dart är en jämförelsevis enkel metod som lätt kan antas av de flesta Labs12,13. Dart beror på konceptet att ligand-bundna proteiner uppvisar modifierad känslighet för enzymatisk nedbrytning i förhållande till obundna proteiner. Det nya målproteinet kan upptäckas genom undersökning av det förändrade bandet i SDS-PAGE gel genom vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS/MS). Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt genomförts för identifiering av tidigare okända mål för naturprodukter och läkemedel14,15,16,17,18, 19. det är också kraftfullt som ett sätt att avskärma eller validera bindning av föreningar till ett specifikt protein20,21. I denna studie, presenterar vi en förbättring av experimentet genom att övervaka förändringar i protein stabilitet med små molekyler och identifiera protein-ligand bindande affiniteter. Vi använder mTOR-rapamycin interaktion som ett exempel för att demonstrera vårt förhållningssätt.

Protocol

1. samla och lyse celler Grow 293T celler med Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) med 10% foster bovint serum, 2 mM glutamin och 1% antibiotika. Inkubera kulturer vid 37 ° c under 5% CO2.Observera: tillväxt tillståndet för cellerna kan påverka stabiliteten hos efterföljande experiment. Expandera celler i kulturen tills du når 80 \ u201290% Confluence. Blanda 345 μL av celllysreagens (se tabellen med material) med 25 μl cocktail av 20x proteashäm…

Representative Results

Flödesschema för experimentet beskrivs i figur 1. Resultatet av Coomassie Blåfärgning visas i figur 2. Inkubering med den lilla molekylen ger skydd mot proteolys. Tre band som verkar skyddas av inkubering med rapamycin över fordonskontroll hittas. De förväntade resultaten från experiment med proteolytiska kurvor visas i figur 3. Som ett proof-of-princip, undersökte vi väl studerade protein mTOR, som är målet för drogen …

Discussion

Dart möjliggör identifiering av små molekyl mål genom att utnyttja den skyddande effekten av proteinbindning mot nedbrytning. Dart kräver inte någon kemisk modifiering eller immobilisering av den lilla molekylen26. Detta gör att små molekyler kan användas för att bestämma deras direkta bindande proteinmål. Standard bedömningskriterier för den klassiska Dart-metoden inkluderar gel färgning, masspektrometri och Western blotting12,13…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes delvis av NIH forskningsanslag R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, och ett DOD forskningsbidrag W81XWH-16-1-0482.

Materials

100X Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line ATCC CRL-3216 DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher 23225
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Cell scraper Thermo Fisher 179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution Bio-Rad 1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma-Aldrich D2650
GraphPad Prism GraphPad Software Version 6.0 statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52 image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent Thermo Fisher 78501
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning R21-040-CV
Pronase Roche PRON-RO 10 mg/ml
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium fluoride Sigma-Aldrich S7920
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich 450243
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich 221368
Trizma base Sigma-Aldrich T1503 adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422

References

  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhang, C., Cui, M., Cui, Y., Hettinghouse, A., Liu, C. A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction. J. Vis. Exp. (150), e59656, doi:10.3791/59656 (2019).

View Video