שיטת אנזימטית אפקטיבית לבידוד של תאי האבי-העורקים הראשוניים של החזיר (pAECs) מחזירים זעירים מתוארים. PAECs העיקרי מבודד ניתן להשתמש כדי לחקור את התגובה החיסונית קרישה ב xenotransplantation שתלת.
Xenotransplantation היא דרך מבטיחה לפתור את המחסור של איברי האדם עבור חולים עם כשל איבר בשלב הסופי, והחזיר נחשב מקור איבר מתאים. דחייה וקרישה החיסונית הם שני מכשולים עיקריים להצלחת השתלת xenotransplantation הפציעה והתפקוד הגופני של כלי הדם (EC) הם חשובים לפיתוח התגובה לדלקות וקרישת דם ב-xenotransplantation שתלת. כך, בידוד של התאים החיוניים של האבי העורקים (pAECs) יש צורך לחקור את הדחייה החיסונית ואת התגובות קרישת דם. כאן פיתחנו גישה אנזימטית פשוטה לבידוד, אפיון והתרחבות של pAECs מטוהרים מאוד מחזירים זעירים. , החזיר הזעיר הרדימים עם קטמין. ואורך של העורקים היה מגורש שנית, משטח האנדותל של העורקים נחשף 0.005% הפתרון העיכול IV הרביעי עבור 15 דקות. השלישי, משטח האנדותל של העורקים היה מגורד בכיוון אחד בלבד עם מגרד תא (< 10 פעמים), ולא נדחס במהלך התהליך של גירוד. בסופו של דבר, pAECs מבודדים של היום 3, ואחרי מעבר 1 ומעבר 2, זוהו על ידי cy, הזרמת לנסות עם נוגדן anti-CD31. האחוזים של תאים CD31-חיוביים היו 97.4% ± 1.2%, 94.4% ± 1.1%, ו 92.4% ± 1.7% (ממוצע ± SD), בהתאמה. הריכוז של קולגן הרביעי, זמן העיכול, את הכיוון, ואת התדר ואת העוצמה של גירוד הם קריטיים להפחתת זיהום בפיברובלסט וקבלת טוהר גבוהה ומספר רב של ECs. לסיכום, השיטה האנזימטית שלנו היא שיטה מeffctive ביותר לבידוד ECs מן העורקים חזיר מיניאטורי, ואת התאים ניתן להרחיב בתוך מבחנה כדי לחקור את התגובות החיסונית קרישה ב xenotransplantation שתלת.
המחסור של איברים זמינים עבור השתלת הוא בעיה מצטיינים ברחבי העולם1. על פי החברה הצולבת האדומה של סין, רק מספר קטן של חולים עם כשל איברים בשלב הסיום קיבל איבר מתאים בסין בשנת 2018.
Xenotransplantation היא דרך מבטיחה לפתור את הבעיה של מחסור באיברים. איברי חזיר נחשבים לאיברים המתאימים ביותר עבור בני אדם בגלל דמיון אנטומי ופיזיולוגי2,3. הכישלון של שהשתיל חזיר מבע ברובו לדחיית החיסון הקופים התגובות קרישת דם. תאים של porcine אנדותל (ecs) הם קריטיים מאז תאים אלה הם הראשונים אינטראקציה עם המערכת החיסונית של הפרימטים, הכוללת נוגדן, משלים, ציטוקינים, ותאים חיסוניים (למשל, T תאים, B תאים, מקרופאגים)4,5. המשחק ecs לשחק תפקיד חיוני באורגן חזיר ו השתלת איון xenotransplantation,7. כך, ECs הם תאים חשובים לחקירת דחייה והתגובות קרישת הדם שתל חזיר. בידוד של ECs באיכות גבוהה נדרש עבור מחקר xenotransplantation שתלת.
בניסיונות לבודד ecs מאיברים שונים (למשל, לב, כליות, כבד, העורקים), כמה פרוטוקולים דווחו בהגדרה xenotransplant שתלה8,9,10,11,12. עם זאת, שמירה על תרבות אולטרה-סאונד של ECs מבודדת היא בעיה יוצאת דופן בפרוטוקולים הסטנדרטיים. הריכוז המוגבר של הפתרון המתעכל, זמן העיכול הבלתי מתאים ועוצמת הגרד עשויה לתרום לזיהום פיברובסט מוגבר במחקרים הנוכחיים8,10,13. חוץ מזה, השיטה של pAECs מבודדים מחזירים זעירים הוא פחות לומד. כאן, אנו מתארים שיטה אנזימטית אופטימיזציה כדי לבודד pAECs מטוהרים מאוד מפני חזירים זעירים (וודז’שאן או במה). כמה צעדים בפרוטוקול נועדו להפחית את זיהום הפיברובלסט ולהשיג ECs טוהר גבוהה.
תאי האנדותל משמשים בדרך כלל במחקר של תפקוד כלי דם, סוכרת, התחדשות רקמות, השתלת, סרטן14,15,16,17,18. כדי להבין ולאפיין את הביולוגיה ואת התפקוד של ecs במחלות אלה, שיטות רבות כדי לבודד ecs של איברים חולים שונים או ר…
The authors have nothing to disclose.
העבודה נתמכת על ידי מענקים מקרן המדע הטבעי של מחוז גואנג-דונג, גרנט/מספר הפרס: 2016A030313028; הקרן המדעית למחקר רפואי של פרובינציית גואנג-דונג, גרנט/מספר הפרס: B2018003; קרן שנזן למדע וטכנולוגיה, מספר גרנט/פרס: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 וJCYJ20160428142040945; הקרן למדע וטכנולוגיה של שנג לונחואה, הענקת מספר פרס: 2017013; מפתח לאומי R & D תוכנית של סין, גרנט/מספר הפרס: 2017YFC1103704; פרויקט sanming של הרפואה שנזן, גרנט/מספר הפרס: SZSM201412020; קרנות מיוחדות להקמת בתי חולים ברמה גבוהה בפרובינצית גואנג-דונג (2019); קרן ברמה גבוהה משמעת רפואית בנייה של שנג, גרנט/מספר הפרס: 2016031638; קרן שנזן בריאות ותכנון משפחה הנציבות, גרנט/מספר הפרס: SZXJ2017021 ו SZXJ2018059. אנו מודים לחננג ג’אנג ולדז’נג זיאו מאוניברסיטת שנזן לסיוע בהכנת כתב היד.
BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
Cell scraper | Corning | 3010# | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride:0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride:1mg/2ml | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
ECM | Sciencell | 1001# | |
ECGS | Sciencell | 1052# | |
Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
Flowjo v10.0 | |||
Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap (T25) | Corning | 3289# | |
Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
Syringe(5mL) | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |